Overview
Fonte: Laboratorio del Dr. Khuloud Al-Jamal - King's College London
La spettrometria di massa è una tecnica di chimica analitica che consente l'identificazione di composti sconosciuti all'interno di un campione, la quantificazione di materiali noti, la determinazione della struttura e delle proprietà chimiche di diverse molecole.
Uno spettrometro di massa è composto da una sorgente di ionizzazione, un analizzatore e un rivelatore. Il processo prevede la ionizzazione di composti chimici per generare ioni. Quando si utilizza plasma accoppiato induttivamente (ICP), i campioni contenenti elementi di interesse vengono introdotti nel plasma di argon come goccioline di aerosol. Il plasma asciuga l'aerosol, dissocia le molecole e quindi rimuove un elettrone dai componenti che devono essere rilevati dallo spettrometro di massa. Altri metodi di ionizzazione come la ionizzazione elettrospray (ESI) e la ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) vengono utilizzati per analizzare campioni biologici. Seguendo la procedura di ionizzazione, gli ioni vengono separati nello spettrometro di massa in base al loro rapporto massa-carica (m / z) e viene misurata l'abbondanza relativa di ciascun tipo di ione. Infine, il rivelatore consiste comunemente in un moltiplicatore di elettroni in cui la collisione di ioni con un anodo carico porta a una cascata di un numero crescente di elettroni, che può essere rilevato da un circuito elettrico collegato a un computer.
In questo video, la procedura di analisi ICP-MS sarà descritta dal rilevamento di 56Fe come esempio.
Principles
ICP-MS combina una sorgente ICP (plasma accoppiato induttivamente) ad alta temperatura con uno spettrometro di massa.
I campioni devono essere in forma ionica prima di entrare nell'analizzatore di massa per essere rilevati. Il processo di digestione di campioni solidi consiste nell'incubazione di campioni solidi in acido forte e ossidante ad alta temperatura e per un periodo di tempo prolungato a seconda dell'analita metallico. Il campione viene introdotto come aerosol nel plasma ICP (temperatura di 6.000-10.000 K) per essere convertito in atomi gassosi, che sono ionizzati.
L'analizzatore di massa più comunemente usato è il filtro di massa a quadrupolo. Funziona come un filtro elettrostatico che consente solo agli ioni di un singolo rapporto massa-carica (m / z) di raggiungere il rivelatore in un dato momento. Può separare fino a 15.000 dalton (Da) al secondo e quindi è considerato avere proprietà di analisi multi-elementare simultanee. ICP-MS è un metodo molto sensibile che consente il rilevamento di elementi con concentrazioni inferiori a particella per miliardo (ppb) e inferiori a particella per trilione (ppt) per determinati elementi.
Infine, il sistema di rilevamento converte il numero di ioni che colpiscono il rilevatore in un segnale elettrico. Utilizzando standard di taratura (campioni di concentrazione nota per un determinato elemento), è possibile valutare la concentrazione di un campione per uno o più elementi di interesse.
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Procedure
1. Pulizia dei tubi in policarbonato
- Utilizzare tubi in policarbonato resistenti alle soluzioni acide per la digestione dei campioni. Al fine di rimuovere qualsiasi traccia contaminante di ferro, riempire tutti i tubi con 5 ml di 0,1 M HCl.
- Mettere i tubi a bagnomaria per 1 ora a 50 °C.
- Lavare i tubi con 5 ml di acqua Milli-Q e asciugare i tubi in un forno o in una cappa chimica.
2. Preparazione e digestione del campione
- Inserire 200 μL di campione in 1,8 mL di acido nitrico concentrato (65%).
- Mettere i tubi a bagnomaria durante la notte a 50 °C. Regolare il protocollo aumentando la temperatura se è necessaria una riduzione del tempo di digestione complessivo.
- Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.
- Diluire i campioni aggiungendo 8 ml di acqua Milli-Q per ottenere una concentrazione finale di acido nitrico inferiore al 20% (v/v).
- Centrifuga tubi a 3.000 x g per 10 minuti per pellettizzare eventuali residui macroscopici rimanenti.
3. Preparazione dello strumento
- Pulire la torcia ICP utilizzando l'ultrasonicazione in acido nitrico al 5% per 15 minuti. Pulire i coni con il 5% di acido nitrico. Cambiare il tubo peristaltico. Controllare il livello dell'olio della pompa.
- Accendere l'argon e il refrigeratore, avviare il plasma. Avviare il flusso di liquido nel plasma e attendere che lo strumento si stabilizzi, circa 20 minuti.
