Name: Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Apprenez une méthode simple d'isolement de protoplastes de soja pour étudier les mécanismes régulateurs et de signalisation cellulaire. Cette technique produit de grandes quantités de cellules uniformes et facilite l'analyse de l'expression génétique transitoire.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche de génome de plante de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. la croissance des plantes
<ol><li>Semer les graines de soja de 5-10 (82 Williams) dans un pot de 13 cm en serre dans des conditions de jours longs (16 h de lumière à 1 500 µmol m-2 s-1) à 25 ° C sur le mélange de sol personnalisé pour le soya (1:1:1 ratio de sable sol, de perlite et de torpilles).</li>
</ol>2. préparation d’ADN plasmidique
<ol><li>À l’aide d’une pointe de pipette stérile ou un cure-dent, choisir une seule colonie ou stock de glycérol congelés de e. coli portant le plasmide contenant le gène d’intérêt et il inoculer dans 20 mL de milieu liquide de Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés dans un ballon jaugé de 50 mL.</li>
	<li>Incuber le ballon à 37 ° C durant la nuit sur un agitateur. Récolter les germes par centrifugation de la suspension à 12 000 x g à température ambiante pendant 5 min et jeter le surnageant. Extraire et purifier le plasmide suivant la procédure par le fabricant d’un kit de préparation de plasmide.</li>
</ol>3. isolement de protoplastes
<ol><li>Couper les feuilles unifoliées nouvellement agrandis d’un vieux de 10 jours, semis de soya (Figure 1). Remarque : Sélection de feuilles à un stade de développement approprié est la clé du succès pour la préparation de protoplastes de soja. Utilisez uniquement des feuilles juste élargis aux premiers stades du développement. Que les feuilles matures, les parois cellulaires deviennent plus difficiles à digérer.</li>
	<li>Avec une lame de rasoir fraîche, enlever la nervure centrale des feuilles unifoliées et puis couper les restes dans 0,5 à 1 mm des bandes. Remarque : Deux feuilles unifoliées digérés dans 10 mL de solution d’enzyme donnera des protoplastes suffisantes pour plus de 10 transformations.</li>
	<li>La feuille à l’aide d’une paire de pinces, transfert des bandes immédiatement et délicatement dans 10 mL de solution d’enzyme fraîchement préparée (tableau 1) dans un tube de 15 mL. Infiltration sous vide la feuille bandes pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les bandes de feuilles dans la solution enzymatique avec agitation modérée (40 t/mn) sous une lumière faible pendant 4-6 h à température ambiante. Veiller à ce que la solution enzyme vire au jaune-vert comme les protoplastes sont libérés. Vérifier la solution d’enzyme/protoplastes au microscope (X10). Remarque : Les protoplastes libérés sont sphériques en forme, tandis que les cellules non digérées ont une forme ovale ou irrégulière.</li>
	<li>Transférer les 10 mL de solution d’enzyme/protoplaste dans un tube de 50 mL en versant doucement et ajouter 10 mL de la solution W5 (tableau 1) à température ambiante pour arrêter la digestion. Retourner doucement le tube quelques fois. Verser doucement la solution d’enzyme/protoplastes sur une maille de nylon propre 75 µm placée au dessus d’un tube de 50 mL pour enlever les tissus foliaires non digérés.</li>
	<li>Centrifuger la solution intermédiaire enzyme/protoplastes à 100 x g dans le tube de 50 mL pour 1-2 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL sans déranger le culot de protoplastes.</li>
	<li>Remettre en suspension les protoplastes et diluer jusqu'à une concentration de 2 x 105 mL-1 dans une solution W5 réfrigérée à 4 ° C en comptant le nombre de protoplaste sur un Hémacytomètre sous le microscope (x10). Garder les protoplastes sur glace pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante et retirer doucement la solution W5 en utilisant une pipette 1 mL sans déranger le culot de protoplastes. Remettre en suspension les protoplastes dans la solution MMG (tableau 1) à une concentration de 2 x 105 mL-1 à la température ambiante.</li>
</ol>4. transformation de protoplaste
<ol><li>Faites 100 µL d’extraits de protoplastes (2 x 104 protoplastes à 2 x 105 mL-1) à tubes de microcentrifuge de faible adhérence 1,5 mL utilisant uncut pointes de pipette 200 µL. Placer une aliquote de côté pour servir de témoin négatif. Ajouter 10 µL de plasmide (10 à 20 µg) dans chaque portion aliquote reste de protoplastes.</li>
	<li>Ajouter lentement 110 µL de la solution fraîchement préparée de PEG (tableau 1) sur la paroi interne du tube microtubes 1,5 mL et puis retourner doucement et faites pivoter le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène.</li>
	<li>Incuber le mélange de la transformation à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Pour arrêter la transformation, lentement ajouter 400 µL de solution W5 dans le tube de 1,5 mL à température ambiante et retourner doucement le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène. Centrifuger le tube à 100 g pour 1-2 min à température ambiante et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution WI (tableau 1) dans le tube et remettre en suspension par pipetage doucement 1 ou 2 fois. Ajouter 1 mL de sérum de veau stérile (vol/vol) de 5 % dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits à recouvrir la surface et empêcher les protoplastes de coller à la plaque.</li>
	<li>Après quelques secondes, jeter l’aide d’une pipette de sérum de veau. Transférer les protoplastes resuspendues dans un puits de la plaque de culture. Couvrir le plat avec un couvercle.</li>
</ol>5. protoplaste incubation et récolte
<ol><li>Incuber les protoplastes à température ambiante pendant 1 à 2 jours dans l’obscurité. NOTE : Nous avons constaté que deux-jours d’incubation génère un signal de la protéine fluorescente en général par rapport à un jour d’incubation, et que le signal de la protéine fluorescente peut durer jusqu'à 3-4 jours.</li>
	<li>Transférer la solution de protoplastes dans un tube microtubes de 1,5 mL faible adhérence. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante pour récolter des protoplastes. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et transférer 10 µL des protoplastes sur une lame de verre.</li>
	<li>Observer le signal fluorescent sous fluorescence ou microscopie confocale. Utilisez des protoplastes non transformées comme contrôle négatif (aucun signal ne doit être observé).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ce protocole pour l’isolement de protoplastes de soja et de l’application aux études d’expression transitoire a été testé et fonctionne très bien dans notre laboratoire. Les procédures sont simples et faciles et nécessitent des équipements ordinaires et coût minimum. Notre protocole génère de grandes quantités de protoplastes uniforme et de grande qualité par rapport aux méthodes rapportées antérieurement34,35,36,<sup...

Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont enlevé les parois cellulaires. Qu’ils conservent la plupart des fonctions et activités des cellules végétales, les protoplastes sont un système de bon modèle d’observer et d’évaluer les divers événements cellulaires et sont des outils précieux pour étudier l’hybridation somatique1 et2de la régénération des plantes. Protoplastes ont été également largement utilisés pour usine de transformation3,4,5, puisque les parois cellulaires bloquerait sinon le passage de l’ADN dans la cellule. Les protoplastes possèdent certaines des réponses physiologiques et des processus cellulaires des plantes intactes, offrant ainsi une valeur fondamentale dans la recherche fondamentale pour étudier les protéines subcellulaire localisation6,7,8, interactions de protéine-protéine9,10et promoteur activité11,12,13 en vivent les cellules.
L’isolement de protoplastes végétaux a été pour la première fois en 196014 et les protocoles d’isolement et de transformation des protoplastes ont été développés et optimisés. Une procédure normalisée d’isolement de protoplastes implique le découpage des feuilles et la digestion enzymatique des parois cellulaires, suivi par séparation des protoplastes libérés de débris tissulaires non digérés. Stratégies de transformation comprend électroporation15,16, microinjection17,18et à base de polyéthylène glycol (PEG)4,5,19 méthodes. Un large éventail d’espèces ont été signalées avec succès pour l’isolement de protoplastes, y compris les agrumes20, Brassica21, Solanaceae22 et autres plantes ornementales familles23,24. Tandis que les types de tissus différents sont utilisés dans diverses espèces, un système d’expression transitoire dans Arabidopsis protoplast de mésophylle (TEAMP) isolé des feuilles de la plante modèle Arabidopsis thaliana a été bien établi25 et largement adopté pour diverses applications.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) est l’une des plus importantes protéines et huile cultures26. À la différence des Arabidopsis et le riz, obtention de plants de soja transgénique est connu pour être plutôt difficile et faible efficacité. Agrobacterium tumefaciens-médiation infiltration a été populairement utilisée pour des études d’expression génétique transitoire dans les cellules épidermiques en tabac27 et semis dans Arabidopsis28,29, alors que Agrobacterium rhizogenes a été utilisé pour la transformation des racines velues en soja30. Les silencieux approches gène induite par le virus ont été utilisés pour downregulation de cible gènes31,32 et transitoires expression33 de façon systémique. Protoplastes fournissent une alternative utile et polyvalente à ces approches. Les protoplastes peuvent provenir de matériaux hors sol de soja et permettent l’expression du transgène rapide et synchronisée. Cependant, depuis l’isolement succès initial des protoplastes de soja dans les 198334, on a signalé limitée sur l’application des protoplastes de soja35,36,37, 38, principalement en raison des rendements relativement bas de protoplastes de soja.
Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour l’isolement de protoplastes de soja et son application pour des études d’expression génétique transitoire. À l’aide de jeunes feuilles unifoliées de semis de soya, nous avons pu obtenir de grandes quantités de protoplastes vitales en quelques heures. En outre, nous avons optimisé une méthode de transformation PEG-calcium-négociée qui est simple et bon marché pour livrer l’ADN dans des protoplastes de soja à haut rendement.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE « ONOZUKA » R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>maille de nylon</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hémacytomètre</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmide miniprep</td><td>kit Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET GeneJET Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td> Centrifugeuse 5424 eppendorf 22620401 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipeter Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microfuges antiadhésifs et sans RNase, 1,5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Sérum pour veau nouveau-né</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Pépinière</td><td></td><td></td>Ingram’s</tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon, Lennox (poudre)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode simple pour l’isolement de protoplastes de soja et application aux analyses d’expression génétique transitoire

