Name: ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶショウジョウバエの島アッセイによる歩行行動の高スループット解析法。自動画像処理で運動障害関連遺伝子や薬剤スクリーニングを効率的に行い、神経科学研究に応用できます。

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我々 は、ウィーンショウジョウバエリソースやショウジョウバエ系統を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センター (NIH P40OD018537) を認めます。島アッセイ セットアップを構築するため島の試金し、Martijn Eidhof に私たちを導入するための Klämbt 研究所に感謝しております。本研究は E 珍しい 3 共同国境を越えた電話でサポートされている一部の許可「常染色体優性劣性 ataxias 療法の準備」科学的研究 (NWO) のため、オランダの組織からトップの助成金 (912-12-109) によって準備 (NWO 9003037604)2 DCN/Radboud 大学医療センター博士フェローシップ。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

このプロトコルでは、島のアッセイ中ショウジョウバエモーター動作を定量的に評価「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロについて説明します。マクロは、正確に高感度・運動の欠陥の定量的高スループット評価に適した島アッセイを行う時間をかけてのプラットフォームでハエをカウントします。方法論により、任意の条件の比較のためハエ薬曝露を含む、異なる遺伝的または環境条件下で栽培できます。この読み出しは運動障害のショウジョウバエモデルと他の神経疾患を勉強して大きな遺伝的または医薬品の画面を実行するとき、または歩行またはフライトを調べる検出ツールとして特に有用、します。動作です。
この原稿で示される島の試金プロトコルは、既存/代替方法上の利点を提供します。たとえば、ビデオ追跡歩行ははるかに時間がかかり、大規模なサンプル サイズのテストには適して。島の試金は高スループット スクリーニング ツールをあり、この意味で、迅速な対話型負走 (リング) アッセイ16に匹敵します。2 つの違いは、広範な運動の問題を検出するため島の試金ができます。降壇するハエの無力は、ジャンプ、飛行中の欠陥によって生じるまたはによる歩行行動特性 (筋肉・神経) の翼や脚 (筋肉・神経) の欠陥。その一方で、リング アッセイは登山歩行動作脚 (筋肉・神経) 欠陥によって引き起こされる欠陥を評価します。に備えてユーザー複数行動読み出しに興味を持っている、島アッセイはリング法などの他のアッセイでも簡単に結合できます。さらに、光遺伝学に必要なレーザーは島のアッセイでは、簡単にインストールできるし、セットアップがとても簡単なそれすることができます簡単に温度と光を制御できる部屋に移動すること。
成功とここで説明島アッセイの再現性を確保するため、いくつかの推奨事項に従ってください。因数と転送実験にハエは CO2か風邪麻酔の影響を避けるために実験の前に少なくとも 1 日でバイアルします。実験バイアルを満杯になるか (バイアルあたり 10-15 ハエを使用; バイアルあたりハエの数が同じを常に配置するが最適です)。生鮮食品にハエを保つため、すべての回で。そうでない場合はまだアッセイを行うに精通して、収率を最大限にプラットフォームに飛ぶ練習を投げます。また手をすぐに取り消し、練習データの解析 (画像解析と画像の手が後にのみ開始をカウントのフライ) と干渉する、その後、右します。環境・実験の条件を比較する必要がある実験で同一に保つ (異なった年齢でテスト対変異または遺伝子型のコントロールなど)。常に同じ時刻で実験を実行し、制御温度と湿度の条件の下でバイアルを維持します。統計的検出力の生物あたり、少なくとも 3 つの技術的なレプリケートをテストします。
説明するマクロのパフォーマンスの成功を確保するためここでは、ウェブカメラとイメージの設定する必要があります調整する最大コントラストを達成するために: 飛ぶ白いプラットフォーム上の黒のオブジェクトとして表示されます。マクロでハエの数を適切にカウントされないときのコントラストの設定を調整、投資収益率が選択が適切かどうかを確認、プラットフォームにおけるハエのサイズが指定した最小値以上であることを確認サイズの設定 (このプロトコルの手順 8.3 参照) を飛ぶ。設定は一度定義するだけです。彼らは、ウェブカメラとプラットフォーム間の距離が変更されない限り、すべての実験に適用されます。Circularity_min と最大の設定を定義、粒子の真円度 (粒子カウント ハエを =) 分析のために考慮するが表示されます (飛ぶカウントが設定されたオブジェクトを =)。1 は完全な円を表し、0 行17。ハエは、循環 (ハエは直線として表示できません) のある程度を常に存在、ので"Circularity_max"設定が 1 で、"Circularity_min"設定が 0.4 で。それはユーザーがこれらの設定を調整する必要があることはできません。
