Name: Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri l'analisi clonale di precursori staminali ematopoietici embrionali utilizzando l'index sorting di singole cellule con co-coltura di cellule endoteliali. Questo metodo permette di identificare proprietà fenotipiche e potenziale di innesto in vivo.

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Vorremmo ringraziare Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden nel Fred Hutchinson flusso Cytometry nucleo per assistenza con FACS. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione di istituti nazionali di salute NHLBI UO1 #HL100395, accessorie collaborativo Grant #HL099997 e NIDDK concedere #RC2DK114777. Brandon Hadland è supportato da di Alex Lemonade Stand della Fondazione e Hyundai Hope su ruote Foundation.

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<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
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<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazi...

Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento1. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche2. Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto in destinatari adulti condizionati, non vengono rilevati fino a dopo giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nell'embrione murino, a bassissima frequenza3 . Durante il loro sviluppo, precursori di HSC (pre-HSC) derivanti dall'endotelio hemogenic devono essere sottoposti a maturazione prima di acquisire la proprietà di HSC adulto che consentono per efficiente attecchimento nel trapianto saggi4,5 , 6. oscurando lo studio rari HSC origine, una moltitudine di progenitori ematopoietici con degli eritrociti, mieloidi e linfoidi potenziale sono già individuati prima l'emergere di HSC da pre-HSC7,8. Così, distinguendo pre-HSC da altri progenitori ematopoietici richiede metodi clonally isolare cellule e fornire loro i segnali sufficienti per la loro maturazione per HSC, per rilevare le loro proprietà di attecchimento in saggi di trapianto.
È state descritte una serie di approcci che consentono il rilevamento di pre-HSC di maturazione sia ex vivo o in vivo di HSC. Ex vivo metodi hanno dipendeva da coltura di tessuti embrionali, come la regione AGM, dove il primo HSC vengono rilevati in sviluppo9. Sulla base di questi metodi, protocolli che incorporano la dissociazione, l'ordinamento e ri-aggregazione dei tessuti AGM hanno permesso la caratterizzazione delle popolazioni ordinati contenenti precursori di HSC durante lo sviluppo da E9.5 per E11.5 in para-aortica Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioni4,5,10; Tuttavia, questi approcci non sono suscettibili di analisi di alto-rendimento dei precursori a livello di singola cellula necessari per l'analisi clonale. Allo stesso modo, maturazione in vivo da trapianto in topi neonati, dove il microambiente è presunta per essere più adatto per il supporto delle precedenti fasi di precursori HSC, ha permesso anche gli studi delle popolazioni ordinati dal sacco vitellino e AGM / P-Sp (P-Sp è la regione di precursore per l'AGM) con caratteristiche di pre-HSC, ma questi metodi anche non riescono a fornire una piattaforma robusta per singola cella analisi11,12.
Gli studi da Rienzi et al hanno dimostrato che quello stroma Akt-attivata delle cellule endoteliali (EC) può fornire un substrato di nicchia per il supporto dell'adulto HSC auto-rinnovamento in vitro13,14,15. Abbiamo recentemente hanno determinato che la CE Akt attivato derivato dalla regione AGM (AGM-CE) fornisce una nicchia adatta in vitro per la maturazione dei precursori hemogenic, isolato più presto E9 in sviluppo, per HSC adulto-capacità di integrazione, così come la successiva auto-rinnovamento di generato HSC16. Dato che questo sistema utilizza una semplice 2-dimensionale co-coltura, è facilmente adattabile per analisi clonale del potenziale HSC di precursori hemogenic individualmente isolato.
Recentemente abbiamo segnalato un approccio di saggiare le potenzialità HSC di precursori hemogenic clonale combinando Indice ordinamento dei precursori hemogenic individuali da embrioni murini con AGM-CE co-cultura e successiva analisi funzionale nel trapianto analisi di17. Indice di ordinamento è una modalità di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) che registra (indici) tutti i parametri fenotipici (cioè, parametri di forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescenza) di ciascuna cella individualmente ordinato tale che questi caratteristiche possono essere correlati in modo retrospettivo per successiva analisi funzionale seguendo l'ordinamento. FACS software registra sia informazioni fenotipiche per ogni cella e la posizione/pozzetto della piastra 96 pozzetti in cui è stato disposto. Questa tecnica è stata utilizzata precedentemente elegantemente per identificare eterogeneità nell'adulto HSC, determinare parametri fenotipici che ulteriormente arricchiscono per il sottoinsieme di attecchimento a lungo termine di HSC e correlano parametri fenotipici di HSC con trascrizionale Proprietà presso la singola cella livello18,19. Qui, forniamo metodologia dettagliata di questo approccio che consente l'identificazione di parametri univoci fenotipici e contributi di lignaggio di pre-HSC durante le prime fasi dello sviluppo embrionale.

