Name: Hechting van bacteriën te planten oppervlakken gemeten in het laboratorium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer een eenvoudige methode om bacteriële hechting aan plantenwortels te meten met microscopie en viabele celbepaling. Deze techniek is snel, goedkoop en waardevol voor onderzoek naar plantpathologie en voedselveiligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteur Bedankt Susan Whitfield voor de voorbereiding van de cijfers en Camille Martin en Hillary Samagaio voor hulp met een aantal van de experimenten.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
<li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11932192">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
<li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

De auteur verklaart dat ze geen concurrerende financiële belangen heeft.

Het is belangrijk om zich bewust zijn van alle van de oppervlakken die bacteriën kunnen zich tijdens het experiment. Dus bacteriën die kunnen binden aan glas kunnen worden onderschat als levensvatbare cellen worden gedaan met behulp van glazen buizen en pipetten. Als planten worden geteeld in agar of bodem en een aantal van de agar of bodem op de planten blijft kunnen vervolgens de bacteriën binden aan de daaraan vastzittende materiaal in plaats van de planten. Aan de andere kant, het oppervlak van de plant, met name in het geval van wortels, wassen kan verwijderen natuurlijke oppervlaktecoatings zoals slijm en dus het veranderen van de resultaten van tests van de hechting.
Het is belangrijk om er zeker van zijn dat de bacteriën toegevoegd aan het mengsel van incubatie levend tijdens het experiment blijven. Levensvatbare cellen graven van zowel de gratis als de bijgevoegde bacteriën moeten dus regelmatig plaatsvinden. Sommige behandelingen of bacteriële mutaties kunnen verminderen van de bacteriële groei of daadwerkelijk leiden tot de dood van een breuk van de bacteriële bevolking. Levende en dode bacteriën mogelijk niet te onderscheiden in de Microscoop tenzij speciale vlekken worden gebruikt. Er is een nuttig vlek kit voor wonen/dode bacteriën, die afhangt van de uitsluiting van kleurstoffen uit de levende bacteriën. Echter, als een gemengde bevolking van bacteriesoorten aanwezig is dan levensvatbare cellen graven van de soorten van belang is waarschijnlijk de gemakkelijkste manier om te bepalen of de incubatie heeft geresulteerd in de bacteriële dood.
Middellange samenstelling zal beïnvloeden bacteriën overleven en groeien. Root afgescheiden en materialen vrijgelaten uit de wond en snijd sites bieden substraat om bescheiden bacteriële groei te ondersteunen. Ijzer, fosfaat en stikstof de neiging om in deze omstandigheden worden beperkt. Hechting kunnen van invloed zijn divalente kationen, zoals calcium en magnesium. In sommige gevallen kan koolstofbron hechting beïnvloeden. pH ook belangrijk. In het algemeen is de pH van de rhizosfeer tussen 5,5 en 6,5.
Er moet worden voorzichtig bij het gebruik van bacteriën die zijn gemarkeerd met resistentie tegen antibiotica. De meest gebruikte antibiotica zijn rifampicine en nalidixic zuur. Resistentie tegen deze antibiotica is over het algemeen als gevolg van mutaties in chromosomale genen (RNA polymerase en gyrase, respectievelijk) en dus niet gemakkelijk overdraagbaar aan een andere spanning tijdens de incubatie. Dit soort weerstand ook niet leidt tot de afbraak of de wijziging van het antibioticum. Markering van bacteriën met een marker gene plasmide-gedragen wordt niet aanbevolen tenzij het plasmide kan niet worden overgebracht naar een andere bacteriën. De resistentie tegen antibiotica moet niet als gevolg van aantasting of chemische modificatie van het antibioticum zoals antibiotica gevoelige bacteriën vervolgens kundig op antibiotica platen groeien zitten zal als zij zich dicht bij de resistente bacteriën bevinden.
De in dit document beschreven methoden zijn handig voor kleine steekproeven en/of experimenten waar de monsters moeten worden opgenomen (bijvoorbeeld experimenten met menselijke pathogenen). Bij grote steekproeven (boven 100 g materiaal of meer dan 50 planten) zou andere methoden of drastische wijziging van deze methoden nodig10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. de aanwezigheid van grote aantallen micro-organismen dan de soorten bestudeerd kan ook aanzienlijke problemen opleveren. Mogelijke oplossingen omvatten het gebruik van bacteriën die zijn gemarkeerd met een fluorescente proteïne of antibiotica-resistentie, zoals beschreven in stappen 6.1.2 en 7.3. Echter wanneer de bacteriën van belang zeldzame individuen in een grote populatie van andere micro-organismen zijn kunnen deze markers niet toereikend zijn om ondubbelzinnige eenbeoordeling van de nummers van de bacteriën wordt bestudeerd.
Al de hier beschreven methoden zijn op basis van laboratoriumtechnieken. Kleine wijzigingen nodig zou zijn voor broeikasgassen studies. Meer belangrijke wijzigingen dreigen te worden vereist voor veldstudies waar protozoa, insecten en andere dieren predatie en klimaat variatie bemoeilijken de levering van bepaalde voorwaarden voor de experimenten. Deze methoden kunnen in de toekomst worden uitgebreid tot de interactie van twee of meer micro-organismen op het oppervlak van de plant.

