Name: ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ臨床等級の分離法で人腎臓血管周囲間質細胞を単離培養する技術。NG2陽性細胞の磁気分離と傷治癒アッセイにより、再生医療と腎疾患治療の細胞治療法開発に応用可能です。

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この研究資金を受けている欧州共同体の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) から付与契約番号 305436 の下恒星。

欧州コンソーシアム(STELLAR)の地元の医療倫理委員会と倫理諮問委員会は、主に外科的理由で廃棄されたヒト移植グレードの腎臓の研究と収集を承認しました。すべての腎臓について研究同意が得られました。
1. 細胞培養の準備
<ol>
	<li>血小板溶解物のプールを準備します。
	<ol>
		<li>有効期限が切れた血小板は、使用まで-80°Cで保存します（最大1年間） 
		注:血小板はもともと商業ベンダーから供給されました。地元の血液銀行から配布された病院の余剰物資が入手されました。</li>
		<li>少なくとも5人のドナー(できれば10人)の血小板を4°Cで解凍します。</li>
		<li>血小板を大きな滅菌ボトルにプールし、円錐形の遠心分離チューブに移し、1,960 x g、4°C. で10分間スピンダウンします。
		注:血小板の量は、ドナーの数とドナーあたりの病院の余剰材料の量によって異なります。</li>
		<li>上清を50mLシリンジのバレルを通して血液バッグ(50 mL /袋)にピペットで移します。.-80°Cで保存してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>細胞培養培地の調製。
	<ol>
		<li>1袋の血小板溶解物を37°Cの水浴で解凍します。</li>
		<li>1 L(つまり、2 本)のMinimum Essential Medium - α modification(alphaMEM)、5 mL 200 mM グルタミン、および 20 mL のペニシリン (5,000 U/mL)/ストレプトマイシン (5,000 μg/mL) (ペン/連鎖球菌) をバッグに加えます。</li>
		<li>37°Cで3時間インキュベートします。</li>
		<li>バッグが平らな面に置かれているときにバッグを軽くたたいて、脱ゲル化のためにバッグを振ってください。</li>
		<li>滅菌済みの50 mLシリンジで輸血システムのフィルターを通してライセートを引っ張ることにより、5%血小板ライセート培地をろ過します。.</li>
		<li>培地を50mLチューブに分注し、使用するまで-80°Cで保存します 
		注:血小板溶解物のすべての新しいバッチは、細胞培養で試験され、目的の細胞(bmMSCまたはkPSC)を成長させて両方のバッチでコンフルエンシーになることにより、前のバッチと比較されます。細胞数と生存率において、新しいバッチで増殖したkPSCまたはbmMCの差は10%を超えず、フローサイトメトリーで分析したCD73、CD90、CD105およびCD31、CD34、CD45のマーカー発現に差はありません。細胞培養の方法は、プロトコール(kPSCの培養)のセクション6に記載されています。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. セルハーベストの準備
<ol>
	<li>ソリューションの準備。
	<ol>
		<li>10 mLのペン/連鎖球菌を500 mL(1ボトル)のダルベッコの最小必須培地(DMEM)-F12に加えて、プレーン培地を準備します。</li>
		<li>50 mLの正常ヒト血清(NHS)と10 mLのペン/連鎖球菌をDMEM-F12のボトル1本に加えて、洗浄培地を準備します。.</li>
		<li>ウィスコンシン大学の160 mL溶液に、2.9 mL 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v]、および160 μL CaCl2(1 M)を添加して、酵素ストックバッファーを調製します。</li>