マクロ時折ミス カウント時にハエがプラットフォームの国境近くに位置しています。これは、ユーザー定義の投資収益率のうち徒歩がハエが飛ぶことができない場合に発生します。ほとんどの場合、投資収益率 (プラットフォームに可能な限りそれをフィッティング) を再度選択することによってこの問題が解決する簡単にできます。しかし、「島の試金分析」スクリプトを検出することが、投資収益率を比較的よくウォーキング ハエによる正しい不適切なデータ数。ここで紹介するウェブカメラの解像度が十分に高い近接かなりよくハエを差別するが実施して追加アルゴリズム「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロの画像処理手順のよう、流域関数17をむしばむと。これらはプラットフォームに近接しているハエの適切な描写を促進します。加えて、マクロはプラットフォームから飛び降りまたはそれから離れて飛んでいるハエを区別することができます。それにもかかわらず、健康な若い飛ぶ系統も飛んで古いや歩行の赤字蠅プラットフォームに長く残ると最終的に跳ぶか、またはプラットフォームから落ちるに対し、プラットフォームにドロップしたら直ちにが一般的に観察されます。これらの制限にもかかわらずアッセイと分析は、行動の非常に正確な測定を提供します。
「島の試金分析」スクリプトのパフォーマンスの成功を確保するため、ユーザーがプロトコルで指定されるスクリプト行で入力と出力ファイルの正しいパスを入力すると (示されるように適切なフォルダー形式でデータを提供するかどうかを確認するには図 2)。ユーザーにあまりにも厳しい信頼性の低い実験データをフィルター処理するための条件が検出された場合 (行 68:「数」の列の最初の値が 5 未満; 71 行:「数」の列の最初の値は、プラットフォーム上でスローされたハエの数の合計より高いrm +3) オフ行 68 と 71「島の試金分析」スクリプトでテキスト前に # 追加することによってこれらフィルターの設定。この場合、すべてのデータセットは、分析されます。また、フィルターの設定は、行 68 とユーザーのニーズによると 71 の値を調整することによって変更できます。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロによって生成された"results.txt」のカウント値の可能な成果物も手動で調整することができ、、調整後のデータでスクリプトを再実行することができます。10 fps 以上、または 10 以上の処理中のユーザーの関心とデータの s、「島の試金分析」スクリプトによって処理されるフレーム数が調整します。統計解析は、ユーザー定義の代わりに置き換えることができます。
「例島アッセイは、」島の試金を使用して取得した画像時系列の例を含むをという名前のフォルダーは、次の web サイトで見つけることができます: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。「例島アッセイ」フォルダーをダウンロードし迅速に徹底、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」で画像の処理のファイル ストレージの構造このプロトコルで説明されている手順に従ってくださいスクリプトです。
島アッセイ毛細血管拡張性運動失調のショウジョウバエモデルの異常な挙動を定量化して評価で開発したマクロの分析] スクリプトと組み合わせてを使用できます。アッセイは、様々 な年齢層に効率的に適用できます、ので、表現型の潜在的進歩的な性質を分析する適しています。
「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」スクリプトと組み合わせて島アッセイは要約すると、客観的に分析し、の自発の欠陥を定量化する費用対効果、信頼性、および効率の高いアッセイショウジョウバエ高スループット方法で運動障害のモデル。

脳 (例えば、小脳性運動失調とパーキンソン病)、末梢神経の変性疾患が根底にある遺伝子の同定に、近年、次世代シーケンシング技術の進歩が大きく貢献してください。(例えば、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺) の起源と筋の起源 (例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー)1,2,3,4.それにもかかわらず、これらの疾患のほとんどの根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られています。治療法の開発には、これらのメカニズムの理解が欠かせません。
人間のようにフライトやショウジョウバエ、歩行などのモデル生物の動きは、中央脳、末梢神経系と筋肉によって制御されます。さらに、高速生成時間とショウジョウバエの遺伝のツールボックスを作るこのモデル生物遺伝子の高スループット スクリーニングに適して関与運動障害、薬物検査の5,6.このような画面は、信頼性が高く、コスト効率の高いと相対的なシンプルなアッセイとして自動化された方法で出力結果を定量化するためのツールでテストする必要がある条件のかなりの数のため、非常に望ましい。
シュミットら(2012 年)7 「島の試金」と呼ばれる低コスト テストを説明したショウジョウバエの歩行動作を評価します。島アッセイがグリア細胞に固有の機能と7、ショウジョウバエモデル知的障害8との一般的な評価のための評価の遺伝子を識別するために正常に大規模な上映で使用されてモーター動作9を飛ぶ。島の試金の原則の設計は、いくつかのハエのスローを高架のプラットフォームで構成されます。これは健全なハエのプラットフォームから秒以内に脱出することができる生得的な運動行動を誘導します。アッセイは、時間7,8,9以上のプラットフォームで残りのハエの数を測定します。これらすべての機能は、島アッセイが運動障害に関与する遺伝子の強力なスクリーニング ツールであることを示します。
