Name: Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Impara a identificare quantitativamente i componenti del microambiente tumorale nelle resezioni di glioblastoma utilizzando immunistochimica cromogenica e ImageJ. Questo metodo permette di determinare i rapporti cellulari fisiologicamente rilevanti nei campioni dei pazienti.

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Gli autori ringraziano i dottori. Fahad Bafakih e Jim Mandell per l&#39;acquisizione e l&#39;identificazione di campioni di pazienti, Garrett F. Beeghly per l&#39;assistenza con immunohistochemistry e il Biorepository and Tissue Research Facility, il Centro di Histologia del Centro Cardiovascolare e l&#39;Analisi Biomolecolare presso l&#39;Università di Virginia per assistenza L&#39;acquisizione di campioni, l&#39;immunohistochemistry e l&#39;imaging.

Questo protocollo identifica i componenti cellulari in campioni embedded (FFPE) fissati in formalina, come è tipico per i campioni pazienti clinici bancati. L&#39;incorporazione di paraffina consente la migliore manutenzione della morfologia cellulare e del tessuto, nonché la migliore longevità delle sezioni. I campioni utilizzati per questa analisi sono stati raggiunti attraverso l&#39;Università di Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. I campioni pazienti sono stati selezionati da un neuropatologo basato su una diagnosi definitiva di glioblastoma (astrocitoma, grado IV dell&#39;OMS) che aveva completato resezione tumorale presso l&#39;Università di Virginia tra il 2010 e il 2013 e sono stati identificati prima di questa analisi 11 . 1. Depaffinazione e reidratazione del campione FFPE NOTA: Questa parte del protocollo è specifica per i campioni FFPE. Mentre i campioni embedded con paraffina possono essere più utili per questa analisi a causa della conservazione cellulare e tEmettere morfologia, questa analisi può anche essere fatta con sezioni congelate. Se si usano sezioni congelate, questa parte può essere omessa e procedere direttamente all&#39;immunohistochemistry cromogenico. <ol><li> Eseguire le lavaggi seguenti per 5 min ciascuno: Xilene, Xilene, 100% etanolo, 100% etanolo, 95% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, acqua deionizzata, acqua deionizzata </li></ol> 2. Recupero di antigeni NOTA: Questa parte del protocollo è necessaria per rompere ponti di metilene formati durante la fissazione di formalina di campioni FFPE e di esporre siti antigene per gli anticorpi da legare. <ol><li> Diluire la soluzione di antigene a pH elevato a base di Tris a raccomandazione del produttore in acqua distillata. </li><li> Eseguire il recupero di antigeni mediato dal calore utilizzando un forno a microonde. Basta anche altre forme di recupero a temperature termiche (come la pentola a pressione, il vapore vegetale o l&#39;acqua bollente). <ol><li> Aggiungere la soluzione diluita a messa a punto in un microfono non sigillatonave. Posizionare le diapositive nella vasca. Posizionare le diapositive in forno a microonde. </li><li> Bollite per 20 minuti ad alta potenza. Controllare i livelli liquidi per l&#39;evaporazione e ricostituire con acqua distillata come necessario. </li></ol></li><li> Lasciare raffreddare i campioni in soluzione per 1 ora a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Immunohistochemistry cromogenico <ol><li> Estrarre il campione di tessuto con una penna idrofoba per ridurre al minimo il volume di reagenti necessari per coprire il campione. NOTA: Assicurarsi di mantenere i campioni di tessuto idratati e non lasciarli asciugare, in quanto ciò influirà sull&#39;efficacia della colorazione. </li><li> Pipettare la soluzione di permeabilizzazione sufficiente (soluzione salina a tampone Tris (TBS) + 0.01% Triton-X) per coprire il campione di tessuti (tipicamente circa 100 - 200 μL). </li><li> Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.2. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente con soluzione di blocco (2,5% cavallo di cavallo + soluzione di permeabilizzazione). </li><li> Incubare i campioni durante la notte in 4 ° C con anticorpi primari diluitiNella soluzione di blocco. NOTA: Tutti gli anticorpi primari utilizzati qui sono diluiti a 1: 200, ma le diluizioni ottimali possono essere determinate usando diluizioni seriali a partire dalla raccomandazione del produttore. Informazioni dettagliate sugli anticorpi utilizzati in questo protocollo sono stati precedentemente pubblicati 11 . </li><li> Rilevare gli anticorpi primari utilizzando un reattore di polimero perossidasi a base di rafano corrispondente all&#39;animale primario di anticorpi, seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Pipetta la soluzione permeabilizzazione sufficiente per coprire il campione di tessuto e incubare per 5 min. </li><li> Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.7. </li><li> Incubare le diapositive in 0,3% di H 2 O 2 in 1x TBS per 15 minuti. </li><li> Sviluppare campioni con un substrato perossidasi diaminobenzidina (DAB) per 2 - 10 minuti fino a raggiungere la desiderata intensità della macchia. </li><li> Contrassegnare campioni per identificare nuclei cellulari, come ad esempio l&#39;ematossilina, seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Campioni di deidrato con 100%Etanolo e xilene. </li><li> Montare i campioni in modo permanente con i supporti di montaggio. </li></ol> 4. Identificazione delle regioni d&#39;interesse <ol><li> Slide di immagini sotto microscopia luminosa in grado di immagini ad alta risoluzione. NOTA: utilizzare i componenti cellulari di imaging con una risoluzione minima di 20x. </li><li> Spostare la fotocamera a determinate aree di interesse in tutti i campioni di tessuto. </li><li> Salvare le immagini come file TIFF per la quantificazione. </li></ol> 5. Analisi delle immagini <ol><li> Apri le immagini in ImageJ per la quantificazione della copertura percentuale. </li><li> Utilizza il plugin di Threshold Color per rimuovere il colore viola dai nuclei colorati da ematossilina. </li><li> Convertire l&#39;immagine a 8 bit. </li><li> Aggiungere soglia senza sfondo scuro. </li><li> Immagine di processo usando uno dei 17 filtri di soglia ImageJ preimpostati ( cioè MaxEntropy), quindi solo le porzioni macchiate DAB sono incluse nella soglia. NOTA: Selezionare il filtro soglia ottimale preimpostato che minimizzaInclusione della colorazione di fondo. Ciò può dipendere dalla qualità della colorazione e dalla specificità dell&#39;anticorpo. Utilizzare la stessa soglia per tutte le repliche tecniche all&#39;interno di ciascun campione del paziente. </li><li> Applica la soglia. </li><li> Misura l&#39;area percentuale di immagine soglia. </li><li> Copertura area percentuale media per più regioni all&#39;interno di ciascun campione. </li></ol>

