Name: Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando In Utero Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Scopri l'imaging confocale dei neuroni migranti in colture di fette organotipiche di cervello embrionale di topo usando l'elettroporazione in utero. Questo metodo permette di analizzare la velocità e la direzione della migrazione neuronale in tempo reale.

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Ringraziamo Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer per un&#39;ottima assistenza tecnica, nonché Victor Tarabykin per discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (Regierungspräsidium Tübingen) e sono state eseguite in conformità con la legge tedesca del benessere degli animali e la direttiva UE 2010/63 / UE. 1. In Urolo elettroporazione <ol><li> Aghi da microinezione <ol><li> Tirare i capillari di vetro borosilicato (diametro esterno: 1,0 mm, diametro interno: 0,58 mm, lunghezza: 100 mm) in aghi di microinezione usando un estrattore a micropipetta con filo di scatola (2,5 mm x 2,5 mm) e il seguente programma: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 e DELAY: 140. Determinare il valore HEAT per ogni singolo filamento eseguendo un test RAMP (valore HEAT: RAMP + 25). </li><li> Gli aghi smussati ad angolo di 38 ° e velocità intermedia a alta velocità con microgrinder per ottenere una dimensione di punta da 20 a 30 μm per l&#39;iniezione a giorni embrionali (E) 13,5 o minori e da 30 a 40 μm per l&#39;iniezione di embrioni anzianistadi. Per l&#39;immagazzinamento, agganciare gli aghi in una scatola o un piatto di petri con l&#39;argilla di modellazione per evitare danni alle punte. </li></ol></li><li> Soluzione del DNA plasmidico <ol><li> Preparare il DNA del plasmide contenente proteine ​​reporter fluorescenti ( ad es. GFP) usando un kit di preparazione maxi senza endotossina secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Diluire la soluzione del DNA plasmidico a una concentrazione finale di 1 - 2 μg / μL in tampone Tris-EDTA privo di endotossina contenente Fast Green in una concentrazione finale dello 0,01%. Soluzione alcolica e conservazione a -20 ° C. </li></ol></li><li> Soluzione batteriostatica di cloruro di sodio <ol><li> Preparare la soluzione di cloruro di sodio batteriostatico aggiungendo l&#39;alcool benzilico ad una concentrazione finale dello 0,9% alla soluzione isotonica 0,9% di cloruro di sodio. Soluzione filtrante sterile immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Soluzione iniettabile per Carprofen <ol><li> Preparare la soluzione di iniezione di carprofenL&#39;aggiunta di carprofene ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml alla soluzione sterile isotonica 0,9% di cloruro di sodio. Conservare a 4 ° C per un massimo di 28 giorni. </li></ol></li><li> Anestesia, Iniezione del DNA e Elettroporazione <ol><li> Pesare un mouse E14.5 in gravidanza temporizzato e collocarlo in una camera anestetizzante trasparente collegata ad un vaporizzatore e saturata con 5% isoflurano. Quando l&#39;animale è incosciente, trasferirlo in una maschera anestetizzante attaccata a una piastra riscaldante a 37 ° C e mantenerla anestetizzata con 1,8-2,2% isoflurano. Nota: Valutare lo sviluppo dell&#39;anestesia chirurgica da perdita di pizzicamento della coda e di pedale (pizzicotto del piede). </li><li> Per analgesia, iniettare 100 μL di soluzione di iniezione di carprofen per 10 mg di peso corporeo del mouse (5 mg / kg di peso corporeo) sottocutanea. Girare il mouse con la schiena verso il basso e coprire con cura gli occhi con la gelatina di petrolio per impedire l&#39;essiccazione. </li><li> Spalmare delicatamente le membra e fissarleAlla piastra riscaldante con nastro chirurgico. Sterilizzare l&#39;addome con il 70% di etanolo seguito da una soluzione di iodio (7,5 mg / ml) utilizzando tamponi di cellulosa. Ripetere questa procedura tre volte per assicurare una corretta disinfezione. </li><li> Coprire l&#39;addome con garza sterile in cui è stata tagliata un&#39;incisione per risparmiare un campo (diametro 2 - 2,5 cm) per l&#39;incisione addominale. Inumidire la garza con soluzione di cloruro di sodio batteriostatico. Attenzione: riesaminare lo sviluppo dell&#39;anestesia chirurgica perdendo il riflesso del pedale. </li><li> L&#39;utilizzo di Micro Adson Forceps (dentata, lunghezza: 12 cm) e forbici (angolate a lato, lunghezza: 9 cm) tagliano la pelle di circa 1,5 cm lungo la linea mediana dell&#39;addome. Tagliare il muscolo sottostante lungo linea alba. </li><li> Rimuovere un corno uterino con pinze ad anello (lunghezza: 9 cm, diametro esterno: 3 mm, diametro interno: 2,2 mm) e metterlo