		<li>コラゲナーゼ溶液を調製するには、>2,000 U/ボトルのコラゲナーゼを含むGMPグレードのコラゲナーゼのボトルに20 mLの酵素ストックバッファーをゆっくりと加えます。4°Cで約40分間溶解します。溶解期間中に数回静かに振ってください。</li>
		<li>5 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)を45 mLのNHSに加えて、凍結培地を調製します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌流トレイ(図1A)の調製
	<ol>
		<li>フローキャビンを清掃し、外科用ドレープで覆います。ウォーターバスを約40〜45°Cに加熱して、灌流トレイを37°Cに加熱します。</li>
		<li>滅菌した灌流トレイをウォーターバスに接続して、灌流トレイを温水で予熱します。灌流トレイを垂直位置にして、灌流トレイに空気がないことを確認します。必要に応じて、灌流トレイへの空気の注入を防ぐために、ウォーターバスに水を追加します。</li>
		<li>LS25チューブをポンプに入れます。チューブの滅菌両端をフローキャビネットに残します。コッヘル鉗子をチューブの一方の端に置き、灌流トレイの底に置きます。チューブの上部に滅菌ガーゼを敷き、閉塞を防ぎます。もう一方のチューブ端にルアーコネクタを取り付けます。</li>
		<li>約100 mLのプレーンメディウムを灌流トレイに加え、100 mL/minのポンプ速度でチューブのフラッシングを開始します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腎臓細胞の単離
<ol>
	<li>腎臓の準備。
	<ol>
		<li>二重滅菌バッグから腎臓を取り出し、滅菌灌流トレイ(図1B)に置きます。ハサミで腎周囲脂肪組織と腎臓嚢を取り出し、軽く引き裂きます(図1C)し、図1 Dに示すように、大動脈パッチ上の腎動脈を特定します。</li>
		<li>アクセサリースパイクで腎動脈をカニューレ状にし、滅菌したタイリップで固定し、ポンプがオンの状態でルアーコネクタでポンプチューブの端に取り付けます。チューブが完全に満たされていない場合は、まずポンプを始動してトレイとフラッシュチューブに媒体を追加します（図1E - F)。ポンプを介して100 mL / minの流量で腎臓をプレーン培地で洗い流します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>コラゲナーゼ治療と腎臓細胞の単離。
	<ol>
		<li>コラゲナーゼ(20 mL、>2,000 U)およびDNase(2.5 mL、1 mg/mL)を灌流トレイ(図1G)に加えます。時々手で腎臓を優しく回します。腎臓が柔らかくなり、灌流液の透明度が低下するまで待ちます(約30〜40分)。</li>
		<li>細胞懸濁液が得られるまで、腎臓を優しくマッサージします(図1H)図1I)。未消化の物質と腎動脈のスパイクを取り除きます。.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腎臓細胞の洗浄と収集。
	<ol>
		<li>細胞懸濁液にNHS50 mLを加えます。ポンプを低流量にし、最初に腎臓に接続されたチューブを50 mLチューブの上に置くことにより、灌流トレイから細胞懸濁液を排出します(図1J)。</li>
		<li>300 x gで4°Cで7分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10%NHSを含む洗浄培地で洗浄し、再度300 x gで7分間遠心分離します。もう一度洗濯を繰り返してください。細胞ペレットの容量を測定し、等量の細胞培養培地を添加します。</li>
		<li>ここから凍結培地を細胞懸濁液に1:1で加えて細胞を凍結保存し、標準プロトコルに従って極低温バイアルに保存するか、細胞の培養を続けるか(セクション4). 