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soja (Glycine max (L.) Merr.) est une espèce de culture importante et est devenu un modèle de légumineuses pour l’étude des voies génétiques et biochimiques. Par conséquent, il est important de mettre en place un système d’expression de gène transitoire efficace chez le soja. Nous rapportons ici un protocole simple pour la préparation des protoplastes de soja et sa demande d’analyses fonctionnelles en régime transitoire. Nous avons constaté que les jeunes feuilles unifoliées de semis de soya résulte en grande quantité des protoplastes de haute qualité. En optimisant une méthode de transformation PEG-calcium-négociée, nous avons atteint l’efficacité de transformation élevés à l’aide de protoplastes unifoliées soja. Ce système fournit un modèle efficace et polyvalent pour l’examen des mécanismes de réglementation et signalisation complexes dans les cellules de soja direct et peut aider à mieux comprendre divers processus cellulaires, physiologiques et du développement des légumineuses.

Différents organes de soja vieux de 10 jours, ont été testés pour la préparation de protoplaste (Figure 1) et les rendements ont été observés au microscope (Figure 2). Les parois cellulaires de l’hypocotyle et épicotyles sont difficilement digérés, et certaines cellules sont restés attachés les uns aux autres (Figure 2 b, 2C). Cotylédon (Figure 2D) et ra...

