Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью

Общая цель этой процедуры заключается в измерении экспрессии генов репортерных конструкций после их введения в клетки алейрона ячменя путем бомбардировки частицами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы экспрессии генов, регулируемых растительными гормонами, например, как специфические сигнальные молекулы действуют для регуляции абсцизовой кислоты в гены, индуцированные ячменем. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает более высокую пропускную способность по сравнению с предыдущими методами, что позволяет тестировать большое количество генных конструкций и условий инкубации.

Демонстрировать протокол будет Грейс, студентка моей лаборатории. Сначала поместите несколько беззародышевых зерен в крышку 90-миллиметровой пластиковой чашки Петри, содержащей 20 миллилитров раствора для приема и 20 микролитров левомицетины. С помощью стерильных щипцов аккуратно снимите прозрачную семенную оболочку с каждого зернышка.

Очистка семенной оболочки от зерен ячменя является критически важным этапом. Если оболочки семян не будут полностью удалены, микроносители золота не смогут проникнуть в алейроновые клетки. Но если пилинг проводить слишком грубо, клетки алейрона могут быть повреждены.

Очистив оболочку семян от всех зерен, переложите их из чашки Петри на вермикулитовую пластину. Затем поместите очищенные зерна без зародыша в инкубатор при температуре 24 градуса Цельсия на 16-20 часов. Теперь пометьте бирку объемом в одну целых пять миллилитров от каждой процедуры, которая будет включена в эксперимент по бомбардировке.

В каждую пробирку добавьте две целых пять десятых микрограмма внутренней контрольной плазмиды люциферазы UBI, две целых пять десятых микрограмма репортерной плазмиды GUS и желаемое количество эффекторной плазмиды. Добавьте в каждую трубку сверхчистую воду, чтобы довести общий объем до пяти микролитров. Для каждой обработки добавляйте 50 микролитров микроносителей, взвешенных в 50% глицерине, в каждую точку пятимиллилитровой пробирки, содержащей плазмидную ДНК.

На заключительном этапе процедуры кодирования микроносителей пипеткой нанесите восемь микролитров взвешенных микроносителей на каждый из пяти макроносителей и дайте им высохнуть на воздухе. Настройте аппарат для бомбардировки частицами, включив вакуумный насос, открыв гелиевый клапан, а затем включив систему подачи частиц. Поместите разрывную мембрану с давлением 1550 фунтов на квадратный дюйм в стопорную крышку и установите ее на систему подачи частиц.

Поместите макроноситель, содержащий желаемую комбинацию плазмид со стопорным экраном, в сборку запуска микронесущей. Вставьте узел в верхний паз бомбардировочной камеры. Затем расположите восемь беззародышевых зерен плотным радиальным узором с более тонкими концами, направленными внутрь, на круг фильтровальной бумаги, который приклеен скотчем к крышке чашки Петри объемом 90 миллилитров

Поставьте тарелку с зернами в бомбардировочную камеру на расстоянии шести сантиметров от стопорного экрана. Закройте дверцу и нажмите на вакуумный выключатель, чтобы откачать бомбометательную камеру до 95 килопаскалей. Быстро поверните вакуумный выключатель в положение удержания.

Затем удерживайте переключатель огня, чтобы бомбардировать образец. После сброса вакуума переложите подвергшиеся бомбардировке зерна в маркированную 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую четыре миллилитра раствора для приема с одним миллиграммом на миллилитр левомицетины. Повторяйте до тех пор, пока не будут завершены все бомбардировки.

Затем инкубируйте подвергшееся бомбардировке зерно на встряхивающей платформе со скоростью 100 об/мин при температуре 24 градуса Цельсия в течение 24 часов. С помощью щипцов извлеките восемь бомбардированных зерен из 60-миллиметровой чашки Петри и промокните их насухо на бумажном полотенце. Разделите зерна на две промаркированные двухмиллилитровые трубки, каждая из которых содержит 800 микролитров буфера для помола и пятимиллиметровую бусину из нержавеющей стали.

