Name: Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Découvrez une méthode pour évaluer les effets des bactériocines sur le microbiote intestinal des souris. Cette technique permet d'analyser l'équilibre des populations bactériennes et leurs impacts physiologiques sur l'hôte.

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Les auteurs souhaitent remercier la mobilité coordonnée de chercheurs de l&#39;EEE Grant NILS Science et Sustainability Coordination (référence 017-ABEL-CM-2013). CB et GP-M. Ont été soutenus par la subvention AGL2015-70487-P du ministère espagnol de l&#39;Économie et de la Compétitivité. OCOU et DBD ont été soutenus par un programme de bourses stratégiques pour la recherche en sciences alimentaires de l&#39;Université norvégienne des sciences de la vie (projet NMBU) (projet 1205051025). Nous souhaitons également remercier Inmaculada Noguera pour son aide aux soins et à l&#39;échantillonnage des animaux et à Jésus Dehesa pour son aide pour assurer la disponibilité de matériel de laboratoire dans l&#39;établissement d&#39;élevage. Nous apprécions également le professeur Lars-Gustav Snipen pour ses conseils sur les statistiques.

Les soins et la manipulation doivent être effectués dans une unité spécialisée de soins des animaux. Les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d&#39;éthique correspondant de l&#39;Université de Valence et les autorités locales, conformément aux principes de la protection des animaux de laboratoire obligatoire par le droit de l&#39;Union européenne et 2010/63 / UE et le gouvernement espagnol RD 53/2013 sur la protection des animaux Utilisé à des fins scientifiques, afin de respecter le principe 3R dans l&#39;expérimentation animale (remplacement, réduction, raffinement). 1. Cultures bactériennes congelées utilisées pour inoculer des souris <ol><li> Inoculer des souches individuelles de LAB dans 5 mL de milieu de perfusion cérébrale et coeur (BHI) et les cultiver pendant 20 à 24 h (nuit) à 30 ° C. </li><li> Diluer chaque culture bactérienne pendant la nuit 100 fois dans BHI en transférant 2 ml de culture pendant une nuit à 200 ml de BHI. Cultivez-les à 30 ° C pendant 20 à 24 h. NOTE: Les souches utilisées dans cette étude sont listées dans le tableau 1. </li><li> RécolteLls par centrifugation à 5 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et laver les cellules deux fois en suspendant chaque pastille cellulaire dans 100 ml de solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS) et en recueillant les cellules comme à l&#39;étape 1.3. </li><li> Après le deuxième lavage, suspendre chaque pastille cellulaire dans 20 ml de glycérol à 15% glacé dans du PBS. </li><li> Aliquotez la suspension de cellules dans des volumes de 1 ml dans des tubes, puis rangez-les à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. REMARQUE: Les cellules doivent être utilisées dans un délai de 1 à 2 mois après ce point. </li><li> Déterminer le numéro de cellule avant le stockage et avant l&#39;administration de sorte que le nombre de cellules vivantes données à la souris soit connu. <ol><li> Pour le comptage des cellules, faites des dilutions séquentielles en dix fois dans une solution glacée de chlorure de sodium (NaCl) glacée à 0,9%. Répartir 100 μL de chaque dilution sur une plaque d&#39;agar BHI. Incuber de nuit (20 à 24 h) à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies, ce dernier pour déterminer les unités formant des colonies (cfu) / mL. </li></ol></li><li> Pour produire de l&#39;eau potable contenant des bactéries, diluer les cellules de chaque culture bactérienne dans 100 ml d&#39;eau potable stérile et filtrée, avec une UFC moyenne finale de 10 9 ml d&#39;eau. Pour l&#39;évaluation de la survie bactérienne, compter les cellules vivantes juste après la dilution et après 24 h une fois par semaine pendant les deux premières semaines de traitement bactérien. </li></ol> 2. Test de souris et conception expérimentale Note: Des souris femelles jeunes adultes BALB / c exemptes de pathogènes spécifiques (SPF) (6 à 8 semaines) sont nécessaires pour cette expérience; Ici, un total de 100 animaux ont été achetés. <ol><li> Fournir aux souris un accès gratuit aux aliments et à l&#39;eau granulés tout au long de l&#39;expérience. </li><li> Concevez l&#39;expérience et calculez la puissance. <ol><li> Si chaque traitement a son propre contrôle, appliquez une conception de cas-témoins appariés (test t). Utilisez un essai préliminaire pour calculer l&#39;erreur moyenne et standard des effets les plus importants à déterminer. </Li&gt; <li> Optimiser la puissance de l&#39;analyse et le nombre d&#39;animaux nécessaires