delicatamente sulla garza inumidita. Attenzione: Tenere il corno uterino con le pinze dell&#39;anello solo tra embrioni anD non perturbare le placenta o qualsiasi vaso di approvvigionamento. Tenere l&#39;utero umido in qualsiasi momento con soluzione di cloruro di sodio batteriostatico. </li><li> Posizionare con cura un embrione con pinze anelli e individuare il ventricolo laterale, che presenta come un&#39;ombra a forma di mezzaluna parallela al sinus sagittale. Il sito di iniezione si trova approssimativamente al centro di una linea tra l&#39;occhio pigmentato e la confluenza dei seni, dove il seno sagittale si rade a due seni trasversali. Spingere l&#39;ago di microinezione attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale. Nota: Se necessario, la profondità dell&#39;iniezione può essere correggita mediante ritiro dell&#39;ago. </li><li> Iniettare da 1 a 2 μL di soluzione DNA nel ventricolo laterale con un microinjector, che viene azionato con un pedale, utilizzando le seguenti impostazioni: 25 psi, 10 a 20 ms per impulso e 5 a 10 impulsi. L&#39;iniezione di successo può essere monitorata dalla soluzione DNA colorata, che dovrebbe riempire il sistema ventricolare. </li><li> Posizionare gli elettrodi tipo tweezers (diametro 3 mm per E13.5 o più piccolo e diametro 5 mm per E14.5 o più vecchi) in modo tale che il terminale &quot;positivo&quot; sia sullo stesso lato del ventricolo iniettato e del &quot;negativo&quot; Il terminale è sul lato opposto del ventricolo iniettato sotto l&#39;orecchio della testa dell&#39;embrione. </li><li> Inumidire il sito di elettroporazione con alcune gocce di soluzione di cloruro di sodio batteriostatico e applicare 5 impulsi di corrente elettrica (35 V per E13.5 o minori e 40 V per E14.5 o più) di durata di 50 ms con intervalli di 950 ms. Nota: le correnti di 60 a 90 mA sono di solito sufficienti per una corretta elettroporazione. Le correnti più basse non transfettano efficacemente i neuroni, mentre le correnti più alte possono portare a morte embrionale. </li><li> Ripetere la procedura (cf Punto 1.5.7 - 1.5.10) per ogni embrione del corno uterino e riportarla delicatamente nella cavità addominale. </li><li> Rimuovere il corno uterino dall&#39;altro lato e ripetere la procDescritto nel passaggio 1.5.7. A 1.5.11. </li><li> Chiudere la cavità addominale suturando lo strato muscolare prima di suturare la pelle utilizzando Micro Adson Forceps, Mathieu Needle Holder (carburo di tungsteno, lunghezza: 14 cm) e sutura chirurgica non assorbibile (cerchio 3/8, 13 mm, punto conica). Attenzione: Fare attenzione a non catturare l&#39;utero o altri organi durante la sutura. </li><li> Disinfettare con cautela la sutura cutanea con soluzione iodica (7,5 mg / ml) e rimuovere delicatamente l&#39;eccesso periocular di gelatina di petrolio utilizzando tamponi di cellulosa. Posizionare il mouse sotto una lampada a infrarossi finché non si sveglia. Monitorare attentamente il mouse durante i prossimi due giorni. Ripetere il trattamento analgesico come descritto nel passaggio 1.5.2 dopo 12 - 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Cultura Organotypic Slice <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> Sciogliere 1 mg di laminina liofilizzata in acqua sterile per ottenere una soluzione di stock laminina da 1 mg / ml. Preparare le aliquote di 50 μL aNd a -80 ° C. </li></ol></li><li> Soluzione di magazzino Poly-L-Lysine <ol><li> Sciogliere 50 mg di poli-L-lisina in acqua sterile per ottenere una soluzione di stock di poli-L-lisina da 1 mg / ml. Preparare aliquote di 0,5 mL e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Soluzione salina bilanciata completa di Hank (Complete HBSS) <ol><li> Preparare HBSS completo combinando 50 ml di soluzione 10x HBSS, 1,25 ml di 1 M HEPES tampone (pH 7,4), 15 ml di soluzione di glucosio da 1 M, 5 ml di soluzione di cloruro di calcio da 100 mM, 5 ml di 100 mM di solfato di magnesio Soluzione e 2 mi di 1 M soluzione di carbonato di idrogeno di sodio. Aggiungere acqua sterile fino a 0,5 L, filtro sterile e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Slice Medium di coltura <ol><li> Combinare 35 ml di Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml di HBSS completo (cf paragrafo 2.3.1), 1,35 ml di 1 M D-glucosio, 0,25 ml di 200 mM L-glutammina e 0,5 ml di penicillina-streptomicina a Ottenere 50 ml di coltura di fettamedio. Filtro sterile e aggiungere siero di cavallo ad una concentrazione finale del 5%. Conservare a 4 ° C fino a 4 settimane. </li></ol></li><li> Soluzione agarosa a basso punto di fusione (LMP) <ol><li> Preparare la soluzione di agarosio 3% di LMP sciogliendo 1,5 g