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</ol>

Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l&#39;analisi dei campioni istologici macchiati usando l&#39;immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell&#39;eterogeneità associata ai tumori...

Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un&#39;invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima 1 , 2 . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile 2 , 3 , 4 . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l&#39;invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggiosa 5 , tuttavia poco si sa circa i complessi meccanismi che contribuiscono all&#39;invasione GBM. Il microambiente del tumore, o il tessuto che circonda il cancro, è stato implicato nella progressione dei tumori nei tumori multipli 6 , 7 . Il microambiente del tumore di glioblastoma, in pArticolare, è relativamente poco caratterizzato ed è univoco complesso, composto da cellule gliali multipli, come astrociti, microglia e oligodendrociti, così come matrice extracellulare, fattori solubili e fattori biofisici. Sperimentalmente, gli astrociti e la microglia sono stati dimostrati per aumentare la progressione dell&#39;loma e l&#39;invasione 8 , 9 , 10 , ma la composizione di tutte le cellule gliali nel cervello umano nativo microambiente è sconosciuta. Abbiamo precedentemente mostrato che i componenti microambientali possono prevedere la sopravvivenza del paziente analizzando quantitativamente i componenti cellulari del microambiente glioblastoma e incorporando le nostre analisi in un modello di rischio proporzionale 11 . Qui descriviamo il metodo di analisi quantitativa per identificare le popolazioni delle cellule gliali all&#39;interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale del paziente glioblastomaS. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. La valutazione della percentuale di copertura crea una misurazione semplice per determinare le differenze morfologiche delle cellule, in particolare quelle colpite dalle interazioni con le cellule tumorali. Precedenti studi per la quantificazione della colorazione istopatologica usano la colorazione standard come l&#39;ematoxilina e l&#39;eosin 12 o il tricromo 13 di Masson, che non approfittano della specificità della colorazione immunohistochemica a base di anticorpi. Il nostro metodo è stato sviluppato per quantificare direttamente le popolazioni gliali nelle resezioni tumorali del paziente glioblastoma, che intendiamo utilizzare per chiarire il microambiente complesso di glioblastoma.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>di smascheramento dell'antigene ad alto pH</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td><td></td><td></td><td></td>di cavallo</tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Proteina specifica anti-oligodendrociti1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-capra</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universale (anti-topo/coniglio)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT Substrato DAB</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina controcolorante</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Supporti di montaggio</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products</td><td>International 195506</td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemia quantitativa del microambiente cellulare in riapplicazioni del glioblastoma paziente