De meting van de bacteriële binding aan oppervlakken plant is belangrijk in drie verschillende situaties geworden. De eerste situatie is het onderzoek van de overdracht van ziekteverwekkers van de mens op plant oppervlakken,1,,2,3. Het doel hier is om te voorkomen dat de bacteriële binding of te verwijderen of afhankelijke bacteriën te doden en dus om de overdracht van ziekten door plantaardig materiaal. De tweede situatie is het onderzoek naar de binding van plant ziekteverwekkers aan oppervlakken4planten. Nogmaals het doel hier is om te voorkomen dat bindende of te verwijderen of afhankelijke bacteriën te doden en daarmee aan het verminderen van de ziekte. De derde situatie is het onderzoek naar de binding van de symbiotische of plant-groeibevorderende bacteriën5,6. Het doel hier is om bacteriële bindend en dus aan verhoging van de gezondheid van planten en gewassen oplevert.
De technieken voor het meten van de bacteriële binding aan planten van oppervlakken die in dit artikel beschreven zijn goedkope en relatief gemakkelijk uit te voeren. De enige vereisten zijn een microscoop en materialen vindt u meestal in een laboratorium voor bacteriologie. Voor sommige technieken is een ultrasoonapparaat Bad handig. De beschreven technieken zijn ontworpen voor het binden van experimenten uitgevoerd met behulp van relatief kleine steekproeven. Metingen van bindend worden gemaakt in het laboratorium, hoewel het mogelijk is dat sommige van deze technieken voor het gebruik in de serre of in het veld wijzigen.
Deze technieken zijn gebruikt voor het meten van de bacteriële binding aan de wortels, spruiten, gesneden bladeren, gesneden fruit en intact cherry tomaten in het laboratorium7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Ze zijn ook gebruikt om te meten wortel kolonisatie van planten die groeien in de bodem of in het laboratorium16zand. De technieken zijn gebruikt met veel bacteriesoorten en Agrobacterium tumefaciens Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas fluorescens. Een nuttige beschrijving van methoden voor de beoordeling van de interactie van A. tumefaciens met oppervlakken kan worden gevonden in Morton en Fuqua (2012)17. In alle gevallen is de omvang van de steekproeven betrokken waren klein, over het algemeen minder dan 25-50 planten. De beschreven technieken zijn geschikt voor gebruik met menselijke pathogenen die moeten worden staande gehouden tijdens de experimenten.

<table><tbody><tr><td>lichtmicroscoop</td><td>elke</td><td>N/A</td><td>Phasecontrast- of Nomarski-optiek is nuttig, voor onderzoek met fluorescerende markers is een fluorescentiemicroscoop vereist.</td></tr><tr><td>zaden</td><td>elke&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Noteer het zaadpartijnummer en de cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bad sonicator</td><td>elke wetenschappelijke leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>voedingsagar&nbsp;</td><td>Difco&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Zand</td><td>zeesand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>zand</td><td>&nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>er zijn veel verschillende maten beschikbaar om bij het type plant te passen dat je wilt kweken</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>elke wetenschappelijke leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS-zouten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrifugaat</td><td>elke wetenschappelijke onderneming</td><td>N/A</td><td>om de meeste bacteriën alleen een kleine centrifuge met een maximale kracht van 10.000 XG nodig is</td></tr><tr><td>vortexmixer</td><td>elke wetenschappelijke onderneming</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-Rafter tellcel</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatiekamer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>nalidixinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dode kleuring</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

