קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal

שיטה זו מספקת כלי חשוב בתחום שינוי החלבון, ומאפשרת ייצור קל ויעיל של תרופת נוגדנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם קלות הטיפול, התשואה הגבוהה של ייצור הנוגדנים, מהירות התגובה הפסיכודיזית ויציבות הקשר שנוצר. התחל הליך זה עם גידול תאים תלויים HEK כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כאשר הצפיפות של 2.5 מיליון תאים למיליליטר הוא הגיע, להכין פתרון טרי של נגזרת ציקלופרופן של לי לסין, או CpK, ב 1 נתרן הידרוקסיד טוחן. הוסף 2.5 מיליליטר של CpK לביטוי בינוני בתוספת אנטיביוטיקה. מערבבים היטב את הפתרון ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של HCl טוחן אחד, ואז לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 22 מיקרון.

עכשיו צנטריפוגה 125 מיליון תאים בצפיפות היעד במשך חמש דקות ב 500 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, מוסיפים את תערובת ה- DNA-transfection reagent למדיום הביטוי המכיל CpK ולהשתמש במדיום זה כדי לנצל מחדש את התאים. שישה עד שבעה ימים לאחר הוספת CpK, לקצור את trastuzumab נושאת נוגדני CpK מן supernatant על ידי צנטריפוגה התאים במשך 15 דקות ב 3, 000 x גרם.

לאחר מכן, סנן את העל-טבעי. עכשיו להוסיף חיץ לשטוף חרוזים 5x ב 250 צינורות חרוט מיליליטר ומערבבים עם supernatant ולהוסיף את החלבון preequilibrated A שדון. מניחים את הצינור חרוט על רולר במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי למשוך את הנוגדן ואת supernatant.

לאחר הדגירה, מעבירים חלבון שף עם העל-טבעי לעמודה ומאפשרים לנוזל לזרום דרכו. לאחר מכן להוסיף 25 מיליליטר של חיץ לשטוף ולאפשר לזה לזרום דרך. הוסף מיליליטר אחד של חיץ פוספט טוחן אחד, 150 מילימולר נתרן כלורי לצינור האיסוף ולחמק הנוגדן עם ארבעה מיליליטר של 1 נתרן ציטראט ציטראט 3.

הפתרון החומצי מנוטרל מיד כפי שהוא יורד מהטור על ידי הפתרון הבסיסי כבר קיים בצינור האיסוף. לאחר מכן, לדלל את הנוגדן עם 10 מיליליטר של PBS. לרכז את הנוגדן ל 5 עד 1 מיליליטר על ידי סינון צנטריפוגלי ולהחליף את החיץ שלוש פעמים עם PBS.

לטהר את הדגימות על ידי FPLC באמצעות עמודת אינטראקציה הידרופובית בוטיל עם אפס עד 100% הדרגתי של מאגר מלח נמוך במאגר מלח גבוה מעל 30 דקות. לאסוף את כל השברים ולפקח על האלוטיון ב 280 ננומטר. לרכז את השברים המכילים נוגדנים על ידי סינון צנטריפוגלי ולהחליף את המאגר שלוש פעמים עם PBS.

לאחר מכן ניתן לאחסן את הנוגדן בארבע מעלות צלזיוס. מונו-מתיל אורסטטין E, או MMAE, הוא רעיל ביותר. לכן, השתמש בכפפות ומ המשקפיים בעת טיפול בנגזרות MMAE.

אם אתה משתמש ב- MMAE שלא שופץ כפקד, טפל במוצר המוצק בתוך מכסה המנוע של האדים בעת הכנת פתרון המלאי ב- MSO. כדי להצטייד בנוגדן עם מולקולת נושאת טטרזין, לדלל 10 שקילות טוחנת של MMAE טטרזין לכל נוגדן עם 20 microliters של אצטוניטריל ו 76 microliters של PBS בצינור חרוט קטן. הוסף שווה ערך טוחן אחד של טרסטוזומפב הנושא CPK.

מערבבים היטב ומאפשרים להגיב במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי ליצור trastuzumab מקושר MMAE. מולקולות אחרות מלבד MMAE פוטנציאל גדול יותר מעוכב סטרית יותר יכול להיות קשור לנוגדן באמצעות פרוטוקול זה. הוסף את כל עוצמת הקול של התגובה על עמודת הסיבוב ואת הצנטריפוגה ב 1500 x g לדקה אחת.

כדי לנתח את ההטיה, יש לצייד את עמודת HPLC HIC במאגר מלח גבוה ב-100% למשך חמש דקות. ואז לערבב 15 microliters של מיליגרם אחד לכל פתרון מיליליטר של trastuzumab מקושר MMAE עם 15 microliters של מאגר מלח גבוה 2X בבקבוקון. הזרק את התערובת לעמודת HPLC.

