Name: Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2- O -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer de vaste fase synthese van RNA-dodecameren met 2'-O-thiophenylmethylmodificatie en hun karakterisatie via circulaire dichroïsme. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid van nucleïnezuuronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voorbereiding van dit manuscript werd ondersteund via start-up fondsen van de Universiteit van Colorado Denver (JMRE). AF zou graag willen steunen van een award voor onderzoek en creatieve activiteiten (RaCAS, CU Denver). Financiering van het Bureau van Onderzoeksdiensten, Universiteit van Colorado Denver om publicatiekosten te dekken, wordt erkend. Wij danken de leden van het lab mevrouw cassandra herbert en meneer yannick k. dzowo voor hun bijdragen in het videogedeelte.

1. Vaste-fasesynthese van RNA-oligonucleotiden <ol><li> Bereiding van oplossingen die elk fosforamidiet bevatten (tabel 1). <ol><li> Tel het aantal nucleotiden en pas in de n + 1 vergelijking (waar n = aantal nucleotiden) die overeenkomen met elke basis en vul de tabel in met de ontbrekende waarden. Volume = 0,15 ml per nucleotide bij een concentratie van 0,1 M, opgelost in watervrij acetonitril. </li><li> Weeg elk fosforamidiet in ovengedroogde 10 ml amberflessen (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) en plaats onmiddellijk onder vacuüm met behulp van een droogmiddel die een droogmiddel bevat. </li><li> Vul de droogmiddel met droog argon, verwijder de fles en verdun onmiddellijk met de bijbehorende hoeveelheid acetonitril (watervrij) voordat u het instrument vastzit. OPMERKING: Zorg ervoor dat u gasdichte spuiten gebruikt en te allen tijde een watervrije atmosfeer houdt. </li><li> Verwijder de septa uit de fles en plaats op de mAchine, via een flesveranderingsfunctie. OPMERKING: dit proces vereist een extra 0,15 ml (vandaar het overtollige volume in de n + 1 vergelijking hierboven) van elke oplossing om de lijn voorafgaand aan de synthese te prikken. </li></ol></li><li> Opstelling van sequentie- en solidefasesynthese met behulp van de software ( Figuur 3 ). <ol><li> Klik op het software icoon ( bijv . OligoNet 1.0.1) en selecteer Instrument naam&gt; OK . Maak een nieuwe synthese door Bestand&gt; Nieuwe Synthese&gt; Bestelling . </li><li> Invullen: datum; RunID; Selecteer instrument; Volgorde naam; Sequentie (5&#39;-tot-3&#39;-einde). Onder | cyclus, toewijzen van de eerder gemaakte methode ( figuur 3 ). Kies de eindprocedure, ( laat oligonucleotide gebonden aan de CPG-hars)&gt; handleiding. </li><li> Selecteer DMT Off&gt; (TCA behandeling in de laatste stap om een ​​5&#39;-OH groep aan het einde van de synthese te verkrijgen) ; Bestand opslaan &gt; Opslaan alsEn geef een naam voor het experiment. </li><li> Verzend het bestand om de synthese te starten. Bestelling&gt; Stuur bestelling naar synthesizer en selecteer kolom 1-4 . Open het synthesizervenster en kies trityl monitor | kies functie | trity&gt; monitor elke stap . </li><li> Herhaal de stappen als nodig, afhankelijk van het aantal gelijktijdige synthetische oligonucleotiden (let op dat alle orders dezelfde methode moeten hebben, dwz dezelfde koppeltijden en volgorde van gebeurtenissen). </li><li> Begin de synthese synthesizer&gt; Bereid je voor om te beginnen . Plaats de kolommen met het gewenste 3&#39;-uiteinde op de posities die op het instrument zijn aangegeven. Klik op het instrument op Start&gt; Nee (voor ABI voorbereiding). </li><li> Zodra de synthese is voltooid, verwijder de kolom uit het instrument en plaats een rondbodemkolf, gevolgd door drogen onder verminderde druk gedurende ongeveer 0,5 uur. OPMERKING: Het is aan te bevelen om te controleren of er een diep oranje kleur in rand is waargenomenOm koppelingen (stappen 1.2.4 - 1.2.7) om mogelijke fouten van de trityl monitor functie te vermijden. </li></ol></li><li> Deprotectie en zuivering van RNA-oligonucleotiden. <ol><li> Open de kolom door de zwarte dop te draaien en alle (of de helft, afhankelijk van de behoefte of het doel) van de witte hars in een 1,6 ml centrifugebuis over te brengen. Voeg 0,5 ml van een methylamine (40% in water) / ammoniak (40% in water) bij 1: 1 toe. </li><li> Bevestig de centrifuge buisdop met parafilm en verwarm deze met 1,5 uur tot 60 ° C met een hitteblok. OPMERKING: Een zwaar voorwerp kan bovenop de buis geplaatst worden om ervoor te zorgen dat de ammoniakconcentratie constant in de reactibuis blijft. </li><li> Verwijder van het hitteblok en langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Centrifugeer het monster kort om de inhoud te verdraaien, en plaats de supernatant over op een nieuwe centrifugebuis. </li><li> Bevroren de monsters door onderwaterbuisjes in vloeibaar stikstof (of droogijs / ethanolbad) en concentreer tot droogte tijdens het spinnenIn een centrifuge onder