hechting van bacteriën te planten oppervlakken gemeten in het laboratorium

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Dit manuscript beschrijft een methode voor het meten van de bacteriële binding aan een plant oppervlakken in de lichte Microscoop en door het gebruik van levensvatbare cellen. Plantaardig materiaal gebruikt bevatten spruiten, wortels, bladeren en fruit snijden. De beschreven methoden zijn goedkoop, eenvoudig en geschikt voor kleine steekproeven. Bindende wordt gemeten in het laboratorium en een verscheidenheid van incubatie media en voorwaarden kan worden gebruikt. Het effect van remmers kan worden bepaald. Situaties die bevorderen en remmen binding kunnen ook worden beoordeeld. In sommige gevallen is het mogelijk om te onderscheiden of verschillende omstandigheden bindende voornamelijk te wijten aan hun effecten op de plant of op de bacteriën veranderen.

A. tumefaciens koloniseert wortel oppervlakken. Om te bepalen of bacteriële productie van cellulose een rol bij de kolonisatie van de wortel speelt, de effecten van bacteriële mutaties waardoor cellulose synthese waren onderzocht16. De technieken beschreven in stap 1.3 en 7.1 werden gebruikt. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in steriel water. Wanneer de wortels ongeveer 2 cm lang waren waren ze ondergedompeld in een suspensie van 105 bacteriën per mL en geplant in gepasteuriseerde bodem in containers. De planten werden gekweekt voor 14 dagen bij 25 ° C op een 12 h licht/12 h donker cyclus. Na de aangegeven tijden de planten werden verwijderd uit de containers. De wortels werden gewassen en sonicated in een bad ultrasoonapparaat afhankelijke bacteriën te verwijderen. Bacteriële aantallen werden vastgesteld met behulp van levensvatbare cellen. Figuur 2 toont het effect van twee verschillende cellulose-minus mutaties op het vermogen van de bacteriën te koloniseren tomaat wortels. Hoewel de standaarddeviaties van sommige metingen waren zo hoog als 0.9 log10 (een veelvoorkomend probleem bij dit soort meting) de afname van de binding van de cellulose-minus mutanten is duidelijk en kunnen we concluderen dat de bacteriële productie van cellulose helpt de bacteriën in de kolonisatie van de wortels van de tomaat.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figuur 2 : Root kolonisatie door wild type en cellulose-minus mutanten van A. tumefaciens. Log10 totaal aantal bacteriën per cm wortel lengte verhaald tomaat wortels geënt met wild type A. tumefaciens stam C58 en cellulose-minus mutanten C58:1 en C58:A60. De getallen zijn de middelen van een minimum van vier afzonderlijke experimenten. Staven geven de standaarddeviaties van de middelen. Wortels waren geënt door dompelen hen in een suspensie van 105 bacteriën per mL voor één min. De planten zijn geteeld in containers en de losjes aanhangend bacteriën werden verwijderd door het wassen van de wortels in de buffer in een glazen ampul wassen. Strak aanhangend bacteriën werden verwijderd met behulp van een bad ultrasoonapparaat en de resulterende schorsing verguld en controleer of levensvatbare cellen telt16. Dit cijfer is gewijzigd van Matthysse en McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De rol van exopolysaccharides in de binding van E. coli en andere bacteriën alfalfa spruiten werd onderzocht. Verontreinigde alfalfa spruiten hebben sommige uitbraken van diarree ziekte als gevolg van E. coli O157:H7 zijn opgespoord. Binding van de wild-type bacteriën en mutanten niet in staat om verschillende exopolysaccharides werd gemeten met behulp van de methoden in stap 1.1, 5.1 en 7.2 beschreven. Alfalfa spruiten waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd voor één dag in steriel water bij 25 ° C in het donker. Vier spruiten met bijgevoegde zaad jassen werden geplaatst in steriele kunststof gerechten met 5 mL water. Bacteriën gekweekt in Luria Bouillon werden toegevoegd aan een eindconcentratie van ongeveer 5 x 103 per mL. De geënte spruiten werden geïncubeerd bij 25 ° C in het donker voor 3 dagen. De spruiten waren tweemaal met 5 mL steriel water in een flesje gewassen door krachtige inversie en gehomogeniseerd in wassen buffer met behulp van een motoraangedreven Teflon glas homogenizer. Eerdere experimenten met behulp van bacteriën zijn voorzien van een plasmide die het GFP-gen toonde geen verinnerlijkte bacteriën Hoewel oppervlak bacteriën werden gemakkelijk waargenomen. De resultaten worden weergegeven in tabel 1. Twee stammen van E. coli O157:H7 werden onderzocht. In beide stammen verscheen de productie van poly-β-1,6-glucuronic acid(PGA) de grootste bijdrage te leveren aan de binding van de pathogene E. coli te planten oppervlakken. Colon zuur speelde ook een belangrijke rol in bindende. Terwijl de afname van de binding in cellulose-minus mutanten aanzienlijk was was het niet zo groot als die voor de andere twee polysacchariden.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effecten van mutaties in Exopolysaccharide productie genen op bindende van E. coli O157:H7 spruiten en open zaad jassen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Bacteriële stam</td>