現在、撮影島アッセイ データの量的分析は7、8,9を手動で行われます。アッセイの効率を向上させる、半自動的にプラットフォームからハエのエスケープを定量化する低コストの方法を開発しました。セットアップ上のプラットフォームでのハエの数を定量化する一連のフレームを持つ、プラットフォームの取得ごとに 0.1 s. フレームは「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで処理して画像時間を収集するためにノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラを使用してください。時間。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロは 3 つの独立したサブ マクロに分かれています: (I)「作成スタックと投影」サブのマクロは別々 のサブフォルダーに格納されている別の島実験を識別し、スタックとそれぞれの投影を作成しますタイム シリーズ。(II)「定義プラットフォーム」サブ マクロが連続して利益 (率 ROI) の領域として島式ホームを手動で定義するその時点でユーザーが要求される個々 実験サブフォルダーにあるすべての"Projection_image_name.tif"ファイルを開きます。(III)「分析」は、自動的にプラットフォームで残りの時間シリーズ間ハエ数を定量化します。連続 (実行) でサブのマクロを実行できるまたは独立。統計的データ解析のための治療および遺伝子型動作お互い (図 1) と大幅に異なるかどうかを決定する統計テストを適用して自動的に得られたデータを処理するスクリプトが開発されました。最後に、(AT) 失調症毛細血管拡張症ショウジョウバエモデルの異常な運動能力を定量化して評価このセットアップが使えることを示した。

<table><tbody><tr><td>25 x 95 mm Drosophila vials</td><td>Flystuff</td><td>32-116SB-Logitech</td><td></td></tr> <tr><td>C525 HD Webcam</td><td>Logitech-USB</td><td></td><td>接続のある任意のウェブカメラが適しています。</td></tr><tr><td>ウェブカメラを保持するスタンド</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-ランプ</td><td>-</td><td>-</td><td>12 V LEDライトが適切です</td></tr><tr><td>ドキドキパッド</td><td>-</td><td>-</td><td>任意のマウスパッドが機能します</td></tr><tr><td>アイランドアッセイボックス</td><td>-</td><td></td><td>寸法40x35x2.5 cm、穴20x30 cm。 透明。</td></tr><tr><td>アイランドアッセイバス</td><td>-</td><td>-</td><td>寸法42x38x25 cm。</td></tr><tr><td>アイランド/プラットフォーム</td><td>-</td><td>-</td><td>寸法42x38x25 cm。</td></tr><tr><td>石鹸</td><td>-</td><td>-</td><td>標準的な食器用洗剤が適しています。</td></tr><tr><td>コンピュータ</td> <td>-</td><td></td> <td>スクリプトは Windows と Mac の両方で実行されます</td></tr><tr><td>画像記録ソフトウェア: HandiAvi&reg;</td><td>AZcendant&reg;</td><td>-</td><td>HandyAviはWindowsとのみ互換性があり、原稿全体を通して説明されています。http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html(バージョン5.0)</td></tr><tr><td>画像記録ソフトウェア:WebcamCapture</td><td>-</td><td>-</td><td>MacでHandyAviの画像記録に代替して使用でき、ダウンロードできるFiji / ImageJプラグイン:https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ この方法を使用する場合、ユーザーはこの原稿に示されているのと同じフォルダ設定と画像記録設定を使用する必要がありますが、それぞれについて例外がありますexperimental replicateの場合、キャプチャされた画像スタックは、対応する実験的なレプリケートフォルダーにStack.tiffとしてエクスポートする必要があります。このデータで "Drosophila Island Assay" マクロを実行すると、"First frame identifier" 設定にテキストは存在しません。</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>-</td><td>-</td><td>バージョン 1.4 以降、 からダウンロード可能:https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td></tr><tr><td>R studio</td><td>-</td><td>-</td><td>からダウンロード可能:</td></tr><tr><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ R</td><td>-</td><td>-</td><td>バージョン3.3.2、ダウンロード可能:https://cran.rstudio.com</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