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir des cellules de protoplastes de haute qualité à partir du soja afin d’examiner les mécanismes de régulation et de signalisation dans les cellules de soja vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les réseaux régulateurs tels que quel est leur gène cible immédiat, le facteur de transfusion ouvert, et quel est leur partenaire d’interaction, ouvrir une protéine. Le principal avantage de cette technique est l’art.Il produit de grandes quantités de cellules de protoplastes de soja uniformes, et c’est simple et facile. En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est très difficile d’obtenir de beaux protoplastes à partir de feuilles de soja à moins d’unifolier à un stade spécifique. La sélection des feuilles à un stade de développement approprié est la clé du succès de la préparation des protoplastes de soja.Coupez les feuilles unifoliées nouvellement développées des semis de soja âgés de 10 jours. Pour s’assurer que lorsqu’un échantillon donne un rendement élevé en protoplastes, prélevez au moins trois échantillons de feuilles unifoliées à des stades de développement légèrement différents. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, retirez la nervure médiane de chaque feuille unifoliée, puis coupez les restes en bandes de 0,5 à un millimètre.À l’aide d’une paire de pinces, transférez délicatement les bandes de feuilles immédiatement dans 10 millilitres de solution enzymatique fraîchement préparée dans un tube de 15 millilitres. Infiltrez le vide dans les bandes de feuilles pendant 15 minutes à température ambiante. Incuber les bandes de feuilles dans la solution enzymatique en agitant doucement sous une faible lumière pendant quatre à six heures à température ambiante.Au fur et à mesure que les protoplastes sont libérés, la solution enzymatique prend une couleur jaune-vert. Vérifiez la solution d’enzyme protoplast au microscope à un grossissement de 10x pour sélectionner l’échantillon avec la meilleure digestion de protoplaste. Les protoplastes libérés sont de forme sphérique, tandis que les cellules non digérées ont des formes irrégulières ou ovales.Pour arrêter la digestion, versez doucement les 10 millilitres de solution d’enzyme protoplast avec la meilleure digestion de protoplast dans un tube de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de solution W5 à température ambiante. Retournez doucement le tube plusieurs fois. Ensuite, versez doucement la solution d’enzyme protoplast dans un filet de nylon propre de 75 microns placé sur un tube de 50 millilitres pour éliminer les tissus foliaires non digérés.Ensuite, centrifugez la solution de protoplaste enzymatique à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, on retire délicatement le surnageant sans déranger la pastille de protoplaste. Suspendez à nouveau le protoplaste dans une solution W5 réfrigérée et maintenez le tube de 50 millilitres sur de la glace.Après avoir compté le nombre de protoplastes sur un hémocytomètre au microscope, diluer à une concentration de deux fois 10 à la cinquième protoplaste par millilitre dans une solution W5 réfrigérée. Gardez le protoplast sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez la suspension à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante.Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, prélever délicatement la solution W5 sans déranger la pastille de protoplaste. Remettre en suspension le protoplaste dans une solution de MMG à température ambiante à une concentration de deux fois 10 à la cinquième protoplaste par millilitre. Pour préparer le protoplaste à la transformation, utilisez des pointes de pipette non coupées de 200 microlitres pour fabriquer des aliquotes de 100 microlitres de protoplastes dans des tubes de microcentrifugation à faible adhérence de 1,5 millilitre.Mettre de côté une aliquote pour servir de contrôle négatif. À l’aliquote restante des protoplastes, ajoutez 10 microlitres d’ADN plasmidique. Ajoutez lentement 110 microlitres de solution de cheville fraîchement préparée sur la paroi intérieure du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.Ensuite, retournez doucement et tournez le tube jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Incuber les mélanges de transformation pendant 15 minutes à température ambiante. Pour arrêter la transformation, ajoutez lentement 400 microlitres de solution W5 dans chaque tube de 1,5 millilitre à température ambiante, et retournez doucement le tube jusqu’à ce que la solution devienne homogène.Centrifugez les tubes à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de solution WI dans chaque tube.Enduisez la surface d’une plaque de culture tissulaire à six puits pour empêcher les protoplastes de coller à la plaque. Ajoutez un millilitre de sérum de veau stérile à cinq pour cent dans chaque puits et, après quelques secondes, retirez le sérum de veau à l’aide d’une pipette. Transférez les protoplastes remis en suspension dans les puits de la plaque de culture et couvrez la plaque avec un couvercle.Avant la récolte, incubez les protoplastes à température ambiante pendant deux jours dans l’obscurité. Après deux jours, transférez la solution de protoplaste dans un tube de microcentrifugation à faible adhérence de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante.Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Transvasez 10 microlitres de protoplaste sur une lame de verre. Observez les signaux fluorescents sous fluorescence ou microscopie confocale en utilisant des protoplastes non transformés comme contrôle négatif.Des cellules de protoplastes ont été préparées à partir de différents organes de soja âgé de 10 jours et observées au microscope. Les parois cellulaires de l’hypocaudale et de l’épicaudale étaient à peine digérées. Et certaines cellules sont restées attachées les unes aux autres.Dans le plomb caudal et la racine, les parois cellulaires n’ont été enlevées que dans une petite partie des cellules. En revanche, un grand nombre de protoplastes ont été observés lors de l’utilisation d’unifolié. Les semis de cette photo de gauche à droite illustrent des feuilles unifoliées qui ne sont pas développées, juste étendues ou complètement développées.Bien que les feuilles unifoliées non expansées et les feuilles unifoliées tout juste expansées aient donné des rendements élevés de protoplastes, la taille des protoplastes de l’unifolié nouvellement expansé était plus uniforme que celle de l’unifolié non expansé. Pour l’unifolié complètement expansé, les parois cellulaires étaient encore intactes dans la plupart des cellules. Le test d’une gamme de différentes quantités d’ADN plasmidique a suggéré que de plus grandes quantités d’ADN entraînaient une plus grande efficacité de transformation.Des images confocales de protoplastes de soja transformés avec la construction qui exprime la GFP fusionnée au gène E1 spécifique de la légumineuse, ont montré une localisation nucléaire de la protéine de fusion E1 GFP, cohérente avec l’étude précédente utilisant le système protoplaste d’Arabidopsis. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser empiriquement chaque condition expérimentale, telle que la sélection de la bonne étape du matériel foliaire, la durée du temps de digestion de la paroi cellulaire, l’âge de concentration et la quantité d’ADN plasmidique pour la transformation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la réplication de l’ARN et des protéines peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels gènes ou quelles protéines sont régulés ou non régulés ?Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des cellules de protoplaste de soja de haute qualité.

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JoVE Journal

Biology

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Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d&#39;âge des plantules Arabidopsis thaliana</em

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Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

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