			<td rowspan="2">Mutatie of genotype (relevante fenotype)</td>
			<td colspan="2">Log10 aantal bacteriën gebonden per stronk of zaad jas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa spruitenb
</td>
			<td>Open zaad jassen</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Geen (wild type)</td>
			<td>4.7 ± 0,6</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>2.9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (Colon zuur-minus)</td>
			<td>1.8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Geen (wild type)</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (Colon zuur-minus)</td>
			<td>3.9 ± 0,5c
</td>
			<td>4,8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">een gemiddelde ± standaardafwijking van ten minste drie metingen van het aantal (log10) voor bacteriën gebonden na 3 dagen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b spruiten werden gewassen voor meting.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c wijkt sterk af van het wilde type: P < 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d wijkt sterk af van het wilde type: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: gevolgen van mutaties in exopolysaccharide productie genen voor de binding van E. coli O157:H7 aan spruiten. Om te bepalen van de rol van verschillende exopolysaccharides en lipopolysaccharide in de binding van pathogene E. coli stammen van de O157:H7 aan alfalfa spruiten, de binding van een aantal mutanten aan de spruiten en open zaad jassen werd onderzocht met behulp van de methoden beschreven in stap 6. De resultaten toonden aan dat poly-ß-1, 6 -N-acetyl-D-glucosamine (PGA) lijkt te zijn essentieel voor binding met spruiten en dat zowel cellulose en colanic zuur zijn vereist voor maximale binding van E. coli O157. Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.
Om te bepalen als de productie van PGA voldoende om te leiden tot bacteriële binding is aan planten oppervlakken, een plasmide (pMM11) uitvoering van de gekloonde operon codering van de genen die nodig is voor de PGA werd productie geïntroduceerd in twee verschillende bacteriën die niet zou gewoonlijk kunnen binden aan tomaat wortels10. A. tumefaciens A1045 is een mutant van de wild type stam C58 die er niet in slaagt te maken van cyclische-β-1,2-glucaan en ook niet lukt om te binden aan de plant oppervlakken29. Sinorhizobium meliloti 1021 die wortel knobbeltjes vormen op alfalfa niet binden aan niet-peulvruchten zoals tomaat12. De technieken beschreven in stap 1.1, 5.1, 6.3 en 7.1 werden gebruikt om te bepalen als de mogelijkheid om PGA over het algemeen bacteriële binding aan wortel oppervlakken toegenomen. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in steriel water. Wortels waren in segmenten 1 cm in de lengte gesneden en geplaatst in steriel water en de bacteriën zijn geënt. Aangezien deze twee soorten bacteriën tegen verschillende tarieven groeien, werd bindende gemeten op verschillende tijdstippen te voorzien in ongeveer gelijke hoeveelheden van bacteriële groei. De aanwezigheid van de plasmide-pMM11 veroorzaakt een soortgelijk aanzienlijke toename in het aantal afhankelijke bacteriën van beide soorten (tabel 2)10. Een aanzienlijke toename van de bindende werd ook gezien in de lichte Microscoop maar de binding was heel anders voor de twee soorten (Figuur 3). A. tumefaciens A1045 gebonden als afzonderlijke bacteriën op het oppervlak van de wortel. S. meliloti gebonden in grote clusters waarin slechts een paar van de bacteriën rechtstreeks zijn met de wortel verbonden en de meerderheid van de bacteriën waren gekoppeld aan andere bacteriën. Dit voorbeeld laat zien dat het simpelweg het analyseren van het aantal bacteriën gebonden zonder met inbegrip van microscopische opmerkingen een misleidende indruk van de resultaten van een experiment geven kan. Hoewel beide methoden (levensvatbare cellen en microscopische opmerkingen) dat pMM11 verhoogd bacteriële binding aan tomaat wortels tonen, was het soort bindende veroorzaakt door de productie van PGA verschillend voor de twee bacteriesoorten10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Het Effect van de plasmide-pMM11 op de Binding van bacteriën naar de wortels van de tomaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bacteriële stam</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Afhankelijk van het aantal bacteriën per mm wortel lengte</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045een