次世代シーケンシング技術の進歩は、運動障害の増加速度で他の神経学的な病気 (候補者) 疾患遺伝子の同定に貢献します。しかし、少しはこれらの疾患の根底にある分子メカニズムについて知られています。キイロショウジョウバエの遺伝、分子のおよび行動のツールボックスは、このモデル生物を高スループット方法で新しい病気の遺伝子のメカニズムを特徴付けるに特に便利になります。それにもかかわらず、高スループットの画面を理想的には、これらの疾患に関連する形質の自動化の定量化を可能にする、コスト効率の高い効率的かつ信頼性の高いアッセイが必要です。島の試金は費用対効果と簡単にセットアップ方法ショウジョウバエの歩行動作を評価します。このアッセイでハエはプラットフォーム上に固定の高さからスローされます。これは、プラットフォームから秒以内に脱出する飛ぶことができる生得的な運動反応を誘導します。現在、撮影島アッセイの定量分析は、手動で行うが、大画面を実行する場合は特に骨の折れる作業であります。
この原稿では、高スループット、自動データ処理島アッセイ データの定量化に「ショウジョウバエ島アッセイ」と「島の試金分析」のアルゴリズムについて説明します。セットアップでノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラは試金の実行はプラットフォームのイメージのシリーズを収集します。フィジーのオープン ソース ソフトウェアの開発「ショウジョウバエ島アッセイ」アルゴリズムは、これらイメージ シリーズを処理し、、実験条件ごと時間の経過と共にプラットフォーム ハエ数を定量化。自動的に得られたデータを処理し、治療および遺伝子型が統計的に有意に異なるかどうかを計算します、「島の試金分析」スクリプト、フリー ソフトウェア R と互換性が開発されました。これは大幅島アッセイの効率を向上させ、基本的な歩行や飛行行動の強力な読み出しになります。それはこうして調査飛ぶ運動能力運動障害と薬効のショウジョウバエモデルの大型スクリーンに適用できます。

説明プロトコル、ショウジョウバエ島アッセイ データが取得され、3 つの手順で処理されます。まず、ショウジョウバエ島式ホーム上にスロー フライト脱出応答がウェブカメラを記録、個々 の .bmp 画像 (プロトコル セクション 1-7) として格納されます。第二に、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ (手順 8) 処理"result.txt"テキスト ファイル(表 1)、要約する各フレームで検出されたオブジェクトの数を生成するフレームと画像のスタックを表わす「Result_stack.tiff」各フレームで、プラットフォームの領域内で検知されたオブジェクト。第三に、「島の試金分析」スクリプト (プロトコル セクション 9) は、個々 の実験「results.txt」ファイルに格納されているマクロ データを処理します。いくつかの手順は、フィルター処理および統計分析のためのデータを結合するスクリプトに組み込まれています。プラットフォームにハエがスローされます最初のフレームは、検出され、時間ポイント 1 として考慮されます。以前のフレームは、データセットから削除されます。次の時間 100 フレーム ポイント 1 (10 に対応する s) 分析対象として選択されます。ハエはプラットフォームの検出数の初期値 5 より小さい実験自動的に、パワー不足の実験から信頼性の低い結果を排除すること、分析から除外されます。プラットフォーム上に検出されたハエ数の初期値が「バイアルあたりハエの数」設定プラス 3 の許容範囲を超えている実験も除外されます。これは、ノイズの粒子はハエとして誤って検出されたデータセットを排除します。スクリプトは、ハエ ハエ シリーズの検出の最高数と比較して各時間ポイント検出の割合を計算します。投資収益率 (時間上プラットフォーム上にハエの割合の増加に続いて減少として検出される) ウォーキング ハエによるデータセット内のエラーが自動的に訂正によってそれらに関する以前の段階でプラットフォームに一貫して存在として.特定の実験条件のメイン ディレクトリに存在していたすべてのレプリケート データセットを結合して"data_all_conditions.csv"ファイルにエクスポートします。その列は、表 2に示す変数を表します。スクリプトは、データを含むフォルダー名に従って名前、各実験条件の線グラフもエクスポートされます。このグラフは、ハエを用いた実験 (飛行エスケープ応答) を時間をかけて残りのプラットフォーム上の % 複製(図 3 aのそれぞれのフォルダーに存在を示していますB)。平均、SD、実験条件ごとに SEM で計算され「統計 summary.csv"ファイルにまとめます。線グラフを"Escape_response_all_conditions.tiff"と呼ばれる応答を示しています平均飛行脱出まで 12 の実験的(図 3)のメインのフォルダーに存在する条件。最後に、メインのフォルダーにあるすべての実験条件の曲線下面積は計算され"AUC.csv"ファイルにまとめます。メイン フォルダーに存在の条件の数によってはスクリプトを披露するか 2 尾対ウェルチ t 検定 (2 条件) またはテューキー補正 ANOVA 多重検定 (以上 2 条件) を決定するかどうか実験条件は、お互いから大幅に異なります。これらの結果は"Welch_t-test_results.txt"または"AUC_anova_results.txt"にまとめて分散を実行すると、スクリプトはまた平均 AUC の差との比較実験の条件の 95% 信頼区間を表示する"AUC_anova.tiff"ファイルをエクスポートします。すべての実験条件の実験的複製の曲線の下の絶対領域の値は、"AUC.tiff"(図 3 D) の中央値で個々 のデータ ポイントとして表示されます。