- Ottimizza le tensioni dell'obiettivo. Eseguire il controllo giornaliero delle prestazioni misurando soluzioni di test contenenti Mg, In e Your per confermare la sensibilità dello strumento ICP-MS. Misurare Ce e Ba dove la forma di ossido e gli ioni a doppia carica dovrebbero rimanere al di sotto del 3%. Controllare la massa a 8 e 220 Da per misurare il segnale di fondo.
- Lo strumento è ora pronto per l'uso.
4. Selezione del metodo dell'utente e dell'elenco dei campioni
- Selezionare l'elemento e gli isotopi di interesse.
- Selezionare la modalità di scansione come salto di picco.
- Scegli un tempo di permanenza di 100 ms (minimo 50) con 40 sweep (minimo 15) per lettura. Selezionare una lettura per replica e 5 repliche (minimo 3). Il tempo totale di integrazione è di 4.000 ms. Se la quantità di campione è limitata, ridurre il tempo di permanenza, il numero di sweep e repliche mantenendo i valori superiori ai valori minimi sopra definiti.
- Utilizzare una portata di ammoniaca (NH3) a 0,7 ml/min per evitare l'interferenza di 40Ar16O sulla determinazione di 56Fe.
- Preparare la curva di calibrazione per gli elementi scelti.
- Eseguire gli esempi.
La spettrometria di massa è una tecnica analitica che consente l'identificazione e la quantificazione di composti sconosciuti all'interno di un campione e la determinazione della loro struttura.
Nella spettrometria di massa, gli ioni in fase gassosa sono generati dagli atomi o dalle molecole in un campione. Gli ioni vengono quindi separati in base al loro rapporto massa-carica, simboleggiato da m / z.
Questa separazione consente la determinazione di informazioni quantitative e qualitative su un campione, come la loro massa e struttura.
Questo video introdurrà i concetti di base e la strumentazione della spettrometria di massa e ne dimostrerà l'uso nella quantificazione degli elementi.
Uno spettrometro di massa è composto da una sorgente di ionizzazione, un analizzatore di massa e un rivelatore. Alla fonte di ionizzazione, i composti sono ionizzati, di solito a una singola carica positiva.
Gli ioni possono essere generati utilizzando varie tecniche, come l'impatto con un fascio di elettroni, plasma o laser, ognuno dei quali provoca una serie di frammentazioni che aiutano nella determinazione della struttura molecolare. Questi metodi sono vagamente raggruppati in ionizzazione "dura" e "morbida".
Le tecniche di ionizzazione dura causano un'ampia frammentazione, con conseguente aumento dei frammenti di massa inferiore.
Le tecniche di ionizzazione morbida provocano una minore, o quasi, frammentazione con un intervallo di massa molecolare elevato.
Se la frammentazione è troppo grande, le preziose informazioni sulla struttura possono andare perse. Se è troppo poco, le piccole molecole non saranno ionizzate in modo efficiente. Pertanto, la selezione di un metodo di ionizzazione dipende dall'analita di interesse e dal grado di frammentazione desiderato.
Gli ioni vengono quindi accelerati in un campo elettrico mentre entrano nell'analizzatore di massa, dove saranno separati.
L'analizzatore di massa più semplice è un settore magnetico, che è composto da un magnete curvo che produce un campo magnetico omogeneo. La forza attrattiva del magnete, più la forza centrifuga degli ioni acceleranti, li fa viaggiare in un percorso circolare attraverso la curva.
Il raggio del percorso circolare degli ioni dipende dalla tensione di accelerazione, dal campo magnetico applicato e dal rapporto massa-carica.
La tensione e il campo magnetico possono quindi essere selezionati per consentire solo alcune specie di rapporto massa-carica attraverso il percorso curvo. Altri ioni si schiantano ai lati del percorso magnetico e vengono persi. Scansionando l'intensità del campo magnetico, gli ioni desiderati raggiungono il rivelatore in momenti diversi, identificando così con precisione ogni specie.
Un altro tipo di analizzatore di massa è il filtro di massa a quadrupolo. Il quadrupolo è costituito da due coppie di aste metalliche parallele, con ogni coppia di aste opposte collegate elettricamente.
Una tensione di corrente continua viene applicata alle coppie di aste e i loro potenziali si alternano continuamente in modo che le coppie siano sempre fuori fase con l'altra.
Il fascio ioiozionale viene quindi diretto attraverso il centro delle quattro aste. Gli ioni viaggiano in un percorso simile a un cavatappi, a causa della costante attrazione e repulsione dalle aste. A seconda del rapporto massa-carica degli ioni, lo ione percorrerà l'intero percorso del quadrupolo e raggiungerà il rivelatore o si schianterà contro le aste.
Ora che le basi dello spettrometro di massa sono state descritte, diamo un'occhiata al suo uso in laboratorio.