<table><tbody><tr><td>Terreni di coltura AGM-EC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali per la coltura di cellule endoteliali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Da utilizzare per dissociare i monostrati AGM-EC</td></tr><tr><td>Gelatina 0,1% in acqua</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Da utilizzare per far aderire i monostrati AGM-EC alla plastica</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Da utilizzare per la co-coltura di monostrati AGM-EC e cloni selezionati</td></tr><tr><td>per l'indice Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Da utilizzare per la dissezione e la colorazione FACS</td></tr><tr><td>Flaconi filtranti da 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>Da utilizzare per filtrare in modo sterile Terreni di coltura endoteliali</td></tr><tr><td>AGM-EC (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 ml di</td></tr><tr><td>siero fetale bovino Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml di</td></tr><tr><td>penicillina streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml di</td></tr><tr><td>eparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg disciolta in 10 ml di terreno</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Mitogeno endoteliale (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Aggiungere 10 ml di terreno per sciogliere e aggiungere</td></tr><tr><td><forte>Materiali per l'indice AGM sort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi (0,25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Utilizzare per la dissociazione dei tessuti embrionali</td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Utilizzare per filtrare sterili le soluzioni anticorpali per FACS</td></tr><tr><td>0,22 e micro; M filtro a siringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Utilizzare per filtrare sterile le soluzioni anticorpali per FACS</td></tr><tr><td>Provetta in polistirene da 5 ml con tappo</td> filtrante <td>Corning</td><td>352235</td><td>Utilizzare per rimuovere i grumi cellulari prima del FACS</td></tr><tr><td>DAPI (preparato come stock da 1 mg/ml in H2O)</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>Utilizzare per escludere le cellule morte dal tipo</td></tr><tr><td>anti-topo CD16/CD32 (blocco FcR)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Utilizzare per bloccare la colorazione non specifica dei recettori Fc</td></tr><tr><td>Antibodies for AGM index sort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Colorazione</td></tr> di <tr><td>ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PE-Ciana7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Controllo dell'isotipo per CD144 PE-Cianina7</td></tr><tr><td>Anti-topo CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Controllo dell'isotipo per CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-topo CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PE</td><td>BD Biosciences</td> 553925 <td>Controllo dell'isotipo per CD41 PE</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Controllo dell'isotipo per CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-terreni privi di siero (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 ml di</td></tr><tr><td>fattore di cellule staminali murine ricombinanti (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml</td></tr><tr><td>di FLT3 ricombinante umano (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml</td></tr><tr><td>di trombopoietina umana ricombinante (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml</td></tr><tr><td>di interleuchina murina ricombinante 3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Materiali per la colorazione di cellule co-coltivate</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>piastra a <tr><td>96 pozzetti, fondo a V</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Utilizzare per l'analisi FACS</td></tr><tr><td>Anticorpi per l'analisi di cloni selezionati in Index co-coltivati con cellule endoteliali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PE-Cianina5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Controllo dell'isotipo per CD45 PerCP-Cianina5.5</td></tr><tr><td>Anti-topo CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Controllo dell'isotipo per CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-topo Ly-6A / E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Controllo dell'isotipo per Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-topo F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Colorazione</td></tr> del <tr><td>ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Controllo dell'isotipo per F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-topo Ly-6G/C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Colorazione del</td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo IgG2b kappa di ratto, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C e CD3 FITC</td></tr><tr><td>Materials per l'iniezione della vena caudale per trapianto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml siringhe da insulina con aghi da 29G 1/2" BD</td><td>Biosciences</td><td>309306</td><td>Utilizzare per l'iniezione della vena caudale per il trapianto</td></tr><tr><td>Anticorpi per l'analisi del sangue periferico dopo translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo di ratto IgG2a kappa, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>Controllo dell'isotipo per F4/80 PE</td></tr><tr><td>Anti-topo CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Anti-topo CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>Colorazione del</td></tr><tr><td>ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Controllo dell'isotipo per CD19 APC</td></tr><tr><td>Anti-topo CD45.1 (A20) PE-Cianina7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>Colorazione</td></tr> di <tr><td>ratto IgG2a kappa Controllo isotipico, PE-Cianina7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>Controllo isotipo per CD45.1 PE-Cianina7</td></tr><tr><td>Anti-topo CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>IgG2a kappa Controllo isotipico, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>Controllo isotipo per CD45.2 APC-eFluor780</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II con software DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II con lettore di piastre</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>Per contare le cellule</td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>Per </td></tr><tr><td>software di analisi FACS</td> per celle di dispensazione <td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.

Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina+EPCRalta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per ...

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

L'obiettivo generale di questo metodo è identificare le proprietà fenotipiche e il potenziale di attecchimento delle cellule staminali ematopoietiche clonali o dei precursori delle HSC durante lo sviluppo embrionale murino. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'emopoiesi dello sviluppo sui contributi unici del lignaggio dei precursori clonali delle HSC durante lo sviluppo embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i precursori emogenici vengono analizzati a livello di singola cellula.Ciò consente l'identificazione delle proprietà fenotipiche uniche che distinguono i rari precursori delle HSC. Inizia aggiungendo Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, tessuti sezionati da embrioni tra 9,5 e 11,5 giorni dopo il coito a un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS integrato con il 10% di FBS su ghiaccio. Quando i tessuti si sono depositati sul fondo della provetta, aspirare il surnatante e aggiungere immediatamente un millilitro di collagenasi allo 0,25% ai campioni.Dopo 25 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con un millilitro di PBS più FBS e utilizzare un puntale di pipetta da un millilitr

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Biologia dello sviluppo

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Questo video descrive il protocollo per isolare le HSPC dal midollo osseo e selezionarle utilizzando una tecnica di smistamento cellulare attivata fluorescente, che è un metodo per ottenere HSPC singolarmente selezionate. Coltiviamo queste cellule selezionate per ottenere cloni di HSPC.

Coltura e raccolta di cloni di HSPC: un metodo per ottenere i cloni di HSPC selezionati singolarmente

RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Segnaliamo un metodo affidabile per isolare e coltivare cellule endoteliali primarie specifiche per il tumore da modelli murini geneticamente modificati.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Qui viene presentata una tecnica basata sulla citometria a flusso che consente di misurare simultaneamente il numero di divisioni cellulari, il fenotipo cellulare di superficie e la parentela cellulare. Queste proprietà possono essere testate statisticamente utilizzando un framework basato sulla permutazione.

Valutazione simultanea di parentela, numero di divisione e fenotipo tramite citometria a flusso per cellule staminali e progenitrici ematopoietiche

Questo protocollo descrive l'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando il metodo di selezione a singola cellula. In particolare, l'uso del sorting a singola cellula può raggiungere una purezza del 99% delle cellule immunofenotipizzate da una popolazione eterogenea se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica.

Ordinamento a singola cellula di cellule staminali mesenchimali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani

Scopri l'analisi clonale di precursori staminali ematopoietici embrionali utilizzando l'index sorting di singole cellule con co-coltura di cellule endoteliali. Questo metodo permette di identificare proprietà fenotipiche e potenziale di innesto in vivo.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura (Video) | JoVE Journal

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

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