失調症毛細血管拡張症 (AT) は、14失調症毛細血管拡張症変異 (ATM) の遺伝子の突然変異による小脳失調症の発症によって特徴付けられる常染色体優性劣性運動障害です。ATM、 tefu、ショウジョウバエの細胞の突然変異体は、モビリティと長寿の15の欠陥を表示します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを評価するには、ATショウジョウバエモデルを島の試金のテストし、手動でデータ カウント マクロのデータ出力を比較しましたしました。そのユビキタスtefuを示したノックダウン (w-;Actin-Gal4/GD11950)自分の遺伝的背景のコントロール (w-; に比べてプラットフォームを残してこれらのはえの能力が大幅に減少Actin-Gal4/+) (図 4).1 後 s、コントロール ハエの 50% は、対照的に、プラットフォームを逃れていた、&#60; tefuの 1%-RNAi 飛ぶ。忠実にマクロで得られたデータがカウント マクロが島アッセイ データの定量化と動き欠陥(の評価に使用することができます信頼性の高いツールであることを示すマニュアルによって得られたデータを再現する重要なは、図 4A ・ B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
図 1: 要件、実験の手順、および島の試金の分析の概要を示すフローチャート。(A) 島アッセイ装置。(B) 島の試金のための実験装置。(C) 島の試金します。(D)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで島アッセイ データの処理します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ、3 サブ マクロで構成されます: 1) スタックと投影を作る、2) 定義するプラットフォーム、および 3) 分析。(E) 処理と「島の試金分析」スクリプトを使用してデータの統計的評価。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
図 2: プロトコルの中に必要なさまざまな調整の例です。(A) 必要なディレクトリ構造がどの島でアッセイ実験をデータ処理および分析のため保存必要があります。(B) ハエが表示する必要があります、ビデオ設定を調整するとき白地に黒。(C) 画像フレームの出力ファイル本稿で説明する画像記録ソフトウェアによって保存されます。(D) 黄色のアウトラインは、プラットフォームの選択を示しています。「ROI マネージャー」でストアドのプラットフォームの選択は、青色で強調表示されます。(E) ハエは「最小飛ぶサイズ設定」の調整中の白い点として表されます結果ウィンドウは、ピクセル単位でハエの領域を示しています。(F) 事例 (右側)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた結果の画像のスタックに対応するフレーム (左側) 単一の記録された画像フレーム。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
図 3:「島の試金分析」スクリプトでデータ処理後に得られる結果画像(A) 行ごと飛行脱出の応答を示すグラフ制御実験複製。(B) 線各 tefu RNAi 実験複製の飛行脱出の応答を示すグラフします。(C) 平均飛行エスケープ応答実験条件を示されている;誤差範囲を表す曲線分布制御と変異条件の下の領域を表す SEM. (D) ドット プロット。Tefu RNAi とコントロールの両方の条件の実験的複製は、中央分離帯 (赤い線) (黒) で個々 のデータ ポイントとして表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
図 4: ユビキタスtefuノックダウン ハエはプラットフォームを残す能力の大幅低下を示しています。データ コントロール (w-; (s) 時間をかけてプラットフォームにおけるハエの % を表すActin-Gal4/+) と tefu RNAi (w-;Actin-Gal4/GD11950) 飛ぶ。(複製の数 = 5; 誤差範囲を表す SEM)。(A)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られる生データ。(B) ドット プロット曲線分布「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた制御および tefu RNAi 条件の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p &#60; 0.01)。(C) 生データは手動で 1 秒あたりの島に現在ハエの数をカウントすることによって得られます。(D) ドット プロット カーブ コントロール Tefu RNAi 条件手カウントすることによって得られた分布の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p &#60; 0.01)。誤差範囲を表す SEM<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名</td>