Lo spettrometro di massa utilizzato in questo esperimento è uno ionizzatore al plasma accoppiato induttivamente, o ICP, con un filtro a quadrupolo. Lo strumento sarà utilizzato per rilevare e quantificare un componente metallico in un campione.
Per iniziare l'esperimento, riempire tutti i tubi di polipropilene con 5 ml di acido cloridrico 0,1 M al fine di rimuovere qualsiasi traccia contaminante di ferro. Mettere i tubi a bagnomaria per 1 ora a 50 °C.
Dopo l'incubazione, lavare i tubi con 5 ml di acqua deionizzata e asciugare i tubi in un forno o in una cappa chimica.
Nei tubi puliti, aggiungere 1,8 mL di acido nitrico concentrato e 200 μL di campione contenente l'isotopo di interesse.
Seguire le precauzioni di sicurezza quando si utilizza acido concentrato.
Posizionare i tubi a bagnomaria durante la notte. La temperatura può essere aumentata per abbreviare i tempi di digestione, se necessario.
Dopo che il campione è stato digerito, lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 8 ml di acqua deionizzata per diluire i campioni e ottenere una concentrazione di acido nitrico inferiore al 20%. La diluizione finale del campione è 1/50. La concentrazione ideale per l'ICP è nell'intervallo parti per miliardo. Centrifugare i tubi per pellettare eventuali residui macroscopici residui residui.
L'ICP è un metodo di ionizzazione dura che utilizza plasma accoppiato di argon a circa 10.000 °C che è elettricamente conduttivo per ionizzare le molecole campione.
Iniziare la configurazione dello strumento ispezionando la torcia ICP per assicurarsi che sia pulita.
Quindi, ispezionare i coni del campionatore e dello skimmer per assicurarsi che siano anche puliti. Questi coni consentono il campionamento solo della porzione interna del fascio ionica generato dalla torcia ICP e fungono da barriera all'alto vuoto dello spettrometro di massa.
Controllare la pressione dell'argon e avviare il refrigeratore. Avviare il flusso di plasma e liquido nel sistema. Attendere 20 minuti affinché il sistema si riscaldi completamente.
Quindi, aspirare una soluzione di test standard, che contiene vari standard elementari noti. La soluzione di prova deve essere selezionata per coprire l'intervallo di massa previsto della soluzione analita.
Quando viene stabilito il flusso della soluzione, inizializzare e testare lo strumento secondo le linee guida del produttore.
Per eseguire lo strumento, selezionare prima gli elementi e gli isotopi di interesse. Quindi impostare la modalità di scansione su peak hopping.
Selezionare cinque repliche per misurazione. Impostare ogni replica in modo che contenga 40 sweep di misurazione, ogni sweep con un tempo di permanenza di 50 ms. Il tempo totale di integrazione è di 2.000 ms per replica.
Preparare una curva di calibrazione per gli elementi scelti misurando soluzioni standard pre-preparate.
Infine, eseguire il campione, in questo caso, nanoparticelle di ossido di ferro. Determinare la concentrazione di ferro utilizzando la curva di calibrazione del ferro.
La spettrometria di massa viene utilizzata in una vasta gamma di applicazioni utilizzando varie tecniche di ionizzazione e analisi di massa.
In questo esempio, un tipo di spettrometria di massa a ionizzazione morbida, chiamata tempo di volo di ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice, o MALDI-TOF, è stato utilizzato per analizzare proteine ad alto peso molecolare. Con MALDI, le molecole vengono stabilizzate con una matrice, per diminuire il frazionamento quando le grandi molecole sono ionizzate.
La soluzione proteica e la matrice sono state entrambe individuate sulla piastra MALDI pulita e asciugate. La piastra MALDI è stata inserita nello strumento e il campione analizzato.
L'analisi di composti volatili e sensibili all'ossidazione è stata misurata utilizzando la spettrometria di massa a ionizzazione elettronica, una tecnica di ionizzazione dura.
In primo luogo, è stato progettato un sistema di tubi bloccabili per consentire l'evacuazione completa del tubo, seguita dal caricamento del campione sotto raffreddamento da azoto liquido.
La provetta del campione è stata collegata alla porta di ingresso e il campione è stato caricato nello strumento. Lo spettro di massa del campione in questo caso tris (trifluorometil) fosfato, è stato quindi analizzato.
Uno spettrometro di massa a fascio molecolare accoppiato con radiazione di sincrotrone è stato utilizzato per esplorare la struttura elettronica delle molecole e dei cluster in fase gassosa.
Il fascio molecolare, integrato con la radiazione di sincrotrone, ha fornito un metodo di ionizzazione selettiva per sondare le molecole in fase gassosa.