		注:細胞懸濁液には細胞塊が含まれており、単一細胞を得るために追加の手順が必要であり、その結果、細胞死が増加します。したがって、細胞は懸濁状態に保たれ、この段階ではカウントされません。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 粗腎臓細胞の細胞培養
<ol>
	<li>T175細胞培養フラスコ(図1 K)中の24 mLのalphaMEM 5%血小板溶解物(細胞培養培地)に約1 mLの細胞懸濁液を加え、37°C、5%CO2で培養します。接着細胞から2日後に培地と細胞破片を取り除き、25 mLの細胞培養培地で培地をリフレッシュします。</li>
	<li>培地の半分(12.5 mL)を取り出し、無菌技術を使用して新しい培地(12.5 mL)を追加して、週に2回培地をリフレッシュします。</li>
	<li>コンフルエントになるまで培養します(通常は5〜7 d)(図1L)。培地を取り出し、PBSで2回洗浄し、各T175フラスコに5mLのトリプシンを37°Cで5分間加えて細胞をトリプシン化します。</li>
</ol>
5. 磁気細胞分離によるNG2の細胞濃縮 (図1M)
<ol>
	<li>細胞分離バッファーは、メーカーのプロトコルに従って調製してください。</li>
	<li>トリプシン処理したkPSCを10 mLの細胞分離バッファーに再懸濁します。490 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を300 μLの細胞分離バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>100 μL FcR ブロッキング reagen/5 x 107 細胞を添加し、5 x 107 細胞あたり 100 μL 抗黒色腫 (NG2) ビーズを添加し、4 °C で 30 分間インキュベートします。10 mLの培地細胞と遠心分離細胞を490 x gで5分間加えます。</li>
	<li>Bürkerの計数チャンバーを使用して、メーカーのプロトコルに従って細胞をカウントします。培養フラスコ(約4 x 103細胞/cm2)で細胞を播種し、インキュベートします><。
	注:T25フラスコに<250,000、T75フラスコに250,000〜500,000、T175フラスコに700,000〜800,000の濃度で細胞を播種します。磁気セル濃縮後、約1〜2%の正の画分が単離されます。しかし、このステップは細胞の濃縮であり、細胞の選別ではないため、他の細胞タイプが培養物に存在します(図1N)。数回の継代後(通常は約4〜5)、均質なkPSC集団のみが存在します(図1P)。</li>
</ol>
6. kPSCの文化
<ol>
	<li>培地の半分を取り出し、解凍したばかりの培地(図1N)と交換して、週に2回培地をリフレッシュします。<br />
	注:kPSCは、培地の半分のみがリフレッシュされると、より生存率が高く、増殖する傾向があります。</li>
	<li>kPSCs. の継代
	注:90〜100%のコンフルエント度で、または3D構造が現れたとき(図1Oを参照)、または細胞増殖が1週間以上なかったときに、kPSCを通過させてください。後者の2つは、特に細胞濃縮後の初期の継代で発生する可能性があります。この場合、継代後、細胞は通常、単層培養で再び増殖し始めます(図1P)。
	<ol>
		<li>90 - 100% コンフルエントな細胞から培地を取り出します (培地は後で使用するために保管しておいてください)。フラスコをPBSで2回洗浄します(T25で1 mL、T75で5 mL、T175で10 mL)。トリプシン(T25に0.5 mL、T75に2 mL、T175に5 mL)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。古い培地をフラスコに加え、穏やかに再懸濁します。</li>
		<li>15 mLまたは50 mLのチューブに移し(容量によって異なります)、490 x gで5分間遠心分離します。生細胞とプレートを数えます<T25で250,000、T75で250,000〜500,000、またはT175で700,000〜800,000(約4 x 103細胞/cm2)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5番または6番のkPSCを試験します(例:スクラッチアッセイ、セクション7). 
