Name: Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a estimar neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos usando estereologia não enviesada e microscopia padrão. Este método acessível facilita pesquisas pré-clínicas sobre a doença de Parkinson.

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Os autores são gratos Keali Röhm, Louisa Frieß e Heike Menzel para sua assistência técnica especializada; a Helga Brünner para o cuidado de animais; e a Chistopher S. Ward para a geração e a distribuição do disector óptica grade plugin para o software ImageJ.

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</ol>

C. W. I. atuou em conselhos científicos de Merz Pharmaceuticals, LLC e TEVA; recebeu financiamento para viagens de Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC e Allergan, Inc.; e recebeu honorários de alto-falante de Merz, TEVA e Allergan, Inc., fora o trabalho enviado. J. V. tem servido como um consultor para Boston Scientific, Medtronic e AbbVie e recebeu honorários da Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan e GlobalKinetics fora o trabalho enviado.

Stereology começa com o processamento do tecido. O serial corte de tecido SN deve ser realizado com cuidado para evitar a perda de seções durante a análise stereological. Além disso, é um passo essencial para marcar um hemisfério a fim de distinguir a direita da esquerda SN ao executar stereology. Colocação de um pequeno orifício na parte superior do tronco cerebral gerou os melhores resultados no estudo apresentado. Além disso, desde que está com as exigências do método fracionador óptico que o tecido é cortado em seçõe...

A quantificação do número de células neuronais é crucial na investigação pré-clínica da doença de Parkinson, para determinar o nível de neurodegeneração dentro da substância negra (SN)1,2. A imparcial stereological estimativa do número de células em uma região de interesse é considerada o padrão-ouro,3,4,5.
Antes do advento do stereology imparcial, o número de neurônios em seções foi avaliado através da manipulação de células contadas perfis para corrigir as probabilidades variáveis que neurônios entram em vista em uma seção. Um dos métodos mais utilizados era a correção da contagem de células quantificados descrito por Abercrombie6. Este método tentou levar em conta que as células possam ser quantificadas mais uma vez se encontram-se fragmentos da mesma célula em seções finas adjacentes. Portanto, Abercrombie e outros autores geraram equações que exigia a suposições sobre a forma, tamanho e orientação de células contadas7,8. No entanto, essas suposições foram geralmente não percebeu e, portanto, levou a erros sistemáticos e divergência do número real da célula (isto é, preconceito). Além disso, o preconceito não poderia ser reduzido por amostragem adicionais3.
Para a stereological estimativa do número de células usando o fracionador óptico, princípios matemáticos são aplicados para estimar diretamente o número de células diretamente em um volume definido, 3-dimensional. A vantagem deste método é que não envolve pressupostos sobre a forma, tamanho e orientação das células sendo contadas. Assim, o número de células estimado aproximam-se para os verdadeiros valores e se aproximar à medida que o tamanho da amostra aumenta (ou seja, imparcial)3. Porque muitas regras devem ser seguidas ao usar stereology para manter o método imparcial, foram desenvolvidos sistemas prontos para uso comercial stereology (para revisão, consulte Schmitz e Hof, 2005,4). Sistemas especializados stereology implementam métodos stereological design baseado com um priori definido sondas e esquemas de amostragem para as avaliações stereological que levam à independência da forma, tamanho, distribuição espacial e a orientação do células a ser analisados4,9. No entanto, sistemas stereology comercialmente disponíveis são caros; Isto pode limitar a implementação em novas pesquisas.
O objetivo deste estudo foi desenvolver uma técnica útil para a estimativa stereological baseada em projeto de contagem de células dopaminérgicas no mouse SN, empregando o método fracionador óptico e usando equipamentos de microscopia padrão (ou seja, luz microscópio, microscópio padrão software e uma motorizada x, y, z estágio). Por isso, é apresentado um guia passo a passo sobre como processar o tecido de cérebro de rato e como estimar o número de células do SN usando stereology imparcial baseado em projeto. Além disso, os modelos para o cálculo dos números de célula estimado e coeficientes de erro (CE) são fornecidos.
O método descrito aqui não é limitado à análise da SN, mas pode ser adaptado para uso em outras regiões anatomicamente definidas do cérebro do rato ou rato. Por exemplo, stereology imparcial tem sido usada para estimar os números de celular neuronal no hipocampo10 e o locus coeruleus11. Além disso, tipos de células que não sejam os neurônios, tais como astrócitos12 e microglia13, podem ser avaliados também. Portanto, esse método pode ser útil para os cientistas que pretendem implementar stereology imparcial em suas pesquisas, mas não estão dispostos a gastar muito dinheiro para comprar um sistema stereology.