			<td colspan="3">説明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スライス</td>
			<td colspan="3">フレームの名前。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>カウント</td>
			<td colspan="3">フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内で検出されたオブジェクトの数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総面積</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均サイズ</td>
			<td colspan="3">フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内のオブジェクトの数で割った値で検出されたオブジェクトの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 領域</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) の総面積に対してオブジェクトによって占有されている領域の割合です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim。</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総周長。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分飛ぶサイズ</td>
			<td colspan="3">最低限は飛ぶ (単位: ピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義したサイズ設定です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROI の領域</td>
			<td colspan="3">サブのマクロの実行中に、ユーザーが定義したプラットフォーム (ROI) の領域 (単位: ピクセル) プラットフォームを定義します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ハエの数</td>
			<td colspan="3">「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: パラメーター「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで測定。この表で説明されているパラメーターが「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを実行する時に"results.txt」ファイルで表示されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名</td>
			<td colspan="3">説明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スライス</td>
			<td colspan="3">フレーム番号。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>カウント</td>
			<td colspan="3">ハエ検出 (率 ROI) プラットフォームの限界内のフレームの数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">ピクセルの (ROI) プラットフォームの限界内のフレームに検出されたハエの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分飛ぶサイズ</td>
			<td colspan="3">最低限飛ぶサイズ エントリ設定 (単位はピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義されています。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROI の領域</td>
			<td colspan="3">「プラットフォームの定義」サブのマクロを実行するときに、ユーザーが定義したプラットフォーム (ピクセル単位で、投資収益率) の領域。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ハエの数</td>