אלוט בזרימה איסטוקרטית של מיליליטר לדקה עם חיץ מלח בגובה 100% למשך דקה אחת. בצע זאת עם שיפוע של 15 דקות מ- 100 עד אפס אחוזים של מאגר מלח גבוה במאגר מלח נמוך. לפקח על האלוטיון ב 280 ננומטר.

שלב את הפסגות בכרומטוגרמה עם זמני שמירה של 7.5, 9.2 ו- 11.5 דקות, המתאימים לטרסטוזומפ עם אפס, אחד ושני רעלנים נדנים, בהתאמה. עכשיו, לחשב את DAR על ידי הוספת אזורי הפסגות ב 9.2 דקות, אשר יש משקל של אחד, ו 10.5 דקות, אשר יש משקל של שתיים, ולחלק על ידי השטח הכולל של שלוש הפסגות. כדי לנתח את ההטיה על ידי LC-MS, הראשון, deglycosylate 30 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר ADC ואת הנוגדן ללא שונה בתנאים שאינם מפחיתים באמצעות 250 יחידות של F PNGase לפחות שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס.

להפשיר את הנסיוב ולסנן אותו דרך מסנן 22 מיקרון. ואז למלא את בארות חיצוניות של צלחת 96 באר עם מים. בארות המרכזיות, לערבב טריליקט 90 microliters של סרום עם 10 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר trastuzumab tetramethylrhodamine ב PBS בריכוז הסופי של 1 מיליגרם למיליליטר.

מניחים את הצלחת באינקובטור רווי לחות ב 37 מעלות צלזיוס וארבעה אחוזים CO2. כל 24 שעות לאורך חמישה ימים, פיפטה כל אחד ביסודיות לערבב ולקחת aliquot חמישה microliter. פלאש להקפיא את aliquot עם חנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס.

לאחר איסוף כל הדגימות, הפשיר את האליקוצים ונתח באמצעות ELISA עקיף, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לחלופין, ניתן להשתמש בערכת ELISA מסחרית למדידת הריכוז של ה- ADC. יומיים לפני ההתרפסות, מלאו את בארות החיצוניות של צלחת 96 בארות במים.

לאחר מכן להרים תאים עם 05%טריפסין ב 5 מילימולרי EDTA. צנטריפוגה התאים שלוש דקות ב 250 x g ו resuspend במדיום חדש. ואז זרע 3, 000 תאים ב 100 microliters לגם ב 96 צלחות גם למקם אותם בחזרה לתוך החממה.

יומיים לאחר זריעת התאים, הכן דילול סדרתי של כל הדגימות ב- triplicate עם 1%DMSO בגודל בינוני מלא. עכשיו להוסיף 100 microliters של כל מדגם לתוך כל באר דגירה במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס וארבעה אחוזים CO2. ביום החמישי, למדוד את הכדאיות התא.

לשם כך, השתמש בערכה מסחרית כדי לריס התאים ולמדוד ATP שוחרר. התווה את אחוז האות ביחס לתאי בקרה שטופלו ב- 1%DMSO. ADCs ניתן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים בסרום והווכח עבור cytotoxicity כדי להוכיח יציבות תפקודית.

נוגדן עם ידית ציקלופרופן ניתן להשיג באמצעות הליך זה עם תשואות מעל 20 מיליגרם לליטר לאחר חלבון טיהור. הנוגדן המיוצר יכול להיות במהירות ובאתר במיוחד נדנוד רעלן הנושא טטרזין. עם הטיית הנוגדן עם רעלן, יחס התרופה הממוצע לנוגדנים גדול מ-1.9, כפי שנמדד על ידי כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית.

זהותו של ה- ADC מאושרת על ידי ספקטרומטריית מסה. הקשר דיהידרופירידיזן שנוצר הוא יציב בסרום אנושי במשך למעלה מחמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. תרופת הנוגדנים מדביקה היא חזקה והורגת באופן סלקטיבי תאים עם רמות גבוהות של HER2, ולא תאים עם רמות נמוכות של HER2.

יתר על כן, הנוגדן ללא הרעלן ואת הרעלן שונה עם מקשר tetrazine יש רעילות נמוכה מאוד. הרעלן לבדו מראה רעילות שאינה תלויה HER2 המדגיש את הצורך של מיקוד כדי להשיג סלקטיביות. בעקבות הליך זה, אנו יכולים להכין במהירות וביעילות תרופות נוגדנים תולים לטיפול בגידולים.

באופן פוטנציאלי, כל תרופה מתפקדת עם טטרזין יכול להיות קשור לכל נוגדן מיקוד סמן ביולוגי תא סרטן. ההשלכות של טכניקה זו חלות על כל תותב חלבון המיועד לטיפול או לאבחון.