<table><tbody><tr>Atlas <td></td><td></td><td>do rato Paxinos</td><td>O cérebro do rato George Paxinos Keith BJ FranklinCopyright @ 2001 por Academic Press CD Rom designet & criado por Paul Halasz</td></tr><tr><td>mouse fatiador de matriz cerebral</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>sacarose / D (+) Sacarose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Nome< / forte ></td> <td>< forte > Empresa < / forte ></td> <td>< forte > Número de catálogo< / forte ></td> <td>< forte > Comentários < / forte</td></tr> <tr><td><> forte > fosfato tamponado com solução salina ingredientes: < / cloreto ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sódio</td><td>forte Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de di-hidrogênio de potássio</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico di-hidratado</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra normal</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>detergente</td></tr><tr><td>3,3-Diaminobenzidina-tetracloridrato / DAB comprimidos 10mg pH 7,0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H 2 O2 / Peróxido de hidrogênio 30%</td> <td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>avidina/biotina reagente</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>coelho anticorpo tirosina hidroxilase de camundongo</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotinilado cabra-anti-coelho IgG H+L</td><td>vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator versão 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53 microscópio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Versão 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr> plugin de sobreposição de grade de <tr><td>gelo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td></td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>plugin contador</td><td>de células Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>dissector óptico macro</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N camundongos machos</td><td>Charles River, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de objeto revestido SuperFrost Plus</td><td>Langenbrinck, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha 25G Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Bomba de infusão analógica</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>Sistema StereoInvestigator</td><td></td><td></td><td>Microscópio StereoInvestigator versão 11.07</td></tr><tr><td>BX53 microscópio</td><td></td><td></td><td>BX53</td></tr><tr><td>estereologia</td><td></td><td></td> auto-sortida <td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereological estimativa do número de neurônios dopaminergic na substância negra do mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Em pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson, análise do tracto nigrostriatal, incluindo a quantificação da perda de neurônio dopaminérgico dentro da substantia nigra, é essencial. Para estimar o número de neurônios dopaminérgicos total, imparcial stereology usando o método fracionador óptico atualmente é considerada o padrão-ouro. Porque a teoria por trás do método fracionador óptico é complexa e stereology é difícil de alcançar sem equipamento especializado, vários sistemas disponíveis comercialmente stereology completa que incluem o software necessário existe, puramente para celular contando razões. Uma vez que compra uma instalação especializada stereology não é sempre viável, por muitas razões, este relatório descreve um método para a estimativa stereological da célula neuronal dopaminergic conta usando equipamentos de microscopia padrão, incluindo um microscópio de luz, um motorizado objeto da tabela (x, y, z plano) com o software de imagem e um computador para análise. Uma explicação passo a passo é dada sobre como realizar a quantificação stereological usando o método fracionador óptico e arquivos previamente programados para o cálculo de contagem de células estimados são fornecidos. Para avaliar a precisão desse método, foi realizada uma comparação com dados obtidos de um aparelho stereology comercialmente disponível. Números de telemóvel comparáveis foram encontrados usando este protocolo e o dispositivo stereology, demonstrando assim a precisão do presente protocolo para stereology imparcial.