	注:標準プロトコルを使用して、フローサイトメトリーによって増殖した細胞を特徴付けます。NG2、PDGFR-β、CD146、CD73、CD90、CD105、HLA-ABCのマーカー発現はすべて陽性で、CD31、CD34、CD45、HLA-DRのマーカー発現は陰性であるべきです。臨床微生物学研究室の標準プロトコルに従って、培地中のマイコプラズマ、細菌、真菌を試験します。腎臓上皮創傷スクラッチアッセイでkPSCを機能的にテストします。実験は通常、フローサイトメトリーで確認された無菌の均質なkPSC集団を用いて行われ、継代6〜8の間に創傷治癒能があります。</li>
	<li>0.5 mLの凍結保存培地を0.5 mLの細胞懸濁液(培地1 mLあたり200万細胞)に標準プロトコルを用いて添加し、kPSCを凍結保存します。 
	注:解凍後、kPSCを高密度(T175に10 6細胞)で播種します。</li>
</ol>
7. kPSCの機能試験:腎臓上皮創傷スクラッチアッセイ
<ol>
	<li>6ウェルプレートでkPSCを200,000細胞/ウェルの密度で2mLの培地で培養します。37°C、5%CO2で48時間培養した後、上清を回収します。これがコンディショニングされた媒体です。</li>
	<li>HK-2(近位尿細管上皮細胞)17を、インスリン(5 mg / mL)、トランスフェリン(5 mg / mL)、セレン(5 ng / mL)、ヒドロコルチゾン(36 ng / mL)、トリヨードチリン(40 pg / mL)、上皮成長因子(10 ng / mL)およびPEN / Strepを補充したDMEM-F12の1:1の比率からなる近位尿細管上皮細胞(PTEC)培地2 mLに播種します。 ウェルあたり500,000細胞の密度で、6ウェル細胞培養プレートに入れます。</li>
	<li>37°C、5%CO2で48時間培養します。HK-2sの細胞培養液を取り出し、ウェルの上から下に向かって黄色いピペットポイントの先端でスクラッチを作ることで、HK-2sの単層にスクラッチ創を作成します。HK-2sをPBSで洗浄し、kPSCまたはコントロール培地のコンディショニング培地を添加します。プレートの底面に画像化する領域をマークします. 
	注:HK-2はコンフルエントである必要があります。ウェルごとに 2 つの領域をイメージします。</li>
	<li>4時間、8時間、12時間、24時間の位置で、倒立明視野顕微鏡で同じマーク位置のスクラッチを画像化します。</li>
	<li>ポリゴン選択ツールを使用して画像Jのスクラッチ領域を測定し、閉合率を決定します。</li>
</ol>

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</ol>

機械知能系、D.G.L.、T.J.R. は、この研究に関する特許出願に関連付けられます。他の作家が何を開示するあります。

血管周囲細胞は多くの異なった人間固体器官、膵臓、脂肪、軟骨、腎臓9,,1516などから分離されています。ただし、ほとんどのメソッドは、組織を切除し、その後消化酵素で処理の小さなサンプルに基づいています。また、これは通常行われません臨床グレード製品。これにより、臨床グレード細胞の大量が必要これらの戦略を直接臨床翻訳には適して。
ここで臨床グレード酵素および物質による血液灌流に基づく全臓器の人間 kPSCs の新規分離法を示す.プロトコルは、現在臨床応用センター18使用中臨床ランゲルハンス島の隔離のプロトコルから適応。
これは、大量の kPSCs を実現できます最初の臨床グレード方法です。細胞収率の変動は主としてドナー依存です。しかし、我々 は現在 3 つの異なるドナー原油細胞懸濁液の一部から得る細胞収量を推定すると、理論的には、ドナーごと 1012 kPSCs x 2.7 の平均利回りが達成できます。MSC 療法は、通常、1 - 2 × 106セル/kg 本体重量42 細胞注入で構成されますとこれらの細胞の数はいくつかの患者の同種の治療のため十分です。
分離のプロシージャの 1 つの重要なステップは、コラゲナーゼの消化力の期間です。消化期間が短すぎると、文化が困難となる、組織の大きな塊保たれます。潅流期間が長すぎると、細胞死が増加を観察することがあります。したがって、腎臓ソフトになり、流体透過性が低下し始めると、すぐに腎臓を優しくマッサージする必要があります、コラゲナーゼ処理を停止する必要があります。
別の重要なステップは、NG2 細胞濃縮後、細胞の培養です。NG2 細胞濃縮後時々 血管周囲細胞は増殖や立体構造で成長を開始する開始されません。この場合ときに、細胞がトリプシンおよび再シード、細胞が単層培養による成長を開始通常。
出発材料として人間の移植グレード腎臓手術の理由主に破棄されたが使用されました。これらの主要な線維化なし機能器官です。我々 は、これは比較的まれな制限をする可能性がありますこれを認めるとオルガンのソースを取得するは難しい。Explanted 腎臓可能性があります別のソース;しかし、腎植の理由に応じてより多くの線維化およびこうして芽、これらの腎臓があります、したがってケアしなければならないので芽を分離、培養血管細胞ではなく可能性があります。