			<td colspan="3">「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% 飛ぶハエの実験中にプラットフォーム上で検出された数の最大値を基準にしてそれぞれのスライス/フレームのプラットフォーム上に存在。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">1 の時点を表し分析する最初のフレーム、ハエがプラットフォーム上で最初表示フレームに対応します。分析あたり 100 フレームの合計がある (10 に対応する s、説明されている設定を使用する場合。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>実験</td>
			<td colspan="3">1 つの条件複製の数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>条件</td>
			<td colspan="3">(ユーザー定義のデータを含むフォルダーの名前) によると実験条件の名前を示します。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2:「島の試金分析」スクリプトを使用してデータを処理して得られた変数の説明この表に記載されているパラメーターは、「島の試金分析」スクリプトによるデータ処理時に"data_all_conditions.csv"ファイルに表示されます。

島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Island Assayの全体的な目標は、自動データ処理と客観的定量化により、Drosophila melanogasterの基本的な運動行動を評価することです。この方法は、運動障害に関与する遺伝子など、自発運動行動の主要な調節因子を特定するために使用できます。このような欠陥を元に戻す可能性のある薬物の試験に使用できます。この手法の主な利点は、ショウジョウバエの自発運動行動をハイスループットで定量化できるため、この手法は大規模なスクリーニングに適していることです。私たちは、多数の疾患モデルを解析できるように、この方法論を開発することにしました。これを実現するためには、自動化された画像データ分析が必要でした。この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に役立ちます。ベータ処理のいくつかのステップは非常に重要であり、新規ユーザー、特に使用中のソフトウェアパッケージに慣れていないユーザーにとっては難しい場合があります。まず、生物学的複製として実験条件ごとに最低3つのバイアルを準備します。各ファイルには、同じ性別で年齢が近い約 15 匹のハエが含まれている必要があります。重要なのは、ハエは無傷の翼を持っていなければならないということです。実験を保存するフォルダーを作成します。これらは、条件とレプリケートによって定義されたディレクトリ構造に生成します。たとえば、実験に 2 つの遺伝子型があり、それぞれに 5 回の反復がある場合は、実験の日付を含むメインフォルダーを作成し、そのフォルダー内に遺伝子型ごとに 1 つのサブフォルダーを作成します。次に、遺伝子型フォルダー内に、各レプリケートのサブフォルダーを作成します。次に、テスト装置をセットアップします。少量の石鹸を入れた冷水をバストレイに加え、プラットフォームをバスの中央に配置します(まだバスに固定されていない場合は)。トレイとプラットフォームを透明なボックスで覆います。プラットフォームを照らすには、通常の12ボルトLEDなどの冷却ランプをその上に配置します。また、Webカメラをコンピューターに接続してプラットフォームの真上に配置します。パソコンで、画像記録ソフトウェアを開きます。メニューシステムから、キャプチャデバイスとして適切なWebカメラを選択します。島にデッドフライを置いて、ビデオ設定を調整します。ソフトウェアの明るさ、コントラスト、色を微調整して、死んだハエが白い背景に対して黒く見えるようにします。次に、タイムラプスムービーの設定を調整して、ムービーをAVIファイルとして保存します。次に、データを保存するディレクトリを参照し、ムービーの名前を定義します。これらの変更を保存します。画像データの圧縮には、Intel IYUV コードを選択します。録画速度を0.1秒ごとに1フレームに設定し、対応する再生速度を1秒あたり10枚に調整します。最後に、詳細設定に移動し、キャプチャしたフレームごとにbmp画像を作成するを選択します。次に、AVIファイルのホストとして選択したのと同じディレクトリを参照し、[OK]を押します。始める前に、島が空できれいであることを確認してください。次に、画像記録ソフトウェアのタイムラプス画像インターフェースで録画を開始します。ハエの入ったバイアルを取り、2〜3回軽くたたいて、すべてのハエを底にノックダウンします。次に、バイアルからプラグをすばやく取り外し、フライをプラットフォームに強くたたきます。それらはすべてほぼ同時にプラットフォームにぶつかるはずです。フライがプラットフォームを離れるまで最大30秒待ってから、録音を停止します。必要に応じて、プラットフォームから残っているハエを手動で取り除きます。次の実験に進む前に、次のデータ セットを格納するディレクトリを必ず再定義してください。最初のタスクは、収集された画像シリーズのスタックと投影を生成することです。フィジーで、Drosophila Island Assayを開きます。新しいウィンドウで、最初の画像時系列識別子を入力します。次に、スタックと投影の作成サブマクロのみを選択します。[OK]をクリックし、個々のIsland Assay実験を含むすべてのサブフォルダを含むフォルダにコンピュータを移動します。データの処理後、2つの新しいファイルが個々の実験サブフォルダに表示されます。次のタスクは、画像内のプラットフォームの正確な位置を定義することです。