Usando o método apresentado, o número estimado de TH + neurônios dopaminérgicos no direito SN variou entre células 7.363 e 7.987 e, no canto esquerdo da SN, entre as células 7.446 e 7.904. Assim, o número médio de neurônios dopaminérgicos (± SEM) foi 7.647 ± 83 células para a direita, SN e 7.675 ± 66 para a esquerda, SN. O CE calculado para cada animal foi inferior a 0,08 (intervalo: 0.073-0.079) (Figura 7). Para verificar a comparabilidade desse método com s...

Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever a estimativa estereológica baseada em delineamento do número de células dopaminérgicas na SN de camundongos utilizando equipamentos microscópicos padrão. Este método é útil para estimar o número de neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos em pesquisas pré-clínicas sobre a doença de Parkinson, utilizando estereologia imparcial baseada em delineamento. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser realizada com equipamentos microscópicos padrão, sem necessidade de um conjunto completo de estereologia comercialmente disponível.Quem demonstrará o procedimento será Louisa Friez, uma técnica do meu laboratório. Comece colocando um cérebro de camundongo fixado em paraformaldeído em uma matriz cerebral e realize um corte a +0,74 milímetros de bregma. Transfira a parte caudal do cérebro, incluindo a SN, para PFA 4% em tampão 0,1 molar e fixe durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, substitua o PFA por sacarose a 30% em PBS 0,1 molar e incube por mais dois dias a quatro graus Celsius para crioproteger a amostra. Após dois dias, quando o cérebro tiver afundado na sacarose, coloque o tecido em um Cryomold contendo composto de temperatura de corte ideal e congele lentamente o tecido em isopentano resfriado com gelo seco líquido. Utilize um criostato para cortar serialmente seções criogênicas de 30 mícrons no plano coronal.Marque o hemisfério direito perfurando um pequeno orifício na região superior do tronco encefálico. Colete quatro séries de cortes iniciando em menos 2,46 milímetros de brégma e terminando em 4,04 milímetros de brégma. Transfira cada série de cortes para um tubo contendo crioprotetor e armazene a menos 20 graus Celsius.Capture imagens digitais de seções do SN marcadas imuno-histoquimicamente para tirosina hidroxilase utilizando um software de imagem acoplado a um microscópio. Comece determinando a montagem real e a espessura das seções em três sítios de contagem selecionados aleatoriamente por seção. Primeiro, clique em visualizar deslocamento superior para definir o topo da seção.Em seguida, clique em parar visualização superior. Depois disso, clique em deslocamento da visualização inferior e, em seguida, clique em parar visualização inferior. Anote a espessura da seção.Calcule a zona de proteção subtraindo três mícrons do deslocamento superior e digite o resultado na caixa de deslocamento superior. Em seguida, subtraia a altura de 13 mícrons do dissector óptico do valor do deslocamento superior e digite o resultado na caixa de deslocamento inferior. Selecione os seguintes parâmetros: passo 14, tamanho 1,00.Selecione o diretório para salvar o arquivo. Clique em sequência para iniciar a aquisição. Após as imagens terem sido adquiridas, clique em processamento e selecione os seguintes parâmetros: todos os planos da sequência, montagem e as opções rápidas e emendar com uma sobreposição de imagem de 10%. Comece a emendar as imagens clicando em iniciar.Isso gerará imagens em pilha para análise. Para começar, abra a imagem clicando em arquivo e abrir. Defina a escala da imagem utilizando o comando analisar e definir escala.A partir desta etapa, altere o tamanho definido de pixels para mícrons. Selecione os plugins, depois grade, então o comando tipo de grade linhas para inserir aleatoriamente uma grade. Marque a caixa de deslocamento aleatório.Defina o tamanho de um quadrado dentro da grade como 130 mícrons por 130 mícrons, totalizando 16.900 mícrons quadrados. Altere o tipo de imagem de 16 bits para cor RGB clicando na imagem, depois em tipo e então em cor RGB. Localize a substância negra pars compacta.Circule a região com a ferramenta pincel usando uma largura de pincel de 11. Desfaça o comando de definir escala clicando em analisar, depois em definir escala e, em seguida, clique para remover a escala, a fim de calcular em pixels em vez de mícrons. Tire uma captura de tela, salve o arquivo de imagem e abra o novo arquivo com o ImageJ.Selecione o pincel e uma largura de pincel de 25. Marque todos os quadrados da grade que tocam a SN para posicionamento de um dissector óptico. Selecione um quadrado da grade que inclua partes da SN. Meça o canto superior esquerdo do quadrado com o cursor no ImageJ para definir as coordenadas iniciais de x e y.Selecione o modelo de planilha intitulado posição do dissecador óptico e calcule a posição do dissecador óptico. Em seguida, estime o número de células utilizando a planilha de cálculo de contagem celular conforme descrito na parte escrita do protocolo. Esta imagem de baixa ampliação mostra uma seção do cérebro de camundongo após coloração para TH em neurônios dopaminérgicos.A maior ampliação mostra neurônios dopaminérgicos positivos para TH. O quadro interno mostra a região destacada com ampliação aumentada. Esta imagem apresenta uma série de cortes do SN corados para TH, cobrindo todo o SN do camundongo de rostral a caudal.Cada seção é separada da seção consecutiva por 120 micrômetros. O número de neurônios positivos para TH nas regiões SN direita e esquerda do camundongo foi estimado utilizando o método mostrado neste vídeo e um sistema de estereologia comercialmente disponível. Como visto aqui, ambos os métodos resultaram em contagens celulares comparáveis e não houve diferenças significativas entre os conjuntos de dados.Não se esqueça de que o trabalho com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, por exemplo luvas protetoras, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a estimativa estereológica imparcial do número de neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos utilizando o método da fração óptica e equipamentos de microscopia convencionais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Este vídeo demonstra o processo de quantificação do acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios de dopamina embrionários de camundongos pré-tratados com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína. Ele descreve as etapas para fixar, corar e quantificar os neurônios dopaminérgicos contendo agregados de alfa-sinucleína usando imunofluorescência.