verminderde druk. </li><li> Re-suspender vaste stoffen in 0,4 ml triethylamine / N-methylpyrrolidinon / triethylamine-trihydrofluoride (2: 2: 3 verhouding) oplossing. Hitte tot 60 ° C gedurende 1,5 uur gevolgd door langzame koeling tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg 0,04 ml van een NaOAc oplossing (3M, pH 5,5 - aangepast met HC1) toe, gevolgd door zacht mengen met een pipetpunt. Voeg ethanol (1 ml) toe en afkoel tot ca. -70 ° C (droogijs / ethanolbad) gedurende 15 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 15.000 rpm en 4 ° C gedurende 10 minuten. Gebruik een pipet om de aliquot te extraheren en de resulterende pellet te drogen onder verminderde druk. </li><li> Re-suspender de verkregen vaste stof in laadbuffer (0,2 ml, 90% aq. Formamide, 1 mM EDTA) en meng tot het mengsel homogeen is. </li><li> Laad suspensie op een eerder bereide polyacrylamidegel (20% denatureren, afmetingen van de put: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Breng een stroom door de gel aan tot de bromfenol blauwe marker tussen 1 / 2-2 / 3 ligtOnder de gel (gel afmetingen: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Verwijder de gel van de staander en plaats de gelinhoud van het glas naar plastic wrap (aan beide zijden bedekt) en plaats een dunne laagchromatografie (TLC) plaat bedekt met silica (bevattende fluorescerende kleurstof bij 254 nm) om de banden te visualiseren Gebruik van een UV-lamp (λ max = 254 nm). </li><li> Gebruik een markering om de positie te definiëren waar de bovenband zich bevindt en snijd het met een nieuw scheermesje. Plaats gel die het RNA (zonder plastic wrap) bevat, in een 50 ml kegelbuis en druk op kleine stukken met een glazen staaf. </li><li> Schors de gelresiduen in een NaCl aq. Oplossing (2 mM en 1 mM EDTA) en schud de suspensie bij 37 ° C gedurende 12 uur. Centrifugeer de conische buis gedurende 10 minuten. </li><li> Afval door gebruik te maken van een omgekeerde fase C18 patroon. <ol><li> Bereid de cartridge op met een 10 ml spuit door te wassen met: Acetonitril (10 ml) H2O (tweemaal 10 ml) 5 mM NH4 Cl aq. Oplossing (3 ml) Oplossing die RNA bevat, zorg ervoor dat geen van de gelresiduen wordt giet. </li><li> Was met H 2 O (driemaal, 10 ml). </li><li> Uittreksel uit de kolom met behulp van een 60% aq. Methanol oplossing (3 ml) </li></ol></li><li> Concentreer onder verminderde druk en heroplos in RNase-vrij water (0,3 ml) </li><li> Bereid een verdunde oplossing (10 μL) op en plaats 1 μL op het UV-vis instrument ( bijv . Nanodrop) om het UV-vis spectrum (200-450 nm) te meten. </li><li> Gebruik de wet van Beer Lambert om de concentratie van de verkregen oplossing te bepalen: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Waar A = verkregen absorptie; Ε = berekende molaire extinctiecoëfficiënt; C = concentratie en l = 0,1 voor een padlengte van 1 mm. </li><li> Bereken de molaire extinctiecoëfficiënten voor de oligonucleotiden; Hier berekend met een on line calculatorDie gebruik maakt van DINAMelt software (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Concentratie bepaling en karakterisering via MALDI-TOF. <ol><li> Laad monsters op een MALDI plaat met behulp van een pipet tip geladen met een C18 tip om te ontzellen, en spot elke oligonucleotide. <ol><li> Was de tip met 50% acetonitril (10 μL x 2). Equilibreer de tip met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA; 10 μL x 2). Laadpunt met monster (typisch 100-150 pmol). </li><li> Was de tip met 0,1% TFA (10 μL x 2), en daarna met water (10 μL x 2). </li><li> Verwijder het monster in een oplossing die de gewenste matrix bevat; We gebruikten een oplossing van: 10 μl 25 mM-2,4,6-trihydroxyacetofenonmonohydraat (THAP), 10 mM ammoniumcitraat en 300 mM ammoniumfluoride in 50% acetonitril. </li><li> Plaats direct op de MALDI-plaat door 0,9 μL te plaatsen (gevolgd door luchtdrogen) en herhaal eventueel de procedure. OPMERKING: Alle spectra werden verkregen op de reflector positieve modus. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. RNA Structure Analysis via CD <ol><li> Voorbereiding van oplossingen voor CD. <ol><li> Bereid 0,25 ml bevattende het gemodificeerde RNA [3 uM], NaCl [10 mM], natriumfosfaat buffer [10 mM, pH 7,2] en MgCl2 [5 mM]. Het monster is klaar voor analyse zoals dat is, vooral als het een unimoleculaire overgang vertegenwoordigt. </li><li> Als het doel is om duplexstructuren of bimoleculaire overgangen te analyseren, voegt u nu complement (1 molar equivalent, indien van toepassing), of ga verder met de onderstaande stap. </li><li> Plaats het monster op een hitteblok, voorverwarmd tot 90 ° C, en zet de hitte uit om de lage koeling te regelen tot kamertemperatuur (typisch 2 - 4 uur). </li></ol></li><li> Spectra acquisitie <ol><li> Bereid een blanco-oplossing (NaCl 10 mM natriumfosfaat pH 7,3 10 mM, MgCl2 5 mM), overdracht tOa micro-cuvette (1 