par groupe en utilisant différentes méthodes et programmes disponibles gratuitement 11 . </li><li> Pour tester les effets des souches de producteurs de bactériocines par rapport aux souches non productrices, utilisez 9 animaux par état expérimental. REMARQUE: Ce nombre a été déterminé en fonction de l&#39;erreur standard expérimentale et a fourni une puissance satisfaisante (0,7 - 1,0) et un niveau de signification inférieur à 0,05. NOTE: Dans l&#39;exemple donné, 11 groupes de souris ont été fabriqués, un par cage. Dix cages correspondaient aux traitements avec 5 souches productrices de bateriocines et les 5 souches 5 non-productrices isogènes correspondantes; La 11ème cage avait 10 souris et constituait le contrôle non traité. </li></ol></li><li> Après l&#39;arrivée des souris dans les installations d&#39;élevage, distribuez-les dans des cages et étiquettez les animaux pour permettre le suivi individuel. Acclimater les souris aux installations et aux conditions d&#39;élevage pendant une semaine avant pEn cours de route. </li><li> Préparez l&#39;eau potable contenant des bactéries, comme décrit à l&#39;étape 1.8, et placez les bouteilles d&#39;eau potable dans les cages indépendantes correspondantes qui sont clairement identifiées de sorte que les souris dans chaque cage partagent la même bouteille d&#39;eau. REMARQUE: Le groupe de contrôle doit être conservé dans une cage séparée, sans contact avec les bactéries testées. </li><li> Préparez une nouvelle bouteille avec de l&#39;eau potable fraîche (100 mL) tous les jours et ajoutez des suspensions bactériennes fraîchement décongelées. Faites ceci pendant 15 jours consécutifs. </li><li> Suivez le traitement des bactéries avec une période de deux semaines, période pendant laquelle les souris boivent de l&#39;eau sans bactéries ( figure 1 ). </li></ol> 3. Collecte d&#39;échantillons <ol><li> Recueillir des échantillons de matières fécales. <ol><li> Préparez des cages autoclavées (vides) et des pinces stériles et écrivez des tubes stériles de 1,5 mL pour chaque souris. </li><li> Recueillir des échantillons au même moment de la journée pour éviter les variations de la composition de microbiota au cours deLe cours d&#39;une journée. Pour des résultats optimaux, collectez les échantillons frais séparément. REMARQUE: De préférence, rassemblez les excréments tôt le matin, lorsque les souris ont tendance à déféquer spontanément. </li><li> Nettoyez une cage vide avec 70% d&#39;alcool et placez une souris à l&#39;intérieur. Laissez-le déféquer et collectez 2 à 4 boulettes fécales à l&#39;aide de pinces stériles, en les plaçant dans des tubes de 1,5 mL. REMARQUE: Parfois, il suffit de maintenir la queue de la souris vers le haut; Les selles peuvent ensuite être collectées directement de l&#39;anus dans un tube. </li><li> Recueillir des échantillons fécales de chaque souris une fois par semaine durant l&#39;expérience de quatre semaines ( Figure 1 ). Recueillir les premiers échantillons au premier jour (T0, temps zéro), juste avant l&#39;exposition des souris aux bactéries. Recueillir les échantillons de matières fécales suivants aux jours 7, 14, 21 et 28. </li><li> Réfrigérer les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;à leur transport au laboratoire, où ils sont congelés à -80 ° C. Planifiez d&#39;avance et fournissez suffisamment de boîtes de stockage, en tant que grand nombre de feDes échantillons de cal seront recueillis au cours de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Pesez toutes les souris toutes les semaines le jour de la collecte des matières fécales. </li><li> Recueillir des échantillons de sang de la veine du visage de toutes les souris au 15 e jour, le dernier jour d&#39;administration de bactéries, et déterminer les taux de triglycérides, de cholestérol total, de lipoprotéines de haute densité (HDL) et de lipoprotéines de basse densité (LDL) sérum sanguin. NOTE: Le personnel expérimenté devrait collecter le sang pour réduire le stress chez les animaux. </li></ol> 4. Activité de comptage LAB et Bacteriocin <ol><li> Pesez une pastille fécale de chaque échantillon dans un tube de 1,5 ml et ajoutez un volume adéquat de 0,9% de NaCl glacé pour obtenir une solution à 10% (p / v). Utilisez des micropères stériles pour des tubes de 1,5 mL pour homogénéiser la suspension fécale et préparer des dilutions en série à dix fois dans du NaCl 0,9% glacé. </li><li> Comptez le nombre total de cellules LAB. <ol><li> Transférer les cellules diluées (100 μL) à 4 mL de Ma préchaufféeN Rogosa Sharpe (MRS) gélose molle (50 ° C, gomme 0,8%). Mélanger en vortex avant de verser les cellules sur une plaque de gélose MRS