Estudando o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios embrionários primários de dopamina de camundongo

Fonte: Olesen, M. V., et al. A técnica do fracionador óptico para estimar o número de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva. J. Vis. Exp. (2017).  O vídeo demonstra a técnica para quantificar neurônios recém-gerados no tecido cerebral. Fatias de tecido hipocampal contendo neurônios marcados com bromodeoxiuridina (BrdU) foram coradas usando imuno-histoquímica e posteriormente quantificadas em toda a espessura do tecido usando a técnica do fracionador óptico.

Quantificando neurônios recém-gerados no tecido cerebral de ratos usando a técnica do fracionador óptico

Este protocolo descreve duas manipulações ambientais diferentes e um protocolo de infusão cerebral concomitante para estudar as alterações cerebrais induzidas pelo ambiente subjacentes ao comportamento adaptativo e ao reparo cerebral em camundongos adultos.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Aqui, apresentamos um método estereológico, o fraccionador óptico, usado para quantificar a formação de novos neurônios e sua sobrevivência, no hipocampo do rato após a estimulação eletroconvulsiva. Quando implementado corretamente, a sensibilidade e a eficiência dos métodos estereológicos garantem estimativas precisas com uma precisão fixa e predeterminada.

A técnica de fracionador óptico para estimar números de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.

Estimativa estereológica do comprimento da fibra cholinergica no Núcleo Basalis de Meynert do Cérebro do Rato

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Aprenda a estimar neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos usando estereologia não enviesada e microscopia padrão. Este método acessível facilita pesquisas pré-clínicas sobre a doença de Parkinson.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia (Vídeo) | JoVE Journal

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

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