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all&#39;interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all&#39;interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.

Per questa analisi sono state identificate due regioni di interessi all&#39;interno delle nostre rese tumorali - la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composta principalmente da tessuti sani con cellule tumorali invasive diffuse ( Figura 1A , 1B ) - sono stati identificati collaborando neuropatologi con pazienti affetti da ematossilina ed eosina campioni. All&#39;interno di ogni campione di pazienti è stata identificata una colo...

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.

Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare in modo quantitativo i componenti del microambiente tumorale nei campioni resecati da pazienti con glioblastoma, utilizzando l'immunohistochimica cromogenica e il software ImageJ. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del microambiente tumorale, come l'aspetto di questi componenti nei campioni provenienti da pazienti e come determinare rapporti cellulari fisiologicamente rilevanti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella sua semplicità di analisi applicata ai campioni provenienti da pazienti. Le implicazioni di questa metodica riguardano la chiarificazione del complesso microambiente tumorale dell'glioblastoma, attualmente poco caratterizzato.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché il tempo di sviluppo cromogenico deve essere attentamente monitorato per evitare uno sviluppo eccessivo e la saturazione del tessuto. Iniziare il protocollo eseguendo i lavaggi specificati nel protocollo testuale allegato. Diluire la soluzione di svelamento dell'antigene a base di tris ad alto pH e acqua distillata seguendo le raccomandazioni del produttore.Passare quindi al recupero dell'antigene mediato dal calore aggiungendo la soluzione di svelamento diluita in un contenitore microondeabile non sigillato. Posizionare i vetrini nel contenitore. Successivamente, inserire il contenitore con i vetrini nel microonde. Successivamente, portare a ebollizione il contenitore per 20 minuti a potenza elevata. Monitorare i livelli del liquido per verificarne l'evaporazione e rabboccare il contenitore con acqua distillata secondo necessità. Lasciare raffreddare i campioni in soluzione per un'ora a temperatura ambiente.Delimitare il campione di tessuto con una penna idrofoba per ridurre al minimo il volume di reagenti necessari per coprire il campione. Quindi, aggiungere con una pipetta una quantità sufficiente di soluzione di permeabilizzazione, da 100 a 200 microlitri, per coprire il campione di tessuto. Rimuovere e scartare la soluzione, quindi ricoprire nuovamente il campione di tessuto con la soluzione di permeabilizzazione.Incubare i campioni a temperatura ambiente con la soluzione di blocco per un'ora. Successivamente, incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius con gli anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco. Il giorno seguente, rilevare gli anticorpi primari utilizzando un reagente polimerico di perossidasi di rafano piccante corrispondente all'animale ospite dell'anticorpo primario.Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di permeabilizzazione per coprire il campione di tessuto e incubare il campione per cinque minuti. Rimuovere e scartare la soluzione, quindi ricoprire nuovamente il campione di tessuto con la soluzione di permeabilizzazione per altri cinque minuti. Incubare i vetrini in perossido di idrogeno al 0,3% e TBS 1X per 15 minuti.Sviluppare i campioni con un substrato di perossidasi diaminobenzidina o DAB per due-dieci minuti, fino al raggiungimento dell'intensità di colorazione desiderata. Controcolorare i campioni per identificare i nuclei cellulari, ad esempio con ematossilina seguendo il protocollo del produttore. Disidratare i campioni con etanolo al 100% e xilene.Infine, montare in modo permanente i campioni con un mezzo di montaggio. Due aree di interesse all'interno delle nostre resezioni tumorali, la massa principale del tumore e le regioni adiacenti, composte principalmente da tessuto sano con cellule tumorali invasive diffuse, sono state identificate dal neuropatologo collaboratore su campioni di pazienti colorati con ematossilina ed eosina. L'immunohistochimica cromogenica ha rivelato una colorazione positiva per astrociti, microglia e oligodendrociti in ciascun campione di paziente.Abbiamo eseguito la colorazione senza anticorpo primario come controllo negativo. Il produttore ha consigliato ulteriori diluizioni prima di stabilire la diluizione 1:200, in quanto ha fornito una colorazione positiva ottimale del corpo cellulare e dei prolungamenti, minimizzando al contempo il fondo per l'anticorpo anti-ALDH1L1. Utilizzando ImageJ, è stata quantificata la percentuale di area coperta dalla colorazione degli oligodendrociti positivi per OSP-1, al fine di confrontare eventualmente le differenze nelle nostre regioni di interesse.Una volta applicata la soglia appropriata all'immagine, è possibile misurare e confrontare la percentuale di copertura derivata dalla soglia per più pazienti. Sono state confrontate cinque regioni adiacenti e cinque regioni massicce di campioni di pazienti con glioblastoma o GBM, insieme a tessuto cerebrale sano, per la percentuale di copertura della proteina specifica per oligodendrociti uno o OSP1. Una volta acquisita padronanza, la tecnica di colorazione può essere eseguita in quattro ore il primo giorno e due ore il secondo giorno, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di monitorare attentamente l'intensità della colorazione del tessuto e l'idratazione.