KPSCs が分離されたこのプロトコルを見ると腎臓上皮とオルガノ typic プロパティ創傷治癒能力15、腎臓疾患における kPSCs を用いた細胞治療、移植は今後の興味深いアプリケーションになります。このため、セル/セル製品出荷のいくつかの戦略があります。BmMSC の臨床試験で現在使われている、最初の戦略は、kPSCs の点滴です。別の興味深いアプリケーションは、kPSCs, 移植前に機械灌流 kPSC 排泄要因の使用です。このように、移植後改善された腎機能につながる可能性があるが explanted 腎臓の質を改善するかもしれない。両方の戦略 kPSCs 臨床目的のためさらに探索する興味深い新しいセル源であります。

間葉系間質細胞 (MSCs) は、もともと骨の髄から分離された免疫の調節細胞です。彼らは彼らの紡錘の形態、脂肪、骨、軟骨、およびプラスチックの付着に分化する能力を形によって特徴付けられます。MSCs は、間質マーカー CD73、CD90、マーカー CD31、CD451,2,3負ながら CD105 を表現します。MSCs は、彼らの組織の恒常性維持と免疫調節能力のための細胞療法の有望な候補です。bmMSCs は、腎臓病と腎移植4として他の場所を含むいくつかの疾患の臨床試験で現在検討中です。
以前血管周囲脂肪組織を含むいくつかの異なった固体器官から細胞、胎盤および骨格筋は MSCs9と特性を共有ことが示されました。しかし、これらの細胞はまた脊髄修復10になることができます組織固有の関数を表わします。ひと心筋血管周囲細胞低酸素後の血管新生反応の刺激など、一方、他の組織から分離した血管周囲細胞はこれらの電位11を表示されませんでした、心筋細胞に分化します。
血管周囲間質細胞は、マウス12,13,14ひと腎臓15,16から分離することができます。我々 の広範囲 kPSCs を特徴し、bmMSCs にこれらを比較します。KPSCs、bmMSCs と同様、免疫能力および血管叢形成をサポートすることができますがわかった。ただし、特定セル型では、腎の転写因子 HoxD10 および HoxD11 を含めて、脊髄転写式署名を示した kPSCs と違い組織があります。kPSCs、bmMSCs と対照をなして TGF-β 刺激後の myofibroblast 変換を受けていないと、脂肪細胞に分化することができませんでした。さらに、kPSCs は、腎尿細管上皮創傷スクラッチ アッセイ、bmMSCs と見られなかった現象で上皮の完全性を加速しました。この強化された傷修理だった肝細胞成長因子の遊離を介する。さらに、kPSCs は、急性腎傷害15マウス モデルにおける腎障害を改善しました。したがって、kPSCs は優れた腎修復能力を持っているようだ、腎臓病の細胞療法のための興味深い新しいソースです。
細胞療法目的で kPSCs を使用するために、kPSCs は臨床グレード酵素とプロトコル臨床グレードの方法で分離する必要があります。また、1 ドナーから kPSCs と数人の患者を治療することには、十分な細胞数を取得必要があります。ここで我々 は臨床細胞療法に使用する細胞の十分な数を降伏詳細、全体移植グレード腎臓から kPSCs の臨床グレードの隔離プロシージャに表示します。

<table><tbody><tr><td>バクスターバッグ</td><td>フェンワル</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血小板</td><td>Sanquin</td><td></td><td>病院の余剰材料は 2 日未満で期限切れです 使用済み</td></tr><tr><td>血小板溶解液</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>使い捨て滅菌ボトル</td><td>コーニング</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>500 mL PP 遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEMミディアム</td><td>ロンザ</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>輸血システム</td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>life technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>正常ヒト血清 (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7.5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Bridge to life</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenase NB1 GMP grade</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>surgical drapes</td><td>3M Nederland</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>METROHM</td><td>X007528300</td><td></td></tr><tr><td>ポンプヘッド</td><td>Metrohm</td><td>X077202600</td><td></td></tr><tr><td>灌流トレイ</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>LS25 