Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

L'obiettivo generale di questa procedura di amputazione è quello di rimuovere selettivamente e completamente la faringe dalle planarie senza danneggiare altri organi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione. Come il modo in cui le cellule staminali riconoscono gli organi mancanti e ne avviano la rigenerazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto precisa e che altri organi non vengono danneggiati durante il processo. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavo anestetizzando le planarie con azoturo di sodio. Ho notato che l'esposizione all'azide di sodio causava la fuoriuscita della faringe.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'amputazione richiede la corretta selezione degli animali e un'attenta osservazione del movimento e della morfologia degli animali. A dimostrare la procedura sarà Divya Shiroor, studentessa laureata del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per selezionare i vermi che sono stati inseriti da cinque a sette giorni prima in una capsula di Petri pulita.

Posiziona un righello piatto sotto la capsula di Petri per confermare che ogni planaria sia lunga almeno 6 millimetri mentre striscia sulla capsula. Quindi trasferire fino a 20 vermi selezionati in una piastra di Petri da 35 millimetri e utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere tutta l'acqua planaria dalla capsula. Posizionare la parabola sotto uno stereomicroscopio e regolare l'ingrandimento in modo tale da poter osservare più animali.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione di azoturo di sodio da 100 millimolari appena preparata al piatto. Monitorare gli animali senza muovere la capsula per tre o quattro minuti per osservare l'estrusione della faringe. Quando almeno la metà degli animali nel piatto ha completamente esteso una faringe, utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per aspirare e dispensare con forza i vermi intorno al piatto alcune volte.

Se le faringi sono state completamente estese, questo vigoroso pipettaggio ne causerà il distacco. In alternativa, usa un paio di pinze sottili per afferrare la faringe mentre sollevi la planaria verso l'alto verso il menisco. Quando l'animale viene sollevato, la tensione superficiale causerà il distacco della faringe.

Mentre muovi la faringe, fai attenzione a non causare lesioni accidentali agli animali. Le planarie hanno un corpo molto morbido e si danneggiano facilmente, specialmente se in azide di sodio. Usa una pipetta di trasferimento per spostare circa 15 animali amputati in un nuovo piatto contenente acqua planaria fresca e sciacqua i vermi con acqua planaria fresca tre volte.

Assicurati di lavare completamente l'azide di sodio. Anche tracce della sostanza chimica potrebbero causare la lisi degli animali. Quindi incubare i vermi a 20 gradi Celsius per sette giorni.

Il giorno dopo l'amputazione, rimetti i vermi al microscopio per determinare se è visibile una macchia scura sul lato dorsale del verme. Per nutrire i vermi, trasferire un volume appropriato di pasta di fegato in una provetta da microcentrifuga e centrifugare brevemente la provetta per rimuovere eventuali bolle d'aria. Dopo aver stimato il volume del pellet di pasta, aggiungere acqua planaria a un quinto del suo volume.

In base al volume totale nel tubo, aggiungere il due percento di colorante alimentare rosso. Mescolare accuratamente il campione di cibo fino a quando il colorante non è distribuito uniformemente su tutta la pasta e centrifugare brevemente la provetta. Trasferisci gli animali amputati in una nuova capsula di Petri e mettili al buio per circa un'ora.

Al termine dell'incubazione, tagliare a circa mezzo centimetro dall'estremità di un puntale per pipetta P200 e utilizzare il puntale modificato per trasferire 25 microlitri di pasta di fegato rosso nel piatto. Lasciare che gli animali si nutrano per 30 minuti. Quindi posiziona i vermi su uno sfondo bianco per segnare il numero di animali che appaiono rossi.

Dopo circa 6 minuti in soluzione di azoturo di sodio, si può vedere la punta bianca della faringe. Pochi minuti dopo gli animali si contraggono attivamente ed espelleno con forza la faringe dai loro corpi. Dopo circa 11 minuti di esposizione all'azide, gli animali si rilassano e a quel punto la caratteristica forma a campana della faringe diventa chiaramente visibile.

Ora è pronto per l'amputazione. La rimozione di questa grande massa di tessuto non pigmentato provoca la comparsa di una macchia scura sul lato dorsale degli animali amputati. Per monitorare la rigenerazione della faringe in modo più preciso, gli animali possono essere colorati con streptavidina coniugata fluorescente durante la notte.

Combinando il colorante alimentare con la pasta di fegato, gli animali che mangiano possono essere distinti dagli animali che non mangiano. Il numero di animali rossi può quindi essere quantificato per valutare la percentuale di animali con una faringe funzionale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 20 o 30 minuti.

Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di osservare attentamente il movimento planario per individuare quando dovrebbe iniziare l'amputazione. Le amputazioni selettive possono aiutare ad affrontare questioni come il modo in cui le cellule staminali avviano le decisioni appropriate sul lignaggio per realizzare la rigenerazione. Questo video dovrebbe fornire una buona comprensione di come eseguire la rimozione selettiva della faringe utilizzando l'azide di sodio.

Lavorare con l'azoturo di sodio può essere estremamente pericoloso. Ricordati di maneggiarlo sempre con i guanti, di gettare correttamente i rifiuti e di pulire il tuo spazio di lavoro dopo l'esperimento.