di agarosio LMP in 50 ml di HBSS completo riscaldando in un forno a microonde per 1 a 2 minuti a potenza intermedia. Nota: controllare con cautela il calore per evitare il trabocco durante la bollitura. </li><li> Mettere la soluzione in un bagno d&#39;acqua a 38 ° C fino all&#39;uso pronto. Conservare a 4 ° C e riutilizzarlo una volta. </li></ol></li><li> Rivestimento di inserti a membrana <ol><li> Aggiungere una aliquota della soluzione di stock laminina (cf Punto 2.1.1) e una aliquota della soluzione di stock di poli-L-lisina (cf Punto 2.2.1) a 6 ml di acqua sterile per ottenere una soluzione di rivestimento (sufficiente per 6 inserti) . </li><li> Inserire gli inserti della membrana in una piastra a 6 pozzetti contenenti 2 ml di acqua sterile nella parte inferiore di ciascun pozzetto. Aggiungere 1 ml di soluzione di rivestimento(Cf Passo 2.6.1) sopra ogni membrana e incubare per una notte a 37 ° C e 5% in atmosfera di anidride carbonica. Nota: Utilizzare solo inserti con membrane ottiche chiare, come la membrana politetrafluoroetilene (PTFE). </li><li> Lavare le membrane tre volte con 1 ml di acqua sterile e asciugare. Utilizzare le membrane rivestite nello stesso giorno o conservare in un piatto a 6 pozzetti puliti a 4 ° C per un massimo di quattro settimane. </li></ol></li><li> Dissezione del cervello e embedding <ol><li> Due giorni dopo l&#39;elettroporazione posizionare il mouse in una camera trasparente collegata ad un vaporizzatore e saturata con 5% isoflurano. Quando l&#39;animale è incosciente, toglierlo dalla camera e sacrificarlo con la dislocazione cervicale. </li><li> Rimuovere l&#39;utero contenente gli embrioni e collocarlo in un piatto di Petri da 10 cm con HBSS completo di ghiaccio. Nota: Da questo punto in avanti mantenere tutte le soluzioni, embrioni e cervelli sul ghiaccio. </li><li> Utilizzare uno stereomicroscopio, pinze a punta fine (diritto,11 cm) e un paio di forbici a molla Vannas Tübingen (angolato fino, lunghezza: 9,5 cm) per separare ogni embrione dall&#39;utero e trasferirlo ad un altro piatto di Petri contenente HBSS completo ghiacciato. </li><li> Fare un&#39;incisione al livello del gambo cerebrale e tagliate lungo la linea mediana sagittale. Sbucciate la pelle e la cartilagine che copre il cervello. Poi, tagliare il cervello proprio dietro gli emisferi e rimuovere il cervello dal cranio. Trasferire il cervello con una spatola di micro-cucchiaio (185 mm x 5 mm) su una piastra a 12 pozzetti contenente HBSS completo di ghiaccio. Raccogli tutti i cervelli dalla lettiera nella piastra a 12 pozzetti. </li><li> Utilizzare un stereomicroscopio fluorescente per schermare i cervelli nella lastra a 12 pozzetti per la luminosità della fluorescenza e la dimensione della regione elettroporata. Selezionare 2 a 4 cervelli con segnali luminosi fluorescenti nella corteccia somatosensoriale presuntiva per ulteriori elaborazioni. </li><li> Versare la soluzione di agarosio al 3% di LMP mantenuta a 38 ° C nello stampo monouso di stoccaggio. RemovIl cervello dalla piastra a 12 pozzetti con una spatola di micro-cucchiaio e scoraggiare attentamente l&#39;eccesso di HBSS completo intorno al cervello utilizzando carta velina fine. </li><li> Posizionare il cervello dolcemente nella soluzione agarosa, spingerla verso il fondo dello stampo e regolare con precisione la posizione usando un ago da 20 gauge. Per le sezioni coronali, orientare il cervello con le lampadine olfattive rivolte verso l&#39;alto. Tenere lo stampo sul ghiaccio finché la soluzione agarosa non si solidifica e continua a tagliare il cervello. </li></ol></li><li> Vibratome Sezione e Cultura Slice <ol><li> Rimuovere il blocco agarosio dallo stampo e metterlo sul coperchio di un piatto petri sterile. Togliere l&#39;agarosio in eccesso con una lama pulita pulita lasciando circa 2 a 3 mm sotto le lampadine olfattive e 1 mm di agarosio sulle altre parti. Fissare il blocco di agarosio tagliato con le lampadine olfattive che puntano verso il basso verso una fase di campionamento utilizzando colla cianoacrilato. Nota: Sterilizzare gli strumenti e le attrezzature con il 70% di etanoL prima della sezione. </li><li> Trasferire lo stadio del campione alla camera di taglio di un microtomo a vibrazione della lama contenente HBSS completo di ghiaccio e posizionare il cervello con il suo lato dorsale verso la lama. Tagliare fette di cervello di 250 μm contenenti la regione elettroporata con un&#39;ampiezza bassa o moderata di 0,9 mm e una velocità di taglio molto lenta di 0,09-0,12 mm / s. Di solito 4 a 6 fette con segnale luminoso fluorescente sono ottenuti da ciascun cervello elettroporato con successo. </li><li> Con