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Fonte: Núñez, F. J., et al. Valutazione dei biomarcatori nel glioma mediante immunoistochimica su colture di neurosfere di glioma 3D incluse in paraffina. J. Vis. Exp. (2019). Questo video mostra una tecnica immunoistochimica per l'etichettatura di biomarcatori tumorali nelle neurosfere tumorali cerebrali incluse in paraffina. Le sezioni della neurosfera subiscono la rimozione e la reidratazione della paraffina, seguite da un trattamento per esporre i siti dei biomarcatori. Gli anticorpi...

Colorazione immunoistochimica di biomarcatori in sezioni di neurosfera tumorale cerebrale

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Presentiamo un metodo per replicare il microambiente tumorale del glioma nella parte anteriore invasiva che incorpora il flusso di liquido interstiziale. Questo modello è un idrogel di acido ialuronico I in un inserto di coltura tissutale in cui è possibile applicare una testa di pressione del fluido. L'invasione può essere quantificata e le cellule possono essere isolate o lisate.

Un modello fotopolimerizzabile di acido ialuronico-collagene del microambiente di glioma invasivo con flusso interstiziale

Questo protocollo ha preparato con successo tessuto neovascolare di alta qualità sufficiente da campioni di glioma utilizzando microdissezione a cattura laser per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale, superando i limiti degli studi che tradizionalmente si concentrano principalmente sui fattori angiogeni e fornendo un profilo proteomico su larga scala dell'angiogenesi del glioma.

Preparazione di tessuti neovascolari da tessuti gliomatici umani per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale

Impara a identificare quantitativamente i componenti del microambiente tumorale nelle resezioni di glioblastoma utilizzando immunistochimica cromogenica e ImageJ. Questo metodo permette di determinare i rapporti cellulari fisiologicamente rilevanti nei campioni dei pazienti.

Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

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