solide (1,5% d&#39;agar). </li><li> Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d&#39;incuber les cellules pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies. </li></ol></li><li> Comptez les cellules productrices de bactériocines. <ol><li> Transférer des cellules diluées (100 μL) du producteur de bactériocine à 4 mL d&#39;agar MRS pré-humidifié (50 ° C, 0,8% d&#39;agar), mélanger par vortexage et verser les cellules sur une plaque de gélose MRS (agar 1,5%); Cette couche est appelée la première couche. </li><li> Transférer encore 4 ml d&#39;agar MRS sans gélose (0.8% d&#39;agar) sur la première couche pour intégrer toutes les cellules dans la gélose molle. NOTE: Cette couche est destinée à empêcher les cellules de se développer en tant que colonies à la surface des plaques d&#39;agar. Les cellules qui poussent à la surface sont facilement déplacées lors du versement des cellules indicatrices sur le dessus (étape 4.3.4) etCompliquera donc l&#39;interprétation des résultats. Cette couche est appelée deuxième couche. </li><li> Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d&#39;incuber pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies. </li><li> Pour identifier les colonies productrices de bactériocines, mélanger 40 μL d&#39;une culture pendant une nuit d&#39;une souche indicatrice appropriée, comme indiqué dans le tableau 1 , avec 4 mL d&#39;agar doux préchauffé. Verser le mélange sur la plaque; Cette couche est appelée la troisième couche. </li><li> Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d&#39;incuber pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies. NOTE: Les colonies productrices de bactériocines ont des zones claires (inhibition) autour des colonies ( figure 2 ). </li></ol></li></ol> 5. Extraction d&#39;ADN, amplification d&#39;ADNr 16S et séquençage REMARQUE: Étapes fOu l&#39;extraction d&#39;ADN sont décrits pour l&#39;utilisation d&#39;un kit commercial ( p. Ex. Kit Realpure &quot;SSS&quot;). <ol><li> Suspendre 1 à 2 boulettes de souris fecales (~ 200 mg) dans 300 μL de solution de lyse. </li><li> Transférer l&#39;échantillon sur un microtube de 2 mL dans lequel environ 0,5 g de perles de verre (diamètre: 0,1 mm) ont déjà été placés. </li><li> Ajouter 1 μL de mutanolysine à 10 U / μL et 2 μL de lysozyme à 20 mg / mL à chaque échantillon et incuber à 37 ° C pendant 40 à 60 min. Procédez avec l&#39;un des protocoles standard pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons de matières fécales 12 . </li><li> Appliquer deux cycles d&#39;étapes de perlage, 1 minute chacun. </li><li> Ajouter 2 μL de proteinase K et bien mélanger. </li><li> Incuber pendant 20 min et vortex toutes les 5 min. </li><li> Refroidir les échantillons à 37 ° C et ajouter 1 μL de RNase A 5 μg / mL à l&#39;échantillon. Bien mélanger. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 à 60 min. </li><li> Refroidir les échantillons à température ambiante et ajouter 180 μLDe la solution de précipitation des protéines. Vortex vigoureusement à la vitesse maximale pour 20 à 30 s. </li><li> Centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min. S&#39;il y a des particules flottant dans le surnageant, incuber les échantillons dans de la glace pendant 5 min, puis centrifuger à nouveau. </li><li> Transférer le surnageant contenant l&#39;ADN à un nouveau microtube contenant 1,5 ml contenant 300 μl d&#39;isopropanol. </li><li> Mélanger en inversant les tubes 20 à 30 fois et incuber pendant 1 h à -20 ° C. Alternativement, incuber les tubes pendant plus longtemps ( p. Ex., Pendant la nuit). </li><li> Centrifuger à 16 000 xg pendant 2 min. </li><li> Retirer le surnageant et sécher le tube sur du papier absorbant. Ajouter 300 μL d&#39;éthanol à 70% pour laver le culot d&#39;ADN. </li><li> Centrifugez à 16 000 xg pendant 1 min, retirez le surnageant et laissez le culot sécher pendant environ 15 min. </li><li> Une fois que la pastille est sèche, ajouter 100 μl d&#39;eau stérile ou Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) de tampon et remettre à nouveau en suspension la pastille. </li><li> Pour éliminer tout inhibiteur possibleComposés pendant les étapes suivantes, nettoyer l&#39;ADN. Mélanger l&#39;ADN extrait avec 2 volumes (200 μL) de NTI tampon pour ajuster les conditions de liaison pour l&#39;étape 5.15. </li><li> Placez une membrane de silice contenant une colonne de nettoyage par PCR dans un tube de collecte (2 mL) et chargez l&#39;échantillon. </li><li> Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Laver la membrane de silice avec 700 μL de tampon NT3 et répéter l&#39;étape 5.16. </li><li> Sécher la membrane de silice par