una spatola micro-cucchiaio piegata e pinze a punta fine, trasferire con cura le fette del cervello con l&#39;agarosio circostante su una piastra a 6 pozzetti contenente HBSS completo di ghiaccio. Attenzione: Fare attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale solo toccando il cerchio agarosio attorno alle sezioni con le pinze durante il trasferimento. </li><li> Processare tutti i cervelli selezionati come descritto in Fasi 2.8.1. A 2.8.3. </li><li> Inumidire gli inserti a membrana con 100 μL di HBSS completo prima di mettere il cervello slGetta sulle membrane per facilitare il posizionamento delle fette. Possono essere posizionati fino a 5 fette su un inserto a membrana. </li><li> Trasferire con cautela le fette sulle membrane usando una spatola piegata di micro-cucchiaio e fine pinze a punta. Tirare delicatamente una fetta sulla spatola toccando il cerchio agaroso con le pinze e spingere delicatamente la fetta dalla spatola sulla membrana. Posizionare la fetta con le pinze e continuare a trasferire le restanti fette. Rimuovere l&#39;HBSS in eccesso completo con una pipetta. Nota: non sovrapporre le fette tra di loro. </li><li> Con l&#39;aiuto delle pinze posizionare con cura le inserti a membrana con le fettine in una piastra a 6 pozzetti contenenti 1,8 ml di terreno di coltura a fetta (cf Punto 2.4.1) e incubare a 37 ° C e al 5% di anidride carbonica fino al tempo imaging. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Time-Lapse <ol><li> Impostazione del microscopio <ol><li> Impostare una camera di clima posta sul palco di unMicroscopio confocale invertito a 37 ° C e atmosfera di anidride carbonica del 5%. Utilizzare un rivelatore ibrido per ridurre l&#39;intensità laser e migliorare la vitalità cellulare. Per un&#39;analisi dettagliata, utilizzare una distanza di lavoro extra lunga 40X con un apertura numerica di 0,6 o superiore. Nota: Tutti i componenti del microscopio devono essere pre-riscaldati a 37 ° C per 2-3 ore prima dell&#39;immagine per fornire un fuoco stabile durante il processo di imaging. </li></ol></li><li> Slice Imaging <ol><li> Selezionare una fetta del cervello per l&#39;imaging dalla piastra a 6 pozzetti contenenti gli inserti a membrana utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Attenzione: Evitare il tempo di esposizione prolungato alla luce ultravioletta, in quanto ciò può causare fotodamage cellulare. Nota: Selezionare una fetta con neuroni singoli luminosi nella SVZ superiore che si sposta radialmente verso la superficie pialla della fetta. Processi fluorescenti fine di cellule gliali radiali che attraversano l&#39;intero CP indicano un impalcatura radiale radiale intatta, che è l&#39;usoD emettendo radialmente i neuroni corticali. </li><li> Trasferire l&#39;inserto a membrana con la fetta, selezionata per l&#39;imaging di tempo, in un piatto di vetro di 50 mm di diametro contenente 2 ml di terreno di coltura a fetta con l&#39;aiuto di pinze. Posizionare il piatto nella camera di clima del microscopio confocale. </li><li> Impostare la risoluzione a 512 di 512 pixel e aumentare la velocità di scansione da 400 Hz a 700 Hz per aumentare la frequenza di fotogramma da rispettivamente da 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo. Non utilizzare più di due volte la media. Definire una z-stack attraverso la regione elettroporata (di solito 400-100 μm) con un passo di 1,5 μm. Insieme, queste impostazioni consentono una risoluzione e una luminosità sufficienti dell&#39;immagine mantenendo inalterate la fotodamiglia durante l&#39;acquisizione. Avviare la serie di time-lapse prendendo una z-stack ogni 30 min. Nota: L&#39;esposizione prolungata della fetta alla luce laser indurirà il fotodamage riducendo la vitalità delle cellule. Regolare l&#39;esRispecchiare il tempo alla luce laser di conseguenza. </li><li> Analizza la serie di time-lapse usando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente. </li></ol></li></ol>

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<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li>
<li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li>
<li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

La migrazione radicale è un processo fondamentale nello sviluppo del neocortex. Le mutazioni in geni che influenzano diverse fasi di questo processo possono causare gravi malformazioni corticali, tra cui lissencefalia e della sostanza bianca eterotopia 1, 2. Recentemente abbiamo mostrato che Bcl11a, che si esprime nei giovani neuroni di proiezione corticale migratori, svolge un ruolo nella migrazione radiale. Abbiamo utilizzato l&#39;imaging confocale dei migrat...