cm padlengte, 250 μL minimumvolume) en plaats op een houderpositie van de monsterwisselaar binnen het instrument. </li><li> Plaats het monster met RNA in een andere microcuvette en plaats in de monsterwisselaar. Bij het meten van een thermische denaturatie-overgang, voeg een oliebedje zorgvuldig toe zonder de waterlaag te verstoren en de kap van de cuvette vast te zetten met een stuk Teflon tape. </li><li> Open de stikstoftank om een ​​stroom te geven die de luchtvlotter op het instrument beweegt naar ca. 40. Schakel de koeler in. </li><li> Schakel het instrument in en open het software Spectra Manager icoon, en open het acquisitie venster Spectra Measurement . </li><li> Vuil het instrument met stikstof gedurende 5 minuten voor de aankoop. </li><li> Verkrijg de spectra met de volgende parameters Meet&gt; Parameters en stel de parameters als volgt in: <ol><li> Onder Algemeen selecteert u: Scan 200-350 nm; Kanalen CD en HT: DataToonhoogte bij 0,1 nm; Scansnelheid bij 100 nm / min; Bandbreedte bij 1 nm; Aantal accumulaties bij 5. </li><li> Kies onder de cel een temperatuur van 20 ° C. Onder controle wordt de sluiter geopend en automatisch gesloten. Kies onder informatie de naam, concentratie, operator. </li><li> Ga onder de gegevens naar de gewenste map. Klik op OK . </li></ol></li><li> Verkrijg de spectrummeting &gt; Sample meting , plaats de positie (s) van de cuvetten in de sample-wisselaar 1-6 en klik op OK . </li></ol></li><li> Bij het nemen van een thermische denaturatie-overgang: <ol><li> Sluit Acquisitie software Bestand&gt; Sluit een nieuw programma op en open een variabele Temperatuurmeting&gt; Meet&gt; Parameters . </li><li> Pas de volgende parameters aan om een ​​thermische overgang op te nemen, die als gewenst kan worden aangepast: <ol><li> Selecteer onder Temperatuur de starttemperatuur: 4 ° C; Interval: 0,2; taRget: 90 ° C; Gradiënt: 1 ° C / min; Wacht 0 s. Onder Start / Einde selecteert u Start conditie en eindtoestand zoals gewenst. </li><li> Onder Algemeen selecteert u 3 kanalen, CD / HT / Abs; Bandbreedte: 1 nm; Golflengte: 270 nm (of als gewenst). Under Control, niets selecteren. Selecteer onder Informatie , naam, concentratie, operator. </li><li> Ga onder de gegevens naar de gewenste map. Klik op OK . </li></ol></li><li> Koel monsters tot 4 ° C en wacht 5 minuten bij deze temperatuur voordat u een spectrummeting krijgt. </li></ol></li><li> Data work-up voor spectra. <ol><li> Met behulp van de functie op de software trekt u het lege spectrum van de doelverwerving af om rekening te houden met achtergrondsignalen die voortvloeien uit het buffersysteem dat in gebruik is: Spectra Analyse&gt; Bestand&gt; Open . </li><li> Zodra een leeg bestand en een spectrabestand zijn geopend, sleept u View 2 onder View 1 (aan de linkerkant van het scherm). </li><li> Klik op PrOverdragen&gt; aftrekken&gt; OK of uitwisseling van gegevens&gt; OK . </li><li> Extract data als een ASCII-bestand: Bestand&gt; Exporteer en selecteer ASCII . </li><li> Gebruik software om het overeenkomstige spectrum te plotten. Verlenging van data is optioneel in gevallen waarin de signaal-ruisverhouding lager is dan verwacht. Deze transformatie kan worden toegepast door de gladde data-optie toe te passen. </li></ol></li><li> Data work-up voor thermische denaturatie transities. <ol><li> Extract data uit het JASCO bestand als een ASCII bestand. </li><li> Bepaal de ellipticiteitspunten als functie van de temperatuur. Typisch is het vergemakkelijken van de data noodzakelijk, afhankelijk van de golflengte die wordt onderzocht. In sommige gevallen vertoonde het gebruik van de golflengte bij 210 nm grotere variaties tussen percelen die vereffening vereisen. Afhankelijk van het monster en de concentraties werden echter een aantal berekeningen uitgevoerd met behulp van de rauwe data. </li><li> Om de thermische deksel te berekenenaturation transities (Tm) waarde verkrijgen van een eerste afgeleide van de kromme. De maxima of minima waren een indicatie van deze parameter. Zoals in de vorige stap, vereisen sommige gevallen dat de gegevens vergemakkelijkt werden om de meest nauwkeurige waarde te verkrijgen. OPMERKING: Experimenten werden typisch uitgevoerd in triplicaat, wat resulteerde in de bijbehorende gemiddelde en standaardafwijking voor de meting. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het doel van dit manuscript is om als gids te dienen voor onderzoekers op het gebied, beginner of deskundige, om succesvol het bereiken of verbeteren van de synthese van oligonucleotiden van DNA of RNA. De beschreven methodologie richt zich op het gebruik van vaste-fase synthese door gebruik te maken van een geautomatiseerde DNA / RNA synthesizer via standaard fosforamidiet chemie. Het rapport beschrijft een stap-voor-stap afbeelding van de synthese, zuivering en karakterisering van RNA dodecamers. Daarnaast wordt het g...