</td>
			<td>geen</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA synthese)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>geen</td>
			<td>geen gevonden</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>geen gevonden</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA synthese)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">een bacteriële binding werd gemeten na 2 uur</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b bacteriële bindende was maatregel na 18 uur</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: het effect van een plasmide die binding van genen voor de synthese van PGA A. tumefaciens A1045 en S. meliloti 1021 tomaat wortel segmenten. Om na te gaan van het vermogen van poly-ß-1, 6 -N-acetyl-D-glucosamine (PGA) ter bevordering van de binding van bacteriën te planten wortels, het effect van een plasmide toekenning van de mogelijkheid om PGA (pMM11) op de binding van twee stammen van bacteriën plant-geassocieerde wortels van de tomaat werd onderzocht. Noch spanning van bacteriën toonde significante binding met tomaat wortels in de afwezigheid van de plasmide of in aanwezigheid van de plasmide zonder de genen coderend voor PGA synthese (pBBR1mcs). De toevoeging van de plasmide uitvoering PGA synthese genen verhoogd bindende door beide soorten bacteriën. Omdat A. tumefaciens sneller groeit dan S. meliloti bindend Na incubatie gedurende A. tumefaciens per 2 uur en na 18 h voor S. melilotiwerd gemeten. De gebruikte technieken zijn die beschreven in stap 7. Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figuur 3 : Het effect van de plasmide pMM11 uitvoering van de PGA biosynthese genen op de binding van A. tumefaciens A1045 en S. meliloti 1021 aan tomaat wortel haren. Binding met tomaat wortel haren van A) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021, en D) S. meliloti 1021 pMM11. Hoewel de toename van de binding van de twee bacteriesoorten ruwweg gelijkaardig is zijn de details van de binding zoals gezien in het licht van de Microscoop heel verschillend. De gebruikte technieken zijn die beschreven in stap 6. Dit cijfer is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Het is soms mogelijk om te binden aan niet-biologische oppervlakken gebruiken om te helpen bij het onderscheiden van de bijdrage van de bacteriën en de plant in een specifieke interactie. De unipolaire polysaccharide(UPP) van A. tumefaciens is aangetoond te kunnen bemiddelen bacteriële binding aan een verscheidenheid van beide oppervlakken van biologische en niet-biologische30. Calcium werd waargenomen voor de remming van de binding van A. tumefaciens te planten oppervlakken gemedieerd door de UPP28. Om te bepalen dat of de remming door calciumionen van bacteriële binding aan oppervlakken plant te wijten aan een effect op de bacteriën of op het oppervlak van de plant is, de binding van de bacteriën op nylon draden werd onderzocht. De technieken worden beschreven in stap 8.2 werden gebruikt. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in water zoals beschreven in stap 1. De bacteriën werden gekweekt in minimaal medium met sacharose en toegevoegd aan de tomaat wortels of nylon draden op een eindconcentratie van ongeveer 105/mL zoals beschreven in stap 5.1. Het effect van toegevoegde CaCl2 op bacteriële binding aan tomaat wortels en nylon draden werd in de microscoop onderzocht. Figuur 4 toont een soortgelijke remming van bindende door calcium met behulp van beide oppervlakte suggereren dat het effect van calcium voornamelijk op de bacteriën10 is.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figuur 4 : Het effect van calcium op de binding van A. tumefaciens aan tomaat wortel haren en nylon draden. A. tumefaciens was geïncubeerd met tomaat wortels (A en B) of nylon draden (C en D) gedurende 24 uur in een 1:10 verdunning van MS zouten en een 1:20 verdunning van AB minimaal medium, 0,4% sucrose (A en C) of in een 1:10 verdunning van MS zouten en 1:20 verdunning van AB minimaal medium , 0,4% sacharose met 60 mM CaCl2 (B en D)31. De toegevoegde CaCl2 geremd bacteriële binding aan zowel de wortels als de nylon draden wat suggereert dat de remming voornamelijk te wijten aan een effect op de bacteriën in plaats van op het oppervlak van de plant was. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Een eenvoudige methode voor het meten en karakteriseren van bacteriële hechting op planten, met name wortels en spruiten, wordt in dit artikel beschreven.