Il neocortex è il principale sito di funzioni cognitive, emotive e sensoriali. È composto da sei strati orizzontali orientati in parallelo alla superficie del cervello. Durante lo sviluppo, le cellule progenitrici nella parete laterale del telencephalon dorsale danno origine a neuroni di proiezione che migrano radialmente verso la superficie del piolo e acquisiscono un&#39;identità neuronale specifica di tipo strato. Dopo essere stati generati nelle zone ventricolari / subventricolari (VZ / SVZ) questi neuroni diventano temporaneamente multipolari e rallentano la loro migrazione. Dopo un breve periodo di permanenza nella zona intermedia (IZ) si passa alla morfologia bipolare, si collega all&#39;impianto radiale dell&#39;altile e continua la migrazione orientata radialmente nella piastra corticale (CP). Al raggiungimento del loro obiettivo finale di proiezione i neuroni si staccano dai processi radiali degli gliali e acquisiscono un&#39;identità specifica del livello. Le mutazioni nei geni che colpiscono varie fasi della migrazione neuronale possono causare gravi malformazioni corticali, come lissencEfalia o eterotopia della materia bianca 1 , 2 . Nell&#39;utero l&#39; elettroporazione è una tecnica rapida e potente per trasfettare le cellule progenitrici neurali nel cervello in sviluppo degli embrioni di roditore 3 , 4 . Con questa tecnica è possibile sconnessioni e / o sovrapressione di geni di interesse per studiare le loro funzioni nello sviluppo di neuroni. Questo metodo ha contribuito in modo specifico a descrivere i dettagli morfologici e caratterizzare i meccanismi molecolari del processo di migrazione radiale 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . I neuroni che migrano radicalmente subiscono variazioni dinamiche in forma cellulare, velocità di migrazione e direzione migratoria, che richiedono un&#39;osservazione diretta e continua nel tempo. Cultu di fetta organotipicaLa riqualificazione e la temporanea imaging confocale dei cervelli elettroporati permettono di osservare direttamente i neuroni migranti nel tempo. Utilizzando questo approccio combinato, è possibile analizzare le caratteristiche distinte dei neuroni migratori che non possono essere studiati in sezioni di tessuti fissi di cervelli elettroporati. Abbiamo recentemente applicato l&#39;imaging confocale dei migratori neuronali in culture di fetta di cervelli elettroporati per studiare il ruolo del CLL / linfoma 11a (Bcl11a) della cellula B della trascrizione nel corso dello sviluppo corticale 10 . Bcl11a è espresso in giovani neuroni corticali migranti e abbiamo utilizzato un mutante Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 condizionato per studiare le sue funzioni. L&#39;elettroporazione di Cre ricombinasi insieme a proteine ​​fluorescenti verdi (GFP) nei progenitori corticali di cervelli flox / flox Bcl11a ci ha permesso di creare una situazione di mutante mosaico, in cui solo alcune cellule sono mutate in unAltrimenti sfondo di natura selvaggia. In questo modo, è stato possibile studiare le funzioni autonome delle cellule Bcl11a a livello di singola cellula. Abbiamo scoperto che i neuroni mutanti Bcl11a mostrano velocità ridotte, spostamenti nei loro profili di velocità, nonché cambiamenti di orientamento casuale durante la loro migrazione 10 . Nel protocollo descritto descriviamo un flusso di lavoro per l&#39;elettroporazione di successo e la preparazione della coltura di fetta 12 dei cervelli del topo, nonché l&#39;imaging confocale delle colture corticali di fetta.