Solid-fase synthese om oligonucleotiden van DNA / RNA te verkrijgen is een krachtig hulpmiddel dat sinds de jaren 1970 1 , 2 , 3 verscheidene toepassingen in verschillende velden heeft gediend door fosforamidiet bouwstenen 4 te gebruiken . Voorbeelden van zijn brede invloed zijn: het effect ervan op etikettering ( via click chemistry reacties) 5 , structurele probing 6 en antisense technologieën 7 , evenals de toelichting van biologische mechanismen 8 , 9 , bron als genetisch materiaal 10 , en de studie van Verschillende natuurlijke en / of chemische wijzigingen 11 , 12 , onder vele anderen. De wijziging die we hier gebruiken, vertegenwoordigt de eerste stap in onze inspanningen om RNA-oligonucleotiden te verkrijgen die bevattenFotoactieve probes om tijdelijke controle van de structuur en functie van dit belangrijke biopolymeer mogelijk te maken. De synthese van RNA-sequenties met dodecameren: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [augustus AUU CCG UAG] -3&#39; (onderstreept posities vertegenwoordigt de opname van een C2&#39;- O -thiophenylmethyl modificatie ) Vormt de focus van deze studie. De sequenties werden gekozen om de kwantificering en meting van RNA-strengen mogelijk te maken als enkele strengen, of als hun corresponderende duplexstructuren (geen andere secundaire structuren werden voorgesteld als thermodynamisch stabiel). CD werd gebruikt om de structurele parameters te bepalen, dwz duplexvorming en thermische denaturatieovergangen. Synthese De algemene werkwijze voor het verkrijgen van deze oligonucleotiden is geïllustreerd in Figuur 1 en volgt de stapsgewijze werkwijze: geautomatiseerde vaste-fase synthese → DeprOtectie → zuivering → kwantificering → karakterisering. Figuur 2 toont de monomeereenheden die nodig zijn in deze procedure. De vaste-fase synthese van RNA is vergelijkbaar met die van DNA, omdat het gebaseerd is op fosforamidietchemie ( Figuur 2 , links) en het gebruik van base-labiele beschermende groepen voor de nucleofiele exocyclische aminen op G, A en C, bijvoorbeeld , Acetyl, benzoyl, fenoxyacetyl, t- butyl of N , N- dimethylformamide ( Figuur 2 , rechts). Nog een aspect om te overwegen in RNA, door de aanwezigheid van de C2&#39;-OH groep (ontbreekt in de deoxyoligonucleotide biopolymeren), is de aanvullende stap die moet worden opgenomen voor de bescherming en de daaropvolgende afbescherming van deze nucleofiele positie. In dit opzicht zijn silicium gebaseerde beschermende groepen uitgegroeid tot een aantrekkelijke strategie door hun potentieel als biorthogonale delen (specificallY beschermd in aanwezigheid van fluoride), met de tert- butyldimethylsilyl (TBDMS) en triisopropylsilyloxymethyl (TOM) groepen als populaire keuzes ( Figuur 2 , linksonder). In dit werk werd de geautomatiseerde synthese uitgevoerd op een DNA / RNA synthesizer die standaard fosforamidietchemie gebruikt. De fabrikantinstellingen op het instrument omvatten een geautomatiseerde verdunningsstap bij het gebruik van de commerciële versies van de fosforamidieten voor DNA, of de mogelijkheid om te verdunnen bij volumes die door de gebruiker zijn ingesteld. We hebben echter besloten om het RNA fosforamidiet te wegen en handmatig te verdunnen, omdat: 1) de prijs van de kanonische fosforamidieten van RNA hoger is (in sommige gevallen tot 50 keer duurder); 2) de gemodificeerde fosforamidieten worden vaak in kleine hoeveelheden verkregen; En 3) het bedrag van verspild materiaal bij gebruik van een geautomatiseerde verdunningsstap (ingesteld door fabrikant) is groot. Daarnaast hebben we gebruikt: 1) in de handel verkrijgbare vaste steunen( Bijv . CPG) die een beschermde nucleobase bevat om als het 3&#39;-einde te functioneren; En 2) commerciële fosforamidieten (kanonieke nucleobasen) beschermd met een TBDMS-groep op de C2&#39;- O- positie. De gedetailleerde lijst van de synthese stappen wordt verschaft in Figuur 3 en Tabel 1 , samen met verdere beschrijving en opmerkingen voor stappen die zijn aangepast voor de RNA synthese. Figuur 4 illustreert verder de stapsgewijze opbrengsten die worden waargenomen voor elke stap na het selecteren van de &#39;Trityl Monitor&#39; optie, die de trityl kation kwantitatief vrijgegeven van elke detritylatiestap kwantificeert. Het is op te merken dat typisch, in onze ervaring, de beperkende factor was het verkrijgen van de fosforamidiet die de gewenste modificatie bevat. Dat is de ontwikkeling van een synthetische methodologie die het mogelijk maakt om wijzigingen op geselecteerde locaties op te nemen. In dit rapport richten wij ons op deIncorporation van een gemodificeerd nucleotide waarvoor we de bijbehorende synthetische methodologie, de C2&#39;- O- thiophenylmethylgroep hebben vastgesteld. Deze groep is klein in grootte en heeft geen invloed op de vaste-fase synthese op welke manier dan ook. Aangezien de opneming van deze groep in oligonucleotiden van RNA is gemeld, samen met structurele en thermodynamische parameters 4 , worden hierin geen aspecten van de organische synthese die leidt tot de gemodificeerde fosforamidieten beschreven. Deprotectie, zuivering en karakterisering De afbescherming van de exocyclische aminen en ß-cyanoethylgroepen komt in dezelfde stap als die van de splitsing van de CPG-hars voor. Wij hebben de gebruikelijke omstandigheden toegepast om de verkregen hars te verhitten in aanwezigheid van een waterige oplossing van AMA, gevolgd door splitsing van de C2&#39;- O- silylgroepen in aanwezigheid van fluorideionen en vervolgens zuivering via gelelektroforese. Terwijl deze standaardomstandigheden vaak modificaties die labiel basische omstandigheden of fluoride-ionen mildere omstandigheden 13, 14, bijvoorbeeld methanol / kaliumcarbonaat (MeOH / K 2 CO 3) of butylamine nodig zijn geworden. Zo is een andere groep beschermende groepen op de overeenkomstige fosforamidieten nodig. Verder hebben we gekozen voor elektroforese als het voorkeursalternatief om de beschermde oligomeren te zuiveren, gezien onze vorige ervaring met deze methode en het gebrek aan andere instrumenten. HPLC kan echter alternatief gebruikt worden als een effectieve methode 15 . Karakterisering van de gezuiverde oligonucleotiden werd uitgevoerd via massaspectrometrie, matrix