マスターフレックスチューブ</td><td>マスターフレックス</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>アクセサリースパイク</td><td>ガンブロ DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>パルモチーム</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 25cm2</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 75 cm2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 175 cm2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬</td><td>miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>抗メラノーマビーズ (NG2)</td> <td>miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 70 & マイクロ;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACSマグネット</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555821</tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555485</tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550315</tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R&D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555596</tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555555</tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>559866</tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555516</tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550257</tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555445</tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>R&D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345815</tr><tr><td>マウス IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345816</tr><tr><td>マウス IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345818</tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555743</tr><tr><td>ヤギ抗マウスPE</td><td>ダコ</td><td>R0480</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEMハムs F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (インスリン、トランスフェリン、セレン)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td></td><td>Sigma H0135</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードチリン</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>不死化ヒト腎 PTEC (HK2)</td><td></td><td></td><td>M. Ryanの礼儀、ユニバーシティカレッジダブリン</td></tr></tbody></table>

ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

間葉系間質細胞 (MSCs) が恒常性や免疫調節細胞移植や腎臓疾患の有益な効果を示すです。血管周囲間質細胞 (Psc) は、骨髄 MSCs (bmMSCs) の特性を共有します。しかし、彼らも所有している、最も可能性の高いローカル刷り込み、組織固有のプロパティおよびローカル組織の恒常性の役割を果たすのため。ティッシュ特定修理、また、ヒトの腎臓内でこの組織の特異性があります。以前、ひと腎臓 Psc (kPSCs) が腎臓上皮創傷治癒の bmMSCs は、この可能性を持っていなかった一方を強化しました。さらに、kPSCs は、腎臓損傷の生体を改善できます。したがって、kPSCs は、細胞治療、特に腎臓病と腎移植のための興味深いソースを構成します。ここで腎動脈と血管マーカー NG2 の濃縮による消化酵素の全体臓器灌流に基づく人間の腎臓移植グレードから kPSCs の詳細な分離と培養法を示す.この方法では、細胞療法に適している大規模な細胞量を取得できます。

臨床グレード kPSCs 分離法は、図 1のとおりです。原油の腎臓の細胞は、コラゲナーゼ灌流によって人間の移植グレード腎臓から分離されます。結果として得られる細胞懸濁液は 5% 血小板 lysates の合流まで培養しました。その後、血管周囲間質細胞画分は、NG2 式に基づいて分離されます。
kPSCs はプラスチック付着性紡錘形細胞 (図 2A)、CD31 CD34、CD45、HLA-DR (図 2B) 負ながら CD73、CD90, CD105、血管周囲間質マーカー マーカー NG2、試験 B、CD146、陽性です。通常、kPSCs の同質な人口は通路 4 に到達することができ、kPSCs に達する通路 9-10 (図 2C) 周りの老化。したがって、通路 5-8 間実験を実行する勧めします。
分離 kPSCs の機能を評価するため、以前示した kPSCs の馴化培地がこのスクラッチ法15の上皮の創傷治癒過程を加速することが、私たちに kPSCs のすべての新しいバッチに体外腎上皮創傷スクラッチ アッセイを実行します。KPSC 馴化培地 kPSCs alphaMEM 5% 血小板溶解液で 48 時間の培養、培養上清を収集させた。次に、不死化ヒト腎近位尿細管上皮細胞 (HK-2)17合流まで培養し、スクラッチ傷が行われます。どちらか kPSCs またはコントロール中の馴化培地は井戸に追加されます、創傷治癒の速度を測定します。KPSCs の馴化培地を追加すると、傷は格段に速くなります (図 2D) を閉じます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
図 1: 臨床等級分離法の人間 kPSCs.移植グレード腎臓を cannulated、腎動脈 (A G) を介してコラゲナーゼと灌流し結果細胞懸濁液を洗浄およびどちらかが凍結したまたは文化 (H ・ K) に入れます。セルに達する confluency (L) と、細胞濃縮は NG2 は (M) を実行しました。どちらかが合流、細胞がトリプシンが増殖または 3 D 構造が (N - P) を表示するときに停止しています。KPSCs のリリース条件は、不妊、マーカー式管状の上皮創傷治癒 (Q) を強化する機能を。矢印: 腎動脈。スケール バー = 200 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
図 2:特性の人間 kPSCs。) KPSCs、紡錘形、プラスチックの付着性のセル。B) kPSCs は、間葉系マーカー CD73、CD90、CD105、血管マーカー、NG2、試験 β および CD146、CD31 CD34、CD45 陰性間の肯定的です。kPSCs エクスプレス MHC クラス (HLA-ABC) けどクラス II (HLA) ではありません。C) フローサイトメトリーから 3 つの異なる kPSC ドナーの生育特性 (通路 4) で同種の NG2 肯定的な集団を確認します。kPSCs に達する通路 9 10 周り老化。D) kPSCs が傷傷アッセイの腎臓上皮修復を強化することができます。制御媒体と t でエアコン kPSC 媒体の代表的な画像 = 0、4、8、12 h が表示されます。A スケール バー) = 200 μ m、D) = 100 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

腎臓血管周囲間質細胞 (kPSCs) の消化酵素と NG2 細胞濃縮全臓器灌流に基づく新規臨床等級分離と培養法をご紹介します。この方法では、細胞療法の十分なセル番号を取得することが可能です。

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

この臨床グレードの分離法の全体的な目的は、さまざまな腎疾患の細胞治療に用いるためのヒト腎血管周囲ストローマ細胞（kPSC）を分離することです。この手法は、腎疾患に対する中枢神経治療や移植に適したヒトkPSCなど、再生医療分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、臨床的に適用可能であること、および細胞治療に十分な数のkPSCを生成できることです。当研究室の技術者であるEllen Lieversが、kPSCの機能試験について実演します。腎細胞の分離手順を開始する前に、滅菌済みの灌流トレイをウォーターバスに垂直に接続してください。灌流トレイが温まったら、ウォーターバスに接続したままトレイを水平方向に変更し、L/S 25チューブをポンプにセットします。培養用ピンセットをチューブの一端に配置し、チューブをトレイの底に置きます。