<table><tbody><tr><td>isoflurano</td><td>Abbott Laboratories&nbsp;</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>sutura chirurgica non assorbibile</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 cerchio, 13 mm, punta conica</td></tr><tr><td>Micro Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>seghettato, lunghezza: 12 cm</td></tr><tr><td>forbici fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>angolato lateralmente, lunghezza: 9 cm</td></tr><tr><td>Mathieu Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td>carburo di tungsteno, lunghezza: 14 cm</td></tr><tr><td>pinza a punta fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>dritto, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; bingen Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>angolato verso l'alto,</td></tr><tr><td>pinza ad anello</td> da 9,5 cm <td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, lunghezza: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>siero di cavallo</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>sistema di anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>camera di anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>contenitore del filtro fluorescente</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>agarosio a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>microtomo a lama vibrante</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per colture tissutali a fluorescenza invertita</td><td>Leica</td><td>M125</td> Leica DM IL LED <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio a scansione laser confocale</td><td>Rivelatore ibrido Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr> Obiettivo <tr><td></td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>, 40x/0,60 NA</td><td></td> Sistema <td>di</td> controllo della temperatura per microscopio Leica 11506201 <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Imaging Services</td><td>Cube, Brick & Scatola</td><td></td></tr><tr><td>inserto per colture cellulari</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>utilizzare un angolo di 38 gradi per smussare il</td></tr><tr><td>microiniettore</td><td>Parker Hannifin&nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofene</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>emdedding mold</td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>maxi kit plasmide senza endotossine</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>verde veloce</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>elettroporatore ad onda quadra</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pinzette con elettrodi a disco di platino da 5 mm</td><td>Estrattore</td><td>per</td> micropipette Sonidel CUY650P5 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>scatola filamento</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td> Spatola per micro-cucchiaio <td>da 2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>231-0191</td> Piatto con fondo in vetro <td>da 185 mm x 5 mm</td></tr><tr>, <td>World Precision Instruments</td><td></td> <td>da 50 mmFD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; in utero</em&gt; elettroporazione

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Nell&#39;utero l&#39; elettroporazione è un approccio veloce e potente per studiare il processo di migrazione radiale nella corteccia cerebrale degli embrioni di topo di sviluppo. Ha contribuito a descrivere i diversi passi della migrazione radiale e caratterizzare i meccanismi molecolari che controllano questo processo. Per analizzare in modo diretto e dinamico i neuroni migrativi, essi devono essere rintracciati nel tempo. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che combina in elettroporazione utero con la cultura di fetta organotypica e imaging confocale a tempo intervallo, che consente un esame diretto e un&#39;analisi dinamica dei migratori radiali di neuroni corticali. Inoltre, è possibile la caratterizzazione dettagliata dei neuroni migranti, quali velocità di migrazione, profili di velocità e cambiamenti di orientamento radiale. Il metodo può essere facilmente adattato per eseguire analisi funzionali di geni di interesse per la migrazione radiale dei neuroni corticali mediante perdita e guadagno di funzione, nonché esperimenti di salvataggio. Lasso di tempoL&#39;imaging dei neuroni migratori è una tecnica all&#39;avanguardia che una volta stabilita è un potente strumento per studiare lo sviluppo della corteccia cerebrale nei modelli di mouse dei disturbi della migrazione neuronale.

In precedenza, abbiamo mostrato che la delezione genica di Bcl11a da parte dell&#39;utero elettroporzionale compromette la migrazione radiale dei neuroni di proiezione di strato superiore 10 . L&#39;elettroporazione di un vettore plasmidico DNA contenente Cre-IRES-GFP ha eliminato efficacemente Bcl11a nei cervelli condizionati Bcl11a flox / flox 11 . Quando abbiamo analizzato ...

Questo protocollo fornisce istruzioni per l&#39;osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell&#39;utilizzo dell&#39;elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l&#39;imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare direttamente i neuroni in migrazione radiale in colture organotipiche di sezioni preparate da cervello embrionale elettroporato, mediante microscopia confocale a tempo-lampo. Questo metodo può contribuire allo studio di aspetti fondamentali dello sviluppo della neocorteccia. Permette di indagare i meccanismi molecolari coinvolti nella polarizzazione neuronale e nella migrazione radiale dei neuroni verso la loro posizione finale all'interno del cervello.Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile analizzare le proprietà dinamiche dei neuroni in migrazione, inclusi i profili di velocità, la velocità media di migrazione e i cambiamenti nella direzione migratoria. Iniziare posizionando un topo gravido opportunamente anestetizzato in posizione supina su una piastra riscaldata. Verificare l'assenza del riflesso plantare.Quindi, coprire con attenzione gli occhi con vaselina per evitarne l'essiccazione. Successivamente, distendere delicatamente gli arti e fissarli al piatto riscaldato con nastro chirurgico. Sterilizzare l'addome passando con etanolo al 70% seguito da soluzione di iodio, quindi posizionare una garza sterile, nella quale è stato praticato un taglio per l'incisione addominale, sull'addome.Inumidire la garza con soluzione di cloruro di sodio batteriostatica. Dopo aver rivalutato lo sviluppo dell'anestesia chirurgica, mediante la perdita del riflesso plantare, utilizzare pinze micro Adson seghettate e forbici fini angolate per tagliare la cute per circa 1,5 centimetri lungo la linea mediana dell'addome. Successivamente, tagliare il muscolo sottostante lungo la linea alba.Afferrare il corno uterino tra gli embrioni con pinze a anello e posizionarlo delicatamente sulla garza inumidita senza disturbare le placenti o i vasi sanguigni. Successivamente, posizionare con attenzione un embrione in modo da ottenere una visione chiara del ventricolo laterale, che appare come un'ombra a forma di mezzaluna parallela al seno sagittale. Il sito di iniezione si trova nel punto medio di una linea tra l'occhio pigmentato e la confluenza dei seni, dove il seno sagittale si dirama in due seni trasversi.Dopo averlo identificato, spingere l'ago per microiniezione attraverso la parete uterina e all'interno del ventricolo laterale. Successivamente, utilizzare un microiniettore azionato con un pedale per iniettare da uno a due microlitri di soluzione di DNA mediante cinque a dieci impulsi. L'esito positivo dell'iniezione può essere monitorato grazie alla soluzione colorata di DNA, che dovrebbe riempire il sistema ventricolare.Quindi, posizionare elettrodi di tipo pinzetta in modo che il terminale positivo si trovi sullo stesso lato del ventricolo iniettato e il terminale negativo sul lato opposto del ventricolo iniettato, al di sotto dell'orecchio della testa dell'embrione. Inumidire il sito di elettroporazione con alcune gocce di soluzione di cloruro di sodio batteriostatico ed applicare cinque impulsi di corrente elettrica della durata di 50 millisecondi ciascuno, con intervalli di 950 millisecondi. La formazione di bolle all'elettrodo negativo indica il passaggio di corrente elettrica.Da 60 a 90 milliampere sono generalmente sufficienti per un'elettroporazione efficace. Correnti inferiori non trasfetteranno in modo efficiente i neuroni, mentre correnti più elevate possono portare alla morte dell'embrione. Dopo aver ripetuto la procedura per ogni embrione del primo corno uterino, riposizionarlo delicatamente nella cavità addominale.Dopo aver suturato lo strato muscolare e la cute, disinfettare accuratamente con soluzione di iodio ed eliminare delicatamente la vaselina dagli occhi utilizzando tamponi di cellulosa. Posizionare il topo sotto una lampada a infrarossi fino al risveglio. Dopo aver soppresso la femmina gravida mediante un metodo approvato, rimuovere l'utero contenente gli embrioni e collocarlo in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente HBSS completo freddo di ghiaccio.Da questo momento in poi, mantenere tutte le soluzioni, gli embrioni e i cervelli sul ghiaccio. Mentre si lavora al microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette a punta fine e un paio di forbici a molla Vannas Tubingen per separare ogni embrione dall'utero. Trasferire gli embrioni in un'altra capsula di Petri contenente HBSS completo freddo di ghiaccio.Eseguire un'incisione a livello del tronco encefalico e tagliare lungo la linea mediana sagittale. Rimuovere la pelle e la cartilagine che ricoprono il cervello. Successivamente, recidere il tronco encefalico subito dietro gli emisferi ed estrarre il cervello dal cranio.Trasferire il cervello con una spatola microscopica in una piastra a 12 pozzetti contenente HBSS completo freddo di ghiaccio. Raccogliere tutti i cervelli della nidiata nella piastra a 12 pozzetti. Successivamente, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per esaminare i cervelli nella piastra a 12 pozzetti in base all'intensità della fluorescenza e alle dimensioni della regione elettroporata.Selezionare da due a quattro cervelli con segnali fluorescenti intensi e la corteccia somatosensoriale presunta per un ulteriore trattamento. Quindi, versare una soluzione fusa di agarosio al 3% a basso punto di fusione in uno stampo monouso rimovibile. Utilizzare una spatola micro-piastrina per rimuovere il cervello dalla piastra a 12 pozzetti e drenare con attenzione l’eccesso di HBSS completo intorno al cervello usando carta da filtro fine.Posizionare delicatamente il cervello nella soluzione di agarosio. Quindi, utilizzare un ago da 20 gauge per spingerlo sul fondo dello stampo e regolarne con attenzione la posizione. Per sezioni coronali, orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi siano rivolti verso l'alto.Mantenere lo stampo sul ghiaccio fino a quando la soluzione di agarosio non si è solidificata, quindi procedere al taglio del cervello. Utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere l'agarosio in eccesso intorno al cervello, lasciando circa un millimetro di agarosio su tutti i lati, tranne che per i bulbi olfattivi, dove devono essere lasciati due o tre millimetri di agarosio. Dopo aver applicato una piccola quantità di colla a base di cianoacrilato su un campione, fissare il blocco di agarosio tagliato con i bulbi olfattivi rivolti verso il basso.Trasferire la piastra del campione nella camera di taglio di un microtomo a lama vibrante contenente HBSS completo freddo di ghiaccio e posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso la lama. Tagliare fette cerebrali di 250 micron di spessore contenenti la regione elettroporata con un'ampiezza bassa o moderata e una velocità di sezione molto lenta. Di solito si ottengono quattro-sei fette con segnale