geassisteerde laser desorptie / ionisatietijd van de vlucht (MALDI-TOF), onder toepassing van een gerapporteerde procedure door onze groep 16 . Structurele karakterisering en daarbij<html> Mal stabiliteit van de verkregen duplexen werden uitgevoerd via CD. Specifiek maken we gebruik van CD om de thermische denaturatieovergangen van gemodificeerde en ongewijzigde oligonucleotiden van RNA te bepalen door de afname van de ellipticiteit van de band te bepalen bij ca. 270 nm, evenals de verdwijning van de band (met negatieve ellipticiteit) met een A max bij 210 nm. Een spectra vergelijking voor en na hybridisatie wordt verschaft om hun verschillen te illustreren en de validatie van de werkmethodologie te verschaffen. Het gebruik van CD wordt algemeen geaccepteerd bij de bepaling van structurele motieven in nucleïnezuren en aminozuren 17 en kan derhalve worden gebruikt als hulpmiddel om diverse structurele en thermodynamische parameters 18 te bepalen ; Er zijn echter niet veel voorbeelden waar de techniek wordt gebruikt om thermische denaturatieovergangen te beoordelen. Sommige gevallen omvatten de bepaling van thermische stabiliteit op DNA dat G-quadruplexen bevatAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 of in duplexen en haarspelden van RNA 21 . Dit rapport is bedoeld om de niet-deskundige lezer of kijker te voorzien van een aantal instrumenten die een goed begin van dit soort onderzoek mogelijk maken. Het zal dienen om te verbeteren en te vergelijken met methodologieën en technieken bij andere onderzoekslaboratoria die betrokken zijn bij deze opwindende wetenschapswetenschap. De inhoud van dit rapport voegt aan de bestaande protocollen van deze technologie uit verschillende bronnen toe, en verrijkt en vergemakkelijkt de ervaring met een visuele hulpmiddel voor elke stap.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, anhydrous voor DNA-sequencing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcitraat, dibasisch 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumfluoride&nbsp; 98.0%, ACS-kwaliteit</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra hoge zuiverheid</td><td>&nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra zuiver</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonaat, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, histologisch kwaliteit</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur, dinatriumzout dihydraat 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur, 36.5 - 38.0%, Gecertificeerd ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, 99.9%,&nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine 40% in water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinon, anhydrous, 99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat, anhydrous 99.2%, Gecertificeerd ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride, 100.5%, Gecertificeerd ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch dihydraat 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&rsquo;,4&rsquo; Triethylamine, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&rsquo;-Trihydroxyacetofenon monohydraat 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia voor de RNA-synthese:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroazijnzuur in dichloormethaan</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/Pyridine/Azetzuuranhydride</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-methylimidazool in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazool in anhydrous acetonitrile</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oxidatieoplossing, 0.02 M jodium in THF/Pyridine/Water</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidiet&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidiet</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidiet</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidiet&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van rna die een 2&#39;-<em&gt; o</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solide fase synthese is gebruikt om kanonieke en gemodificeerde polymeren van nucleïnezuren, specifiek van DNA of RNA, te verkrijgen, waardoor het een populaire methodologie is voor toepassingen in verschillende velden en voor verschillende onderzoeksdoeleinden. De hierin beschreven procedure richt zich op de synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; die nul, een of twee modificaties bevinden op de C2&#39;- O- positie bevatten. De probes zijn gebaseerd op 2-thiophenylmethylgroepen, opgenomen in RNA-nucleotiden via standaard organische synthese en geïntroduceerd in de overeenkomstige oligonucleotiden via hun respectievelijke fosforamidieten. Dit rapport maakt gebruik van fosforamidietchemie via de vier kanonieke nucleobasen (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), evenals 2-thiophenylmethylfunctionaliseerde nucleotiden gemodificeerd bij de 2&#39;- O- positie; De methode is echter vatbaar voor een grote varZestig aanpassingen die door de jaren heen zijn ontwikkeld. De oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een steun met gecontroleerde poriënglas (CPG), gevolgd door splitsing uit de hars en deprotectie onder standaard omstandigheden, dat wil zeggen een mengsel van ammoniak en methylamine (AMA) gevolgd door waterstoffluoride / triethylamine / N-methylpyrrolidinon. De overeenkomstige oligonucleotiden werden gezuiverd via polyacrylamide-elektroforese (20% denaturerende) gevolgd door elutie, ontzouten en isolatie via omgekeerde fase chromatografie (Sep-pak, C18-kolom). Kwantificering en structurele parameters werden beoordeeld via respectievelijk ultraviolet-zichtbare (UV-vis) en circulaire dichroïstische (CD) fotometrische analyse. Dit rapport streeft ernaar om als bron en begeleider te dienen voor beginners- en deskundige onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het starten van dit vakgebied. Er wordt verwacht dat deze werkzaamheden worden ingezet als nieuwe technologieën en methodologieën worden ontwikkeld. De beschrijving van de methodologieën en technieken binnen dezeS document komt overeen met een DNA / RNA synthesizer (opgeknapt en gekocht in 2013) die fosforamidietchemie gebruikt.