centrifugation pendant 1 min à 11 000 xg pour éliminer tout tampon de lavage contenant de l&#39;éthanol résiduel NT3. </li><li> Transférer la colonne à un nouveau microtube de 1,5 ml et incuber pendant 2 à 5 minutes à 70 ° C pour l&#39;élimination totale de l&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 30 μL d&#39;eau de qualité PCR et incuber pendant 5 min à 70 ° C. Eluir par centrifugation pendant 1 min à 11 000 x g. </li><li> Quantifier l&#39;ADN en utilisant un spectrophotomètre UV / Vis ou une méthode fluorométrique. </li><li> Normaliser et regrouper les échantillons d&#39;ADN des souris partageant la même cage à l&#39;e<html> Point de temps ch. </li><li> Pour observer les variations individuelles pendant le temps, échantillons d&#39;ADN séquentiels de trois souris sélectionnées au hasard du témoin et deux autres cages aléatoires aux jours 0, 14 et 28. </li></ol> 6. Amplification et séquençage des gènes ARS 16S <ol><li> Préparez une bibliothèque de gènes d&#39;ARNr 16S amplifiés. Amplifier la région V3-V4 du gène bactérien 16S rRNA 5 en utilisant des amorces avant et inversées avec des adaptateurs de surplomb appropriés: 5&#39;-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 &#39; 5&#39;-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 &#39; </li><li> Vérifier les bandes amplifiées en utilisant une électrophorèse avec 1% de gel d&#39;agarose. </li><li> Nettoyer les produits de réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant des billes magnétiques pour la purification par amplicon. </li><li> Procédez comme indiqué par le fabricant selon la plate-forme de séquençage massive utilisée&gt; 6. </li></ol> 7. Analyse des données et statistiques <ol><li> Filtrage de qualité (généralement effectué dans les installations de séquençage). <ol><li> Filtrer les données de lecture brutes et dé-multiplex en utilisant le logiciel fourni avec l&#39;équipement. </li><li> Traitez les lectures en fin d&#39;utilisation en utilisant le pipeline UPARSE 13 implémenté dans USEARCH 14 (version 7.0.1090). Fusionnez les extrémités appariées et appliquez un filtrage de qualité en utilisant une valeur maximale d&#39;erreur attendue (maxee) de 1.0. Jeter des séquences inférieures à 150 nt. Déterminer les séquences pour éliminer les singletons. </li><li> Cluster les séquences en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) sur une identité de séquence de 97% et utiliser UCHIME 15 pour filtrer des séquences chimériques. </li></ol></li><li> Choix de l&#39;OTU, affectation taxonomique et reconstruction phylogénétique, et analyses et visualisations de la diversité. <ol><li> Traiter les OTU en utilisant Quantitative Insights IntO Écologie microbienne (QIIME) 16 . </li><li> Choisissez et alignez les OTU représentatives contre la base de données de base de Greengenes 17 en utilisant PyNAST 18 avec une identité minimale de 75% (par défaut). </li><li> Assignez une taxonomie aux séquences alignées en utilisant le programme classificateur de base de données ribosomique (RDP) 19 avec une confiance de 0.8. </li><li> Normaliser la table OTU au compte séquentiel de l&#39;échantillon avec la profondeur de séquence la plus basse. </li><li> Construire un arbre phylogène à partir de séquences alignées en utilisant Fast Tree 20 après l&#39;étape de filtration afin d&#39;éliminer les régions et les positions très variables qui présentent toutes les lacunes. Utilisez cet arbre pour calculer les diversités alpha et bêta et pour calculer les courbes de raréfaction et les indices de Shannon. </li><li> Pour générer et visualiser des métriques de distance UniFrac non pondérées 21 , utilisez la principale analyse de coordonnées (PCoA). REMARQUE: pour sAnalyse statistique, différents logiciels peuvent être utilisés, tels que R 22 ou les outils statistiques mis en œuvre dans QIIME 16 . </li><li> Pour la comparaison des indices de Shannon de la diversité entre les différents traitements, utiliser un ANCOVA, considérant le temps comme variable dépendante continue dans R. </li><li> Comparez les distances entre les traitements dans PCoA dans QIIME en utilisant un test t de Student en deux faces et calculez les valeurs p non paramétriques avec 1000 permutations de Monte Carlo à l&#39;aide de la correction Bonferroni. </li><li> Analyser les corrélations entre l&#39;abondance relative des OTU spécifiques et d&#39;autres paramètres mesurés, tels que les taux sériques de cholestérol, HDL, LDL, etc. , en utilisant l&#39;analyse de corrélation de Pearson. À cette fin, utilisez CoNet 23 avec la visualisation ultérieure des réseaux de corrélation à l&#39;aide de Cytoscape 3.1.1 24 . </li></ol></li></ol>