Повторив предыдущий шаг для всех бомбардируемых зерен, поместите до 48 двухмиллилитровых пробирок в две стойки гомогенизатора шариков. Затем установите штативы на гомогенизатор и встряхивайте образцы при 30 герц в течение трех минут. Когда закончите, снимите решетки с гомогенизатора и поместите их на лед на пять минут, чтобы повторно охладить образцы.

Теперь установите стойки на гомогенизатор в обратном направлении. Снова встряхните образцы с частотой 30 герц в течение трех минут. Сняв решетки с гомогенизатора, поместите их на лед на пять минут для повторного охлаждения образцов.

После этого центрифугируйте зерновые экстракты при 16 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Сразу после центрифугирования сцедите прозрачную надосадочную жидкость во второй комплект микроцентрифужных пробирок. Кратковременно перебейте каждую пробирку и храните на льду.

После переноса надосадочной жидкости извлеките гранулы из нержавеющей стали из гранул, чтобы их можно было промыть и использовать повторно. Теперь добавьте 200 микролитров буфера для анализа ГАС в каждую лунку 96-луночного планшета. Поместите по 50 микролитров каждого зернового экстракта в одну из лунок и перемешайте наконечником пипетки.

Затем заклейте верхнюю часть пластины герметизирующей пленкой. Поместите планшет на 96 лунок в инкубатор в темноте при температуре 37 градусов Цельсия на 20 часов. После инкубации центрифугируйте 96-луночный планшет при температуре 4000 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Когда закончите, поставьте тарелку на лед. Теперь добавьте 250 микролитров карбоната натрия в каждую лунку черной 96-луночной пластины. Добавьте шесть целых два, пять микролитров каждой центрифугированной смеси для анализа GUS в каждую лунку черной пластины и перемешайте с наконечником пипетки.

Включают лунки с шестью целыми две пять микролитров по 10-40 на 100 микромоляров, четыре метилумбеллиферона в качестве стандарта. Поместите черную пластину в пластинчатый флуориметр. Считывание флуоресценции метилумбеллиферона, устанавливая коэффициент усиления прибора, таким образом, что лунка, содержащая шесть целых две целых пять микролитров 40 микромоляров, четыре метилумбеллиферона и 250 микролитров ноль целых две целых молярного карбоната натрия, дает показания 100 единиц флуоресценции.

В этом эксперименте репортерная конструкция HVA1 GUS была введена в алейроновые клетки вместе с эффекторной конструкцией UBI TaABF1. В то время как соотношение TaABF1 и HVA1, составляющее всего лишь ноль целых ноль целых, было достаточно, чтобы вызвать трехкратную индукцию репортерного гена HVA1 в отсутствие экзогениса, абсисовой кислоты или ABA. Более высокие уровни конструкции TaABF1 приводили к постепенному увеличению экспрессии HVA1 в зависимости от дозы.

Как экзогенис ABA, так и TaABF1 могут сильно индуцировать экспрессию репортерной конструкции HVA1 GUS. В любом случае, присутствие одного бутанола сильно ингибировало индукцию HVA1, что позволяет предположить, что фосфолипаза D может играть важную роль в активации экспрессии гена HVA1 ABA через TaABF1. Было показано, что АБК сильно ингибирует индуцированную гиббереллин экспрессию репортерной конструкции Amy32b GUS.

При этом ни перекись водорода, ни нитропруссид натрия не вызвали сколько-нибудь значительного снижения. Таким образом, эти результаты не подтверждают роль оксида азота и перекиси водорода в ответах алейроновых клеток на АБК. После освоения этот метод может позволить измерить множество различных образцов на экспрессию генов за относительно короткое время.

Например, бомбардировка 200 различными образцами зерна может быть произведена двумя следователями за пару часов. Затем, на следующий день, один исследователь может приготовить все белковые экстракты за два часа. Модифицированный анализ ГУС, проводимый в 96-луночных планшетах, также требует гораздо меньше трудозатрат, чем другие протоколы, которые используются в будущих пробирочных анализах.