De synthese van RNA-dodecamers die nul-, een- of twee-2-thiophenylmethyl-modificaties bij de C2&#39;- O- positie bevatten, wordt samen met zijn overeenkomstige zuivering en karakterisering beschreven. Verder is een gedetailleerde beschrijving van de structurele analyse die via CD is uitgevoerd, opgenomen. De vier strengen van RNA (inclusief een streng met een complementaire sequentie) werden verkregen door middel van ...

Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2&#39;- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Het algemene doel van dit verslag is om de procedure voor het verkrijgen van RNA-oligonucleotiden via vaste-fase-synthese te illustreren. RNA-dodecameren zullen als modellen worden gesynthetiseerd, waarbij ook hun zuivering en karakterisering worden gedemonstreerd. Middels het visuele component zal deze publicatie het bereik van de gebruikte methodologieën en faciliteiten verbreden voor onderzoekers in diverse vakgebieden.Het verstrekken van een visueel hulpmiddel, samen met een beknopt protocol, stelt onderzoekers in staat om deze technieken toe te passen. Een voordeel van deze techniek is dat deze zich leent voor een breed scala aan modificaties. Naarmate de huidige toepassingen veeleisender worden, is het belangrijk om over een standaardprotocol te beschikken.De fosforamidietchemie beleeft een heropleving vanwege de robuustheid van de methode en het potentieel voor het verkrijgen van oligonucleotiden voor therapeutische toepassingen. Hoewel het inkopen van oligonucleotiden aantrekkelijk is, verschuiven de prijs en de beschikbaarheid van modificaties de interesse naar het in-house bereiden van deze oligomeren, waardoor deze procedure van het grootste belang is. Om deze procedure te starten, weegt u elk fosforamidiet af in oven-gedroogde amberkleurige flesjes van 10 milliliter en sluit u elk flesje af met een septum dat vooraf is geperforeerd met een naald van 20 gauge.Plaats de flessen onmiddellijk onder vacuüm met behulp van een desiccator die een droogmiddel bevat. Nadat de desiccator is gevuld met droog argon, wordt elke fles verwijderd en onmiddellijk voorzien van watervrij acetonitril voordat deze op een peptide-synthesizer met vaste fase wordt bevestigd. Verwijder vervolgens de septa van elke fles en plaats deze op de synthesizer via een fleswissel-functie.Om de vaste-fase-synthese op te stellen, selecteert u het software-icoon. Selecteer de naam van de synthesizer en klik op OK. Maak vervolgens een nieuwe synthese aan door Bestand en Nieuwe Syntheseorder te selecteren. Gebruik daarna het promptvenster om de run-datum, de klant en de run-ID in te voeren. Selecteer het instrument, de sequentienaam en de sequentie.Wijs onder het tabblad Cycle de eerder gemaakte methode toe. Kies vervolgens de handmatige End Procedure, waardoor het oligonucleotide gebonden blijft aan de CPG-hars. Selecteer DMT Off.Sla het bestand op door File en Save As te selecteren. Geef vervolgens een naam op voor het experiment en klik op Save. Verstuur daarna het bestand om de synthese te starten door Order en Send Order to Synthesizer te selecteren. Selecteer in het promptvenster een kolompositie en klik op OK. Selecteer in het Synthesizer-venster Trityl Monitor.Klik op Choose Function en Trityl Monitor elke stap door 1 te typen. Start de synthese door Synthesizer en Prepare to Start te selecteren. Plaats de kolommen met het gewenste 3'-uiteinde op de op het instrument aangegeven posities.Klik vervolgens op Start en No op het instrument. Zodra de synthese is voltooid, verwijdert u de kolom uit het instrument en plaatst u deze in een rondbodemkolf. Droog de kolom onder vacuüm gedurende ongeveer 0,5 uur.Overbreng de witte hars van de kolom naar een centrifugebuis van 1,6 milliliter en voeg 0,5 milliliter van een waterige methylamine- en ammoniakoplossing toe. Sluit de dop van de centrifugebuis af met parafilm en verhit de inhoud gedurende anderhalf uur tot 60 graden Celsius. Plaats een zwaar voorwerp bovenop de buizen om ervoor te zorgen dat de concentratie constant blijft.Na afkoeling tot kamertemperatuur wordt het monster kort gecentrifugeerd om de inhoud naar beneden te spinnen. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis. Koel de buis vijf minuten lang af tot 70 graden Celsius door deze in een bad van droogijs en ethanol te plaatsen, en concentreer daarna tot droogte met behulp van een speed vac-concentrator.Resuspendeer nu de vaste stoffen in 0,4 milliliters van een amine-trihydrafluoride-oplossing en sluit de dop vervolgens af met laboratoriumfolie. Verwarm de oplossing gedurende anderhalf uur tot 60 graden Celsius. Plaats een zwaar object bovenop de buisjes om een constante concentratie te waarborgen.Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u 0,04 milliliters van een natriumacetaatoplossing toe, gevolgd door voorzichtig mengen met een pipetpunt. Voeg één milliliter ethanol toe en koel de oplossing gedurende 15 minuten af tot ongeveer 70 degrees Celsius met een droge-ijs-ethanolbad. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende tien minuten bij 15.000 RPM bij vier degrees Celsius.Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en droog het resulterende pellet onder verminderde druk. Resuspendeer na het drogen de verkregen vaste stof in laadbuffer en meng tot de oplossing homogeen is. Laad vervolgens de suspensie op een eerder bereide polyacrylamidegel.Zet een stroom door de gel tot de bromothymolblauw-marker zich tussen de helft en twee derde van de gel bevindt. Nadat de gel uit het statief is gehaald, wordt de inhoud van de gel van het glas overgebracht naar de plastic folie en op een dunne-laag-chromatografieplaat bedekt met silica geplaatst, om de banden met een UV-lamp te visualiseren. Gebruik een marker om de positie van de bovenste band aan te geven en snijd deze uit met een scheermesje.Plaats de gel met het RNA in een conische buis van 50 milliliter en verbrijzel deze tot kleine stukjes met een glazen staaf. Suspendeer de gelresten vervolgens in een waterige natriumchloride-oplossing en schud de suspensie 12 uur lang bij 37 graden Celsius. Breng de suspensie over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze vervolgens 10 minuten bij 3400 RPM.Om het monster te onzouten met een reverse-phase C18-cartridge, wordt de cartridge eerst gewassen met acetonitril, water, een waterige ammoniumchloride-oplossing en de RNA-oplossing, waarbij de gelresten achterblijven. Na het wassen met water wordt het RNA van de kolom geëlueerd met drie milliliter 60% waterige methanoloplossing in drie verschillende reageerbuisjes. Koel de buisjes vijf minuten lang af tot -70 °C in een bad van droogijs en concentreer de inhoud vervolgens tot droogte met een speed vac-concentrator.Nadat het eluaat onder verminderde druk is ingedampd, wordt het residu opnieuw opgelost in 0,3 milliliters RNase-vrij water. Breng na verdunning van de oplossing één microliter aan op het UV-vis instrument om het UV-vis spectrum tussen 200 en 450 nanometers te meten. Was voor MALDI-TOF analyse eerst een C18 pipetpunt met 50%acetonitrile.Equilibreer de pipetpunt met 0,1% trifluorazijnzuur. Vul vervolgens de pipetpunt met een oplossing die 100 tot 150 picomol monster bevat. Nadat de pipetpunt is gewassen met 0,1% TFA en water, elueert u het monster in een oplossing die de gewenste matrix bevat.Breng 0,9 µL van de oplossing aan op een MALDI-plaat en laat het monster drogen. Voor de analyse van de RNA-structuur wordt het monster met RNA overgebracht naar een microcuvette en geplaatst in de monsterwisselaar van een circulair dichroïsme-instrument. Open de stikstoftank om een stroom te genereren waardoor de luchtvlotter op het instrument naar ongeveer 40 beweegt.Zet vervolgens de koeler aan. Zet nu het instrument aan. Open de software door op het Spectrum Manager-icoon te klikken en open daarna het acquisitievenster door op Spectrum Measurement te klikken.Nadat het instrument is gespoeld met stikstof, worden de circulair dichroïsmespectra verkregen door Measure en Parameters te selecteren. Selecteer onder het tabblad General 200-350 nanometers voor de scan, CD en HT voor de kanalen, 0,1 nanometers voor de datastapgrootte, 100 nanometers per minuut voor de scansnelheid, één nanometer voor de bandbreedte en vijf voor het aantal accumulaties. Kies onder het tabblad Cell Unit 20 graden Celsius.Selecteer onder het tabblad Control de optie Shutter is opened and closed automatically. Voer onder het tabblad Information de naam van het monster, de operator, de concentratie en het oplosmiddel in. Blader onder het tabblad Data naar de gewenste map en klik op OK. Neem de spectra op door te klikken op Measure en vervolgens op Sample Measurement.Identificeer tot slot de posities van de cuvetten in monsterwisselaar één tot en met zes en klik op OK. De vier RNA-strengen werden verkregen via vaste-fase-synthese, en na zuivering leverde dit tussen 300 en 700 nanomoles van elk oligonucleotide op. De MALDI-TOF-chromatogrammen van de oligonucleotiden worden hier getoond. Er is geen groot verschil in de genormaliseerde UV-vis-spectra waargenomen bij vergelijking van de band bij 260 nanometers en canonieke en gemodificeerde oligonucleotiden, ongeacht of enkelstrengse monsters of duplexstructuren worden vergeleken.Er zijn echter geringe veranderingen waarneembaar bij de meting van hun circulair dichroïsmespectra. Daarnaast vertoonden Tm-metingen van de drie duplexstructuren een duidelijk verschil in waarde, wat wees op de destabilisatie veroorzaakt door de incorporatie van de twee prime orthophenylmethyl-modificaties op een van de strengen. Het is belangrijk om te onthouden dat de opbrengst van de vaste-fase-synthese afhankelijk is van de zuiverheid van de reagentia.Vocht zal een negatieve invloed hebben op elke stap, aangezien de aanwezige hoeveelheid water te allen tijde constant moet blijven. De beschreven methodologie is bedoeld om als algemene bron voor wetenschappers te dienen. De techniek kan variëren afhankelijk van de gewenste modificatie, de beschikbare instrumentatie of tijdbeperkingen.Het type chemie dat hier wordt toegepast, vertegenwoordigt een zeer robuuste methodologie die sinds de jaren 80 wordt gebruikt en nog steeds veelvuldig wordt ingezet in zowel academische als industriële omgevingen. Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om de synthese, zuivering en karakterisering van uw eigen gemodificeerde of canonieke RNA- of DNA-oligonucleotiden uit te voeren. Vergeet niet dat het werken met de benodigde reagentia gevaarlijk kan zijn en dat beschermingsmiddelen zoals een veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde gedragen moeten worden.Alle reagentia moeten met zorg worden behandeld, en indien van toepassing in een zuurkast.