閉塞を防ぐため、チューブの上に滅菌ガーゼを置き、チューブのもう一端にルアーコネクタを取り付けます。次に、トレイに約100 millilitersの培地を加え、ポンプ速度100 milliliters/minでL/S 25チューブのフラッシングを開始します。腎細胞を単離するために、二重滅菌袋から腎臓を滅菌灌流トレイに移し、ハサミを用いて慎重に剥離しながら、腎周囲脂肪組織と腎被膜を除去します。大動脈パッチ上の腎動脈を確認したら、アクセサリースパイクを用いて腎動脈をカニュレーションし、滅菌済みのタイラップでスパイクを固定します。ポンプを起動させ、ポンプチューブ端をルアーコネクターに接続します。そして、トレイ内の培地を用いて、100 milliliter per minuteの流速で腎臓をフラッシュします。次に、20 millilitersのコラゲナーゼと2.5 millilitersのDNAseを灌流トレイに加え、酵素によって腎臓を消化させます。臓器が柔らかくなり、灌流液が不透明になり始めるまで、時々手で優しく臓器を回転させます。コラゲナーゼによる消化時間は非常に重要であり、短すぎると細胞の凝集につながり、長すぎると細胞死を招きます。酵素灌流の終了後、細胞懸濁液が得られるまで腎臓を優しくマッサージし、未消化物とスパイクを取り除きます。50 mLの正常ヒト血清を細胞懸濁液に加えます。次に、ポンプを低流量に設定し、腎臓に接続されたチューブを数本の50 mL回収チューブの上に配置して、細胞懸濁液を灌流トレイから回収チューブに排出させます。すべての細胞を回収した後、細胞懸濁液を遠心分離し、10%正常ヒト血清を添加した洗浄用培地でペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞ペレットと同量の細胞培養培地でペレットを再懸濁します。未精製腎細胞を培養するため、T 175細胞培養フラスコ1本あたり、約1 mLの細胞懸濁液を24 mLのα-MEM 5%血小板ライゼート細胞培養培地に加え、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。2日後、上清と細胞残渣を除去し、25 mLの新鮮な細胞培養培地を添加します。細胞がコンフルエントになったら、標準プロトコルに従い、磁気細胞分離法を用いてNG2陽性画分を単離します。次に、適切なサイズの細胞培養フラスコに1cm²あたり4×10³個のNG2陽性細胞を播種し、フラスコを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞が90〜100%コンフルエントに達したら、上清を回収し、接着細胞をPBSで2回洗浄します。フラスコのサイズに応じて適切な量のトリプシンで細胞を剥離させ、5分後に保存しておいた上清を加えて反応を停止させます。細胞を穏やかに再懸濁し、遠心分離用の適切なサイズのコニカルチューブに細胞懸濁液を移した後、4 × 10³ cells/cm² の密度で再播種します。NG2濃縮後、細胞の増殖が停止したり、3D構造で成長し始めたりすることがあります。この場合は、細胞をトリプシン処理して再播種することで解決できます。4〜5代の継代後、kPSCを6ウェルプレートに1ウェルあたり2 mLの培地で2×10⁵ cellsの濃度で播種し、別の6ウェルプレートに近位尿細管上皮細胞を1ウェルあたり2 mLの近位尿細管上皮細胞培地で5×10⁵ cells播種します。両方のプレートを細胞培養インキュベーターに48時間置き、培養終了時にkPSCの細胞上清を回収します。次に、近位尿細管上皮細胞の上清を除去し、黄色いピペットチップを用いて各ウェルの底にある細胞単層にスクラッチを作製します。スクラッチした細胞をPBSで洗浄し、腎血管ストローマ細胞培養のコンディション培地を加えます。その後、倒立明視野顕微鏡を用いて、同じマークした位置で4時間、8時間、12時間、および24後にスクラッチを撮影し、時間経過に伴う閉鎖率を評価します。腎血管周囲間質細胞は、プラスチック接着性で紡錘形の細胞であり、間質および血管周囲細胞マーカーに陽性で、CD31、CD34、CD45、およびHLA-DRのマーカーには陰性です。通常、継代4回目で均一な腎血管周囲間質細胞の集団が得られ、継代9回から10回前後で細胞は細胞老化に達します。この代表的な創傷スクラッチアッセイでは、kPSCの機能的能を評価しました。腎周囲血管間質細胞の培養上清を添加したところ、コントロール培地で培養したウェルよりも有意に速く創傷が閉鎖しました。一次分離の手技に習熟すれば約2時間で完了しますが、均一なkPSC集団を構築するには1〜2か月かかります。この手順を行う際は、腎臓が柔らかくなり、液体の透明度が低下した時点で直ちにコラゲナーゼ処理を停止することが重要です。ここで実演した手順に加えて、これらの手法は他の実質臓器から血管周囲ストローマ細胞を単離するためにも利用可能です。この手法で単離されたkPSCは、さまざまな腎疾患および移植モデルにおいて、これらの細胞の再生能力を研究するために使用できます。このビデオを視聴することで、臨床グレードの形式でkPSCを単離および培養できるようになります。ヒト由来試料を扱う際はウイルス感染のリスクがあることに留意し、本手順を実施する際は、HIV、B型肝炎、C型肝炎などの検査を行うなど、常に予防措置を講じてください。

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