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<li>Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Continuing+Story+of+Class+IIa+Bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins.</a> Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La procédure décrite ici a été utilisée pour déterminer si les changements dans le microbiote sont liés à la santé ou à l&#39;âge. Différentes parties du protocole sont importantes, mais parmi celles-ci, l&#39;échantillonnage des excréments, le choix du fragment d&#39;ADN pour être séquencé et analysé, et l&#39;analyse de l&#39;extraction de l&#39;ADN et de l&#39;analyse bioinformatique pourraient certainement être les points les plus critiques. L&#39;échantillonnage est crucial car, pour des raisons éthiques, les souri...

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par une large gamme d&#39;espèces bactériennes 1 , 2 . Ces composés et leurs producteurs, en particulier LAB, ont été explorés et exploités dans le monde entier pendant des décennies pour leurs applications potentielles dans la conservation des aliments et la médecine 3 . Plusieurs bactériocines sont connues pour tuer les pathogènes importants, y compris les espèces de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus et Bacillus . Certaines bactériocines ont même la capacité de moduler la réponse immunitaire 4 . De nombreuses bactériocines ont des spectres relativement étroits, une propriété qui est très appréciée dans certaines applications. Par exemple, certaines bactériocines à spectre étroit peuvent être utilisées pour diriger une activité spécifique contre des groupes sélectionnés de bactéries problématiques, sans beaucoup de perturbation sur la flore commensale ou bénéfique partageant la même niche; Ceci est particulièrement essentiel dans l&#39;environnement intestinal, Où de nombreux microbes bénéfiques prospèrent de manière interactive et dynamique 5 . Les bactériocines sont également très attrayantes pour une utilisation prophylactique ou probiotique, car elles peuvent supprimer la croissance des agents pathogènes, des pathobionts ou des bactéries opportunistes qui peuvent déséquilibrer l&#39;homéostasie intestinale 6 , 7 . En termes de nature et de propriétés physicochimiques, les bactériocines sont très diverses, car elles ont des structures différentes, des spécificités cibles, des modes d&#39;action, etc. La plupart des bactériocines ont été étudiées très en détail dans des milieux in vitro , mais très peu ont été testés dans les aliments Les matrices 8 , 9 ou in vivo, telles que dans un intestin d&#39;animal 6 , 10 . Les propriétés in vitro peuvent différer dans une grande mesure lorsqu&#39;elles sont évaluées in vivo en raison de la complexité oF l&#39;environnement intestinal et aussi à des effets involontaires putatifs sur les bactéries bénéfiques. La plupart des probiotiques sont LAB. Ils produisent une gamme d&#39;autres métabolites, y compris les acides gras à chaîne courte, qui influent sur la physiologie de l&#39;hôte, ainsi que pour démontrer les propriétés antimicrobiennes envers certaines bactéries. Par conséquent, dans le cas des souches probiotiques qui produisent des bactériocines, il est préférable d&#39;établir des analyses réalistes, comme des animaux sains avec un microbiota normal. Dans la présente étude, nous fournissons une stratégie qui permet d&#39;évaluer l&#39;effet de différentes souches productrices de bactériocines, dont les bactériocines ont des spectres inhibiteurs différents, sur des souris saines. Notre stratégie comprend l&#39;alimentation de souris avec des mutants isogènes non bactériociniques, ce qui permet de différencier les effets médiés par la bactériocine des effets induits par la bactériocine. Le séquençage du 16S rDNA permet de suivre les changements dynamiques de la population bactérienne dans l&#39;intestin. SubsUne analyse statistique équitable déchiffre les corrélations entre les espèces bactériennes et aussi entre les espèces bactériennes et les paramètres physiologiques mesurés ( p. Ex., Poids corporel, paramètres biochimiques sériques, etc. ). Nous croyons que le protocole présenté dans cette étude s&#39;applique également à d&#39;autres applications probiotiques ou prébiotiques au-delà de l&#39;étude des bactériocines chez les animaux vivants.