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

High-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primerverlenging (SHAPE) gebruikt een nieuwe chemische indringende techniek, reverse transcriptie, capillaire elektroforese en secundaire structuur predictie software om de structuren van RNA bepalen van enkele honderden tot enkele duizenden nucleotiden aan nucleotide resolutie.

RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Fotostabiele cyanine kleurstoffen worden aan oligonucleotiden gekoppeld om hybridisatie te controleren door energieoverdracht.

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Hier presenteren we een protocol om aan te tonen van een efficiënte methode voor de synthese van spirocyclic heterocycles. De vijf-stap proces maakt gebruik van solid-phase synthese en regenereren van Michael linker strategieën. Over het algemeen moeilijk te synthetiseren, presenteren we een aanpasbare methode voor de synthese van spirocyclic moleculen anders ontoegankelijk is voor andere moderne benaderingen.

Solid-phase synthese van [4.4] Spirocyclic Oximes

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (&lt;35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.

2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties

We presenteren een protocol om micro- tot millisecondedynamiek te meten op 13C/15N-gelabeld en ongelabeld RNA met 1H R1ρ  ontspanningsdispersie nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. De focus van dit protocol ligt op het hoogzuiver voorbereiden en opzetten van NMR-experimenten.

Praktische aspecten van monstervoorbereiding en -opstelling van 1H R1ρ ontspanningsdispersie-experimenten met RNA

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Leer de vaste fase synthese van RNA-dodecameren met 2'-O-thiophenylmethylmodificatie en hun karakterisatie via circulaire dichroïsme. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid van nucleïnezuuronderzoek.

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2- O -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme (Video) | JoVE Journal

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2'-

Meer video's verkennen