グラフィカルインターフェイスを開き、[Define platform] チェックボックスをオンにします。次に、実験的なサブフォルダが保存されているディレクトリを選択します。投影画像と2つのウィンドウが開きます。最初の画像では、ポリゴン選択ツールを使用して、島のプラットフォーム上にポリゴンを描画します。この選択には、プラットフォームのパラメータにある境界線を含めないでください。ROI マネージャー ウィンドウで [追加] をクリックして、選択内容を [ROI マネージャー] ウィンドウに追加します。ROI マネージャーに選択を追加すると、一連の値として表示されます。次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックします。ソフトウェアは、フォルダに保存されている次の投影画像に進みます。ROI マネージャーに保存されている ROI を選択し、プラットフォームの定義ウィンドウでこの ROI を確認して、プラットフォームの同じ ROI を次の投影画像に引き続き適用します。次の投影画像に進む前に、実験中にプラットフォームが動かなかったことを確認してください。プラットフォームの位置が移動した場合は、選択範囲の中央を左クリックし、必要な位置にドラッグします。選択ボックスがプラットフォームと一致しない場合は、選択の外側を左クリックし、ポリゴン ツールを使用してプラットフォームの新しい選択を描きます。この新しい選択を ROI マネージャーに追加します。次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックして新しい選択を確認し、すべてのイメージがプラットフォームを適切に定義するまで手順を続けます。データを処理する前の最後のタスクは、フライの最小サイズを定義することです。これはテキストプロトコルで説明されています。プラットフォームから逃げるハエを定量化するには、まず、最小のフライサイズを設定します。次に、実験シリーズ内のファイル内のハエの最大数を示します。analyze 関数を開始し、プロンプトで実験のメインディレクトリを選択します。マクロの実行後、新しい結果ファイルと新しいイメージ スタックが各フォルダに表示されることに注意してください。これらのファイルを開いて、手順が正しく機能していることを確認します。RまたはRStudioソフトウェアパッケージを起動し、Island Assay分析スクリプトを開いて、すべての実験を同時に処理します。解析を成功させるには、スクリプトを正しく編集する必要があります。スクリプトの 16 行目に、分析する実験を含むメイン ディレクトリへのパスを挿入します。解析出力ファイルを保存するフォルダーへのパスを 19 行目に挿入します。後者は、解析する画像データを含むディレクトリとは異なる場所である必要があります。次に、ツールバーからスクリプトを実行し、結果の分析を続行します。スクリプトIsland Assay analysisは、各実験条件の折れ線グラフをエクスポートします。グラフは、その条件の複製ごとに、時間の経過とともにプラットフォームに残っているハエの割合を示しています。エクスポートされた折れ線グラフ escape response:all conditions は、メイン フォルダーに存在する最初の 12 の実験条件の平均飛行脱出応答の平均誤差と標準誤差をまとめたものです。各実験反復の曲線下面積は、実験条件が互いに有意に異なるかどうかを判断するために計算されます。各実験条件の曲線下面積と中央値はグラフとしてエクスポートされます。メイン フォルダに存在する条件の数に応じて、スクリプトは 2 つの条件に対して両側の不対応 Welch T 検定を実行するか、2 つ以上の条件に対して 2 つのキー補正を持つ分散分析を実行します。スクリプトIsland Assay解析によって計算されたすべての数値データもエクスポートされ、データ出力フォルダにcsvまたはtxtファイルとして保存されます。毛細血管拡張性運動失調症は、ATM遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性運動障害です。この疾患は、小脳性運動失調の早期発症を特徴としています。ATMのハエオルソログをユビキタスにノックダウンする効果をIsland Assayで調べ、対照と比較しました。全体として、ハエATMオルソログであるTefuのユビキタスノックダウンは、遺伝的バックグラウンドコントロールと比較して、Island Assayの自発運動能力を有意に低下させました。記録されたIsland Assayデータの手動分析では、自動分析と同じ結果が得られました。このビデオを見れば、Island Assayの実行方法、Drosophila Island Assayマクロの実行方法、Island Assay分析スクリプトの操作方法について十分に理解できるはずです。このプロトコルを試行する際には、画像セグメンテーションの品質が映画の品質と相関していることを覚えておくことが重要です。コントラストが優れているほど、分析は滑らかになります。開発後、この技術は、研究者がショウジョウバエの運動能力をハイスループットで探求する道を開きます。このアッセイを使用した後、ジオタクシスが陰性であることを示すアッセイなど、他のアッセイを使用して、自発運動障害をさらに調査することができます。

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法

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