fluorescente brillante da ciascun cervello elettroporato con successo.Afferrare il bordo dell'agarosio di una sezione con pinzette a punta fine e trasferire delicatamente la fetta su una spatola micro-curva. Trasferire con attenzione le fette cerebrali in una piastra a sei pozzetti contenente HBSS completo freddo su ghiaccio. Inumidire gli inserti con membrana rivestiti di laminina con 100 microlitri di HBSS completo.Quindi, trasferire con attenzione le sezioni sulle membrane utilizzando la spatola microcucchiaio piegata e le pinzette. Spingere delicatamente la sezione dalla spatola sulla membrana, quindi posizionarla con le pinzette. Proseguire con il trasferimento delle sezioni rimanenti.Su un inserto membranoso si possono posizionare fino a cinque fette. Rimuovere l'eccesso di HBSS completo con una pipetta. Successivamente, con l'aiuto di pinzette, posizionare con attenzione gli inserti membranosi con le fette in una piastra a sei pozzetti contenente 1,8 millilitri di mezzo di coltura per fette.Selezionare una sezione cerebrale per l'acquisizione di immagini osservando le sezioni attraverso un microscopio invertito. Scegliere una sezione con neuroni singoli luminosi nella zona ventricolare superiore (SVZ) che migrano radialmente verso la superficie del taglio. La presenza di fini prolungamenti fluorescenti delle cellule gliali radiali che attraversano l'intera piastra coniugata indica uno scheletro di cellule gliali radiali integro, utilizzato dai neuroni coniugati in migrazione.Trasferire l'inserzione della membrana con una sezione selezionata in una piastra di vetro da 50 millimetri di diametro contenente due millilitri di mezzo di coltura per sezioni. Posizionare la piastra nella camera climatica del microscopio confocale. Impostare la risoluzione a 512 per 512 pixel.Aumentare la velocità di scansione da 400 hertz a 700 hertz per incrementare la frequenza dei fotogrammi da circa 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo. Utilizzare al massimo un'acquisizione media su due volte. Definire uno stack Z attraverso la regione elettroporata con un incremento di 1,5 micrometri.Avviare la serie time-lapse acquisendo uno Z-stack ogni 30 minuti. Le impostazioni descritte consentono una risoluzione e una luminosità dell'immagine sufficienti, mantenendo al contempo bassi i danni fotoindotti durante l'acquisizione. Questo filmato mostra neuroni corticali di E16.5 in migrazione dalle zone ventricolari subventricolari alla lamina corticale.In transgenici condizionali Bcl11a floxed dopo elettroporazione del plasmide di controllo IRES-GFP al giorno embrionale 14,5. Il filmato è composto da 108 fotogrammi con una velocità di cinque fotogrammi al secondo. La barra della scala rappresenta 100 micron.L'elettroporazione di un vettore plasmidico di DNA contenente Cre-IRES-GFP ha alterato la migrazione dei neuroni corticali nei cervelli condizionali con Bcl11a floxed. Come mostrato qui, pochissimi neuroni si spostano oltre la zona intermedia per raggiungere la lamina corticale. Questo filmato mostra la polarizzazione dei neuroni corticali di un controllo marcato con GFP a sinistra, rispetto ai neuroni di un mutante per Bcl11a a destra.Queste tracce animate di controllo rappresentative nei neuroni mutanti per Bcl11a sono state ottenute da serie a intervalli di tempo di colture di tessuto fetale a E16.5 con risoluzione di un'ora. Ancora una volta, i dati provenienti dal cervello di controllo sono mostrati a sinistra e quelli provenienti dal cervello elettroporato con Cre-IRES-GFP sono mostrati a destra. Come evidenziato da questo insieme di tracce rappresentative provenienti da colture di tessuto di controllo e mutanti per Bcl11a, i neuroni mutanti per Bcl11a attraversano frequentemente fasi ripetitive di ridotta velocità di migrazione e variazioni casuali dell'orientamento, indicate dalle frecce rosse.I profili di velocità possono essere calcolati da tracce di neuroni in migrazione. Come mostrato qui, una proporzione maggiore di neuroni mutanti per Bcl11a presenta velocità di migrazione più lente rispetto ai controlli. L'angolo di deviazione può essere calcolato dai dati delle tracce.Come si può osservare da questo istogramma, i neuroni mutanti per Bcl11a, rappresentati dalle barre nere, mostrano angoli di deviazione maggiori rispetto ai controlli. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore ciascuna per l'elettroporazione in utero e la preparazione della coltura organotipica di fette cerebrali. Questa procedura può essere facilmente adattata per eseguire l'analisi funzionale di geni di interesse in neuroni corticali in migrazione radiale mediante esperimenti di overespressione o silenziamento genico, nonché esperimenti vascolari.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare direttamente i neuroni in migrazione radiale in colture organotipiche di sezioni preparate da cervelli embrionali elettroporati mediante microscopia confocale a scansione temporale.

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Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l'imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Qui presentiamo un protocollo che fornisce uno strumento per esaminare i meccanismi di regolazione di geni specifici durante lo sviluppo dell'ippocampo. L'impiego dell'elettroporazione ex utero e della coltura organotipica di fette consente l'up- e down-regolazione dell'espressione di geni di interesse in singole cellule e segue il loro destino durante lo sviluppo.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri l'imaging confocale dei neuroni migranti in colture di fette organotipiche di cervello embrionale di topo usando l'elettroporazione in utero. Questo metodo permette di analizzare la velocità e la direzione della migrazione neuronale in tempo reale.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando In Utero Elettroporazione (Video) | JoVE Journal

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