<table><tbody><tr><td>Souris Balb/c (femelles)</td><td>Harlan</td><td></td><td>Les souris doivent être âgées de 6 à 8 semaines Boîte de</td></tr><tr><td>Pétri en plastique</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon d’infusion cerveau-cœur</td><td>Conda</td><td>1400.00</td><td></td></tr><tr><td>Gélose bactériologique européenne</td><td>Pronadisa</td><td>1800.00</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Pronadisa</td><td>8010.00</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampon TAE</td><td>Thermo Scientific</td><td>15558042</td><td></td></tr><tr><td>MRS bouillon</td><td>Difco</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimés</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB602-S</td><td></td></tr><tr><td>pince stérile</td><td>Levantina de Laboratorios S.L.</td><td>260-3710014</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Hermle</td><td>Z383K</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>AppliChem Panreac</td><td>121659.1211</td><td></td></tr><tr><td>Realpure SSS</td><td>Kit Real Life Science Solutions, Durviz, Espagne</td><td>RBME04 (300 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>131090.1611</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>131086.1214</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genomics, USA</td><td>A63881 (60 ml)</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCta NGS library quantification</td> kit <td>Quanta BioSciences, Maryland, USA</td><td>733-2300</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs MiSeq v3</td><td>Illumina, San Diego, Californie, États-Unis</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>Amorces pour l’amplification</td><td></td><td></td> du gène de l’ARNr 16S <td>Les amorces contiennent la région V3-V4 du gène de l’ARNr bactérien 16S et des adaptateurs de surplomb Illumina :5'-TCG TCG GCA TCA GAT GTG TAT AAG CAG CAG ACG GGN GGC WGC AG-3' ET 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit</td><td></td> d’indices <td>FC-131-1002</td><td>Indices et adaptateurs de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>Micropilon pour tubes de 1,5 mL, Eppendorf / Sigma , Ref.</td><td>Sigma</td><td>Z317314-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Billes de verre, 0,1 mm de diamètre</td><td>Biospec Products</td><td>11079-101</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et kit de nettoyage PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International Inc.</td><td>19-040</td><td></td></tr><tr><td>mutanolysine</td><td>Sigma</td><td>M9901-10KU</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Des questions très intriguantes se posent avec notre connaissance approfondie de la composition des microbiotes intestinaux et de la relation avec la santé, en particulier en ce qui concerne les facteurs qui contribuent au maintien de l&#39;équilibre de la population. Cependant, il existe des méthodologies disponibles limitées pour évaluer ces facteurs. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par de nombreuses bactéries qui peuvent conférer un avantage concurrentiel pour l&#39;acquisition d&#39;aliments et / ou l&#39;établissement de niche. De nombreuses souches probiotiques de bactéries lactiques (LAB) ont un grand potentiel pour promouvoir la santé humaine et animale en empêchant la croissance de pathogènes. Ils peuvent également être utilisés pour l&#39;immuno-modulation, car ils produisent des bactériocines. Cependant, l&#39;activité antagoniste des bactériocines est normalement déterminée par des essais biologiques de laboratoire dans des conditions bien définies mais simplifiées par rapport à l&#39;environnement intestinal complexe chez les humains et les animaux, où les bactéries sont confrontées à des influences multifactorielles de l&#39;hôte et des centaines d&#39;espèces microbiennes sHaring le même créneau. Ce travail décrit une procédure complète et efficace pour évaluer l&#39;effet D&#39;une variété de bactériocines avec différentes spécificités cibles dans un système murin. Les changements dans la composition de microbiota au cours du traitement par la bactériocine sont surveillés à l&#39;aide du séquençage d&#39;ADNr 16S de composition. Notre approche utilise à la fois les producteurs de bactériocines et leurs mutants isogènes non productifs de bactériocines, ce dernier permettant de distinguer les modifications liées à la bactériocine liées aux modifications du microbiota liées à la bactériocine. L&#39;extraction de l&#39;ADN fécale et les méthodes de séquençage de l&#39;ADNr 16S sont cohérentes et, conjointement avec la bioinformatique, constituent une procédure puissante pour trouver des changements faibles dans les profils bactériens et pour établir des corrélations, en termes de concentration de cholestérol et de triglycérides, entre les populations bactériennes et les marqueurs de santé. Notre protocole est générique et peut donc être utilisé pour étudier d&#39;autres composés ou nutriments susceptibles de modifier le micro hôteRobiota composition, soit lors de l&#39;étude de la toxicité ou des effets bénéfiques.