Hechting van bacteriën te planten oppervlakken gemeten in het laboratorium

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Het algemene doel van deze procedure is om de binding van bacteriën aan plantoppervlakken te observeren en te meten. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in zowel de plantpathologie als in de voedselveiligheid. In het bijzonder kan het vragen beantwoorden over hoe bacteriën zich aan plantoppervlakken binden en hoe ze kunnen worden verwijderd.Het grote voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, snel en goedkoop is. Om zaailingen die in water zijn gekweekt voor te bereiden, plaats je een klein aantal zaden in een glazen beker van 30, 50, 100 of 150 milliliter. Hier worden tomatenzaden gebruikt.Bedek de zaden met 80% ethanol en slinger kort. Laat de zaden vervolgens een minuut weken. Giet de ethanol af en dompel de zaden onder in een oplossing van 50% commercieel bleekmiddel en 0,1% Triton X-100 en tappenwater.Laat de zaden 20 minuten of langer weken als de zaden groot zijn, zoals bonenzaden. Giet het bleekmengsel af en was de zaden drie keer met steriel water, waarbij de zaden voor elke wasbeurt een minuut in het water laten weken. Giet de zaden en een kleine hoeveelheid water in een steriele petrischaal en incubeer de zaden in het donker tot de zaailingen de gewenste grootte bereiken, tussen één centimeter en 10 centimeter.Om zaden of zaailingen die in zand zijn gekweekt voor te bereiden, innoculeer de zaden of zaailingen na het steriliseren van de zaden en plantmaterialen met bacteriën volgens het tekstprotocol. Maak met een steriele glazen staaf een ondiepe gat in het zand, net diep genoeg om het zaadje onder het oppervlak te plaatsen. Plaats het zaadje in het gat en bedek het met een dunne laag zand.Gebruik dan afdichtfolie om de bovenkant van de container te verzegelen om verlies van water en binnendringen van extra microben te voorkomen. Laat de planten in het laboratorium groeien onder licht of in de kas op een geschikte temperatuur en daglengte voor de soort en variëteit van de plant. Plant de zaailingen in het zand.Gebruik een steriele glazen staaf om een gat te maken. Gebruik vervolgens een steriele roestvrijstalen haak om de wortel voorzichtig in het gat te leiden en gebruik zand om de zijden van het gat te vullen. Na het incuberen van planten met bacteriën volgens het tekstprotocol, bereid een monster voor voor microscopie door het in een druppel water of incubatiemedium op een microscoopglaasje te plaatsen en het direct te observeren.Als er geen zichtbare vrije bacteriën zijn, kan er bacteriële dood zijn opgetreden of kunnen bacteriën zich aan het container hebben gebonden waarin de incubatie werd uitgevoerd. Was het monster in water of incubatiemedium door het in een flesje vloeistof te plaatsen en het flesje voorzichtig om te draaien. Plaats vervolgens het monster op het microscoopglaasje in verse vloeistof voor observatie.Gebruik een gewoon dekglas om het monster te monteren. Als het monster dik is en een bult vormt, voeg je het vloeistof en het monster toe aan de put van een pers, pas een dekglas toe dat een ring van rubber of plastic rond de rand heeft. Plaats het glaasje erop en druk voorzichtig om het dekglas aan het glaasje te verzegelen.Keer het glaasje om om het monster te onderzoeken. Gebruik alternatief een algentellingsglaasje en dekglas op een vergelijkbare manier en bekijk het met maximaal 20 keer vergroting. Om het aantal levensvatbare bacteriën te bepalen dat aan planten die in zand zijn gekweekt, begint u met het verwijderen van het afdichtmateriaal van de boven- en onderkant van de container.Plaats de container over een stuk steriel papier en klop de container zachtjes tegen het oppervlak om het zand los te maken voordat u het zand voorzichtig samen met de plant uit de container tilt. Wanneer de cilinder van zand en de plant vrij zijn op het papier, verdeel het zand in het midden om de plantwortel te onthullen. Indien gewenst, neem monsters van het zand van nabij de rand van de container en van nabij de wortel.Dit kan nuttig zijn om de verspreiding, accumulatie en groei van bacteriën te bepalen. Neem de wortel op en verwijder het zand en de bacteriën die losjes zijn gehecht door de wortel in een gemeten volume water of buffer te dompelen en voorzichtig te schudden. Bepaal het aantal levensvatbare cellen van de bacteriën in de resulterende suspensie door deze op geschikte media zoals luria-agar te plateren.Dit vertegenwoordigt het aantal bacteriën dat losjes met de wortel is geassocieerd. Verwijder tenslotte de stevig gebonden bacteriën door sonicatie en bepaal hun aantal. Deze grafiek toont het effect van twee verschillende cellulose-min mutaties op het vermogen van de bacteriën om tomatenwortels te koloniseren.Hoewel de standaarddeviaties van sommige metingen zo hoog waren als 0,9 logaritme basis van 10, is de vermindering in binding van de cellulose-min mutanten duidelijk zichtbaar. In dit experiment werd de binding aan alfalfa-spruiten van wild type E.Coli 0157:H7 in mutanten die niet in staat waren om verschillende exopolysachariden te maken, gemeten. In beide stammen leek de productie van poly-beta een zes glucuronzuur, of PGA, de grootste bijdrage te leveren aan de binding van pathogene E.coli aan plantoppervlakken.Colaninezuur speelde ook een belangrijke rol bij de binding. Hier werden twee stammen bacteriën die zich niet aan plantoppervlakken konden binden, ontworpen om PGA te produceren om te bepalen of het voldoende is om bacteriële binding aan tomatenwortels te veroorzaken. In het geval van A.tumefaciens A1045, zorgde PGA ervoor dat de bacteriën zich individueel aan het worteloppervlak bindden.Aan de andere kant bond S.meliloti zich in grote clusters, waarbij slechts een paar van de bacteriën direct aan de wortel waren bevestigd, en de meerderheid van de bacteriën aan andere bacteriën waren bevestigd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan een uur worden gedaan voor de initiële opstelling, plus incubatietijd, en tussen 10