Il campione è stato caricato nell'ugello, l'ugello ricaricato nello strumento e il fascio di fotone ha permesso di entrare nella camera.
Lo spettro di massa è stato quindi raccolto e confrontato con i dati di efficienza della fotoionizzazione al fine di determinare la struttura elettronica delle molecole.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla spettrometria di massa. Ora dovresti capire la strumentazione di base della spettrometria di massa e come eseguire un'analisi di base basata sulla spettrometria di massa.
Grazie per l'attenzione!
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Results
L'analisi ICP-MS di campioni contenenti nanoparticelle di ossido di ferro è mostrata di seguito. Una curva standard è stata effettuata utilizzando la concentrazione nota di 56Fe (Figura 1). Il coefficiente di correlazione vicino a 1 (R2 = 0,999989) ha mostrato la buona relazione lineare tra le concentrazioni del campione e l'intensità misurata dal rivelatore. I campioni di interessi hanno mostrato valori all'interno dell'intervallo di calibrazione (Figura 2). Le concentrazioni calcolate dal software sono state poi regolate in base alla diluizione effettuata durante il protocollo. Il presente protocollo descriveva una diluizione di 1/50 a seguito della diluizione in acido (1/10) e in acqua Mili-Q (1/5). Ad esempio, è stata misurata una concentrazione di 51,427 μg/L per il numero di campione 51 (Figura 2). La concentrazione del campione originale era 50 volte superiore corrispondente a 2,57 mg/L.
Figura 1. Curva di calibrazione per 56misurazioni Fe. Quattro punti standard (0,01, 0,1, 1 e 10 μg/mL) mostrano un coefficiente di correlazione (R2) di 0,999989. Ciò conferma la buona relazione lineare tra l'intensità del segnale rilevata e le concentrazioni di riferimento.
Figura 2. Risultati rappresentativi a seguito di misurazioni ICP-MS su campioni di nanoparticelle di ossido di ferro. La concentrazione di ciascun campione diluito viene calcolata automaticamente in base alla curva di calibrazione definita.
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Applications and Summary
I campi ambientali e geologici rappresentano il primo utilizzo per ICP-MS ad esempio per misurare i contaminanti presenti nell'acqua, nel suolo o nell'atmosfera. La presenza di contaminanti ad alta concentrazione nell'acqua del rubinetto come Fe, Cu o Al può essere monitorata utilizzando ICP-MS.
Anche i campi delle scienze mediche e forensi utilizzano il rilevamento ICP-MS. In caso di sospetto di avvelenamento da metalli come l'arsenico, campioni come sangue e urina possono essere analizzati utilizzando ICP-MS. Questa tecnica può anche fornire preziose informazioni in caso di patologia che coinvolge preoccupazioni metaboliche o problemi epatologici con conseguente scarsa escrezione di alcuni elementi.
ICP-MS consente la quantificazione dei metalli in qualsiasi materiale. Nella Figura 3,la concentrazione di Fe è stata misurata in nanoparticelle e correlata alle loro proprietà di risonanza magnetica (MRI). ICP-MS fornisce una quantificazione affidabile di Fe di diverse nanoparticelle per discriminare quali nanoparticelle sono le più efficienti per l'applicazione di imaging.
Un'altra applicazione è quella di studiare la biodistribuzione delle nanoparticelle associate ai metalli. La Figura 4 presenta la biodistribuzione d'organo di nanoparticelle contenenti ossido di ferro nei topi dopo iniezione endovenosa. A 24 ore, ogni organo è stato raccolto e digerito in acido nitrico concentrato fino a raggiungere la digestione completa degli organi. La concentrazione di 56Fe è stata quantificata da ICP-MS. I risultati mostrano una maggiore concentrazione di 56Fe nel fegato e nella milza per i topi iniettati con nanoparticelle rispetto agli organi di animali naïve. Pertanto, si è concluso che le nanoparticelle si accumulano principalmente negli organi epatici e della milza.
Figura 3. Misurazione della risonanza magnetica (MRI) della funzione delle nanoparticelle della loro concentrazione di Fe. Sono state utilizzate cinque concentrazioni di ferro (0,25, 0,5, 0,75, 1 e 1,25 mM) che sono state utilizzate per le loro proprietà MRI (tasso di rilassamento, R2*).
Figura 4. Biodistribuzione di nanoparticelle di ossido di ferro a seguito di iniezione endovenosa nei topi. Campioni naïve mostrano il livello basale dell'organo di ferro nei topi non trattati. Dopo l'iniezione di nanoparticelle contenenti ossido di ferro, aumenta la quantità di ferro in alcuni organi che è associata all'accumulo di nanoparticelle.
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