La production de bactériocines a été considérée comme une caractéristique probiotique positive dans LAB, car il a été supposé empêcher la croissance de bactéries opportunistes et pathogènes. Le but de ce travail était de montrer la capacité des bactériocines à moduler les populations de microbiota intestinales dans un modèle de souris. À cette fin, une procédure a été développée pour comparer l&#39;effet de l&#39;absorption de souches productrices de bactériocines et de leurs souches iso...

On pense que les bactériocines jouent un rôle clé dans la définition de la diversité microbienne dans différentes niches écologiques. Ici, nous décrivons une procédure efficace pour évaluer comment les bactériocines affectent la composition de microbiota intestinal dans un modèle animal.

Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'influence des bactériocines sur la composition du microbiote intestinal à l'aide d'un modèle murin. Cette méthode permettra de déterminer l'effet réel des bactériocines provenant de probiotiques sur l'équilibre délicat des populations bactériennes dans l'intestin. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'analyse de paramètres physiologiques afin de déduire les effets globaux sur l'organisme hôte.Après avoir cultivé les bactéries selon le protocole décrit dans le texte, compter les cellules en réalisant d'abord des dilutions sérielles d'un facteur dix à l'aide d'une solution de chlorure de sodium à 0,9 % refroidie sur glace. Déposer 100 microlitres de chaque dilution sur une boîte de gélose BHI. Incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre la croissance cellulaire et la formation de colonies, afin de déterminer le nombre d'UFC par millilitre.Pour préparer l'eau de boisson contenant des bactéries, utilisez 100 millilitres d'eau de boisson stérile et filtrée pour diluer les cellules provenant de chaque culture bactérienne de réserve, afin d'obtenir une concentration finale moyenne de dix puissance neuf unités formant colonies par millilitre (CFU). Pour évaluer la survie bactérienne, dénombrez les cellules vivantes juste après la dilution puis après 24 heures, une fois par semaine pendant les deux premières semaines du traitement bactérien. Après avoir étiqueté les oreilles et acclimaté des souris femelles jeunes BALB/c conformément au protocole décrit dans le texte, au jour un de l'expérience, prélève des échantillons fécaux pour chaque souris et marque-les comme temps zéro, ou t zéro.Placer les échantillons dans des boîtes de stockage préalablement préparées et réfrigérer les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu'à leur transport au laboratoire, où ils seront congelés à moins 80 degrés Celsius, puis peser les souris et noter le poids. Préparer de l'eau de boisson contenant des bactéries comme démontré précédemment dans la vidéo et placer les bouteilles d'eau de boisson dans les cages indépendantes correspondantes clairement identifiées afin que les souris de chaque cage partagent la même bouteille d'eau. Préparer quotidiennement de nouvelles bouteilles avec 100 millilitres d'eau fraîche, de préférence de l'eau minérale pour éviter le chlore ou les composés inhibiteurs de bactéries, et ajouter des suspensions bactériennes récemment décongelées.Prélèvez des échantillons fécaux aux jours sept et 14. Ensuite, pendant les deux semaines suivantes, laissez les souris boire de l'eau exempte de bactéries et prélèvez des échantillons fécaux supplémentaires aux jours 21 et 28. Pour compter les cellules bactériennes productrices de bactériocines dans les échantillons fécaux, transférez des cellules diluées du producteur de bactériocine vers quatre millilitres d'agar mou MRS préchauffé.Mélanger l'agar en vortexant et verser les cellules sur une boîte de Petri contenant de l'agar MRS à 1,5 %. Cette couche est appelée première couche. Transférer quatre millilitres supplémentaires d'agar mou MRS sans cellules à 0,8 % sur la première couche afin d'incorporer toutes les cellules dans l'agar mou.Cette couche a pour but d'empêcher les cellules de croître sous forme de colonies à la surface des boîtes de gélose. Dans la hotte stérile, sécher les boîtes en retirant le couvercle pendant cinq à dix minutes, puis incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures pour permettre la croissance cellulaire et la formation de colonies. Pour identifier les colonies productrices de bactériocines, mélanger 40 microlitres d'une culture de nuit d'une souche indicatrice appropriée avec quatre millilitres de gélose molle préalablement réchauffée pour chaque boîte.Verser le mélange sur les plaques. Cette couche est appelée la troisième couche. Sécher et incuber les plaques comme précédemment pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.Les colonies productrices de bactériocines présentent des zones de inhibition claires autour des colonies. À l’aide d’un kit commercial d’extraction d’ADN, suspendre un à deux granulés fécaux de souris dans 300 microlitres de solution de resuspension. Transférer l’échantillon dans un microtube de deux millilitres contenant 0,5 gramme de billes de verre.Ajouter un microlitre de mutanolysine à 10 unités par microlitre et deux microlitres de lysozyme à 20 milligrammes par millilitre à chaque échantillon, puis incuber les tubes à 37 °C pendant 40 à 60 minutes. Rompre la structure des échantillons à l’aide de vibrations et de billes de verre, puis poursuivre avec l’un des protocoles standards d’extraction de l’ADN à partir d’échantillons fécaux. Après avoir isolé et purifié l’ADN conformément au protocole décrit, quantifier les échantillons.Ensuite, normalisez et regroupez chaque échantillon provenant de souris partageant la même cage à chaque point temporel. L'objectif de ce travail était de démontrer la capacité des bactériocines à moduler les populations du microbiote intestinal dans un modèle murin. Les bactéries lactiques productrices de bactériocines testées, ou BL, ainsi que les concentrations respectives dans l'eau de boisson et les charges dans les selles sont résumées ici.Un exemple de production de bactériocines par des LAB isolés à partir de selles est illustré dans cette figure. Cette analyse PCoA révèle qu'il n'existait aucune différence significative entre les traitements aux bactériocines et les souches isogéniques lorsque tous les échantillons et tous les groupes de bactéries étaient considérés ensemble. Toutefois, des différences probables apparaissaient lorsqu'on étudiait indépendamment certains genres bactériens, comme le montre ici la comparaison des variations des abondances relatives des genres par rapport au groupe témoin.En outre, l'analyse de corrélation de Pearson a révélé une association significative entre différents genres bactériens ainsi qu'une corrélation entre les genres bactériens et les triglycérides et le LDL sérique, comme le montre ce réseau construit dans CoNet. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser des souches isogéniques comme témoins, ainsi qu'un témoin sans traitement bactérien. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'évaluation de la fonction hépatique, la transcriptomique moe-coe-sic et la métabolomique de l'eau fécale peuvent être réalisées simultanément, permettant d'aborder des questions supplémentaires, comme l'impact des fluctuations du microbiote sur les sels biliaires, le cycle du cholestérol, la digestibilité des nutriments et la réponse immunitaire.