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit protocol is een eenvoudige bacteriële hechting test die bestaat in het tellen van de aantallen van bacteriële kolonievormende eenheden die in acht worden genomen op gekweekte cellen. De test is robuust, onafhankelijk van de adhesine bestudeerd en er zijn ontelbare variaties gebruikt in de meeste laboratoria werken aan bacteriële pathogenese.

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Source: Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the evaluation of bacterial attachment to plant roots using phase-contrast microscopy. Root samples from seedlings incubated with bacteria are first mounted to check for free bacteria. The samples are then washed to remove loosely attached bacteria and remounted using a suitable coverslip to prevent damage. Finally, the number of bacteria attached to the root...

Microscopy-Based Evaluation of Bacterial Attachment to Plant Root Surfaces

Source: Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp., (2018)This video demonstrates a protocol for measuring root colonization of tomato seedlings by wild-type and cellulose-deficient pathogenic bacteria. Viable counts of tightly adhering bacteria show greater adhesion and microcolony formation by the wild-type strain, highlighting cellulose’s role in stable root colonization.

Assessing Root Colonization of Tomato Seedlings by a Pathogenic Bacterium Using Viable Cell Counts

Source: Harris, S. L., et al. Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a protocol for monitoring the colonization of root-associated bacteria on Arabidopsis thaliana seedlings grown in a soilless system. Following colonization, bacteria are dislodged by sonication, then diluted, plated, and incubated to form colonies that reflect bacterial attachment and viability.

Monitoring Bacterial Colonization of Arabidopsis thaliana Roots in a Soilless System

This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.

Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Kolonisatie van plantengroeibevorderende rhizobacteriën (PGPR) in de rhizosfeer is essentieel voor de groeibevorderende werking. Het is noodzakelijk om de detectiemethode van bacteriële rhizosfeerkolonisatie te standaardiseren. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode voor het kwantificeren van bacteriële kolonisatie op het worteloppervlak.

Bacteriële kolonisatie meten op wortels van Arabidopsis thaliana in hydrocultuur

Leer een eenvoudige methode om bacteriële hechting aan plantenwortels te meten met microscopie en viabele celbepaling. Deze techniek is snel, goedkoop en waardevol voor onderzoek naar plantpathologie en voedselveiligheid.

Hechting van bacteriën te planten oppervlakken gemeten in het laboratorium

Meer video's verkennen