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Source : Morrill, S. R., et al. Modèles de colonisation vaginale murine par des bactéries cultivées en anaérobie. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo présente un protocole de modélisation de la colonisation vaginale chez la souris à l’aide de bactéries anaérobies résistantes aux antibiotiques. Elle commence par un traitement hormonal pour augmenter la susceptibilité épithéliale, suivi d’une inoculation vaginale et d’une co-inoculation dans des conditions anaérobies. La procédure se termine par un...

Modélisation de la colonisation vaginale murine par des bactéries anaérobies

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

Cette vidéo démontre la détection de bactéries lactiques productrices de bactériocine dérivées de matières fécales de souris. Le test détermine l’activité antimicrobienne de la bactériocine sur des souches bactériennes spécifiques.

Évaluation du potentiel antimicrobien des isolats bactériocines fécaux murins producteurs de bactériocine

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour l’administration orale d’antibiotiques aux souris, collection d’échantillons de matières fécales, l’extraction d’ADN et la quantification des bactéries fécales de qPCR.

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

Ici, nous présentons un protocole pour établir le modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sans germes pseudo-germes induits par des antibiotiques afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets positifs de Bacillus cereus sur la colite.

Étude des effets atténuants de l’administration de Bacillus cereus sur la colite par la modulation du microbiote intestinal

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Ici, nous décrivons l’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) comme une méthode alternative au gavage oral qui incite l’animal de recherche à ingérer facilement les traitements avec un minimum de stress et d’inconfort.

Utilisation de l’administration de médicaments guidée par micropipette comme méthode alternative au gavage oral chez les rongeurs

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

Découvrez une méthode pour évaluer les effets des bactériocines sur le microbiote intestinal des souris. Cette technique permet d'analyser l'équilibre des populations bactériennes et leurs impacts physiologiques sur l'hôte.

Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris

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