Name: Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 Nicotiana benthamiana 잎에서 과도식 보관 생산 규모로 트리터펜을 생산하는 방법을. Agrobacterium 진공 침투를 활용하여 고가치 천연 화합물을 신속하게 합성하는 이 기술은 약리학적 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 노 리치 연구 공원 재학 (JR)에 의해 지원 되었다, 공동 공학 및 물리 과학 연구 위원회/Biotechnological OpenPlant 합성 생물학 연구 센터 생물 과학 연구 위원회 BBSRC 자금 부여 (BB / L014130/1) (M.J.S., ㅡ); 존이 네 스 센터 지식 교류 및 상용화 부여 (BB/KEC1740/1) (B.B.); 그리고 BBSRC 연구소 전략적 프로그램 그랜트 '자연에서 분자' (BB/P012523/1)와 존 인 스 재단 (ㅡ). 우리는 조지 Lomonossoff pEAQ 벡터를 제공 하 고 사진에 대 한 앤드류 데이비스에 게 감사 하 고 싶습니다.

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저자는 공개 없다.

넣어 통해 높은 진공 침투가이 프로토콜을을 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 관심의 보관 화합물의 대리점 생산에 대 한 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 진공 침투 기구 쉽게 복제 됩니다. 그러나 진공 저수지의 추가 이다 그것은 단순히 침투 챔버로 수정 되지 않은 진공 오븐 repurpose 수 필요한 진공을 당겨 하는 데 필요한 시간을 감소 하는 것이 좋습니다. 적합 한 콘덴서의 추가 통해 진공 펌프를 보호 하는 것은 이론적으로 합리적인, 하지만 우리의 실험실에서 우리가 발견이 필요 하다.
침투 범위는 나뭇잎 침투 정지에 완전히 몰입 하지 하는 경우 손상 됩니다. 이 문제는 서 스 펜 션의 수준 공장 소유자의 상단 표면에 도달 그리고 식물 홀더 침투 목욕에 대 한 꽉 맞는 함으로써 최소화 됩니다. 때 장소에에서 침투 목욕 공장 소유자의 위쪽 표면에 중단은 그림 2 에서 참고. 이 침투 목욕의 상단으로 앵커 포인트를 형성 하는 소유자의 중간 가장자리에 패널에 의해 이루어집니다. 침투 정지 정지 수준을 유지 하기 위해 정기적으로 추가 해야 합니다. 이것은 가장 큰 batch-wise 침투의 과정을 통해 세600 의 점진적 감소를 방지 하기 위해 과잉 침투 정지의 추가 의해 달성 된다. 그러나, 우리의 손에서 물에 대 한 대체 같지 않습니다 대리점 규모, 예상된 수익률에 눈에 띄는 효과를 비록이 quantitively 조사 되지 않았습니다. 얼마나 많은 식물 침투 서 스 펜 션의 하나의 일괄 처리에서 침투 될 수 있습니다 여전히 열려있는 질문입니다. 우리는 정기적으로 침투 서 스 펜 션의 단일 일괄 처리로 100와 200 식물 사이 침투. 또한, 일부 토양 침투 과정의 과정을 통해 침투 정지로 거르는 것이 정상입니다. 이 아니라 침투 효능에 눈에 띄는 효과가 발견 되었습니다.
수확 하는 동안 그것은 권장 (하지만 중요 하지) 침투 했다 잎만 수확 (일부 잎은 성장 후 침투). 선택적 수확 비생산적인 조직, 그렇지 않으면 관심의 화합물을 기준으로 내 생 불순물의 비율을 증가 것으로 희석을 방지 합니다. 이 다운스트림 정화의 용이성에 대 한 명목상 충격이 고 이러한 프로세스의 규모를 증가 한다. THMGR를 사용 하 여 전조 공급 향상을 necrosed 표현 형 후 침투 성장 기간 동안 개발을 자주 관찰 됩니다. 이것은 정상 고 실제로 선택적 수확 및 다운스트림 건조 과정 합니다. 말린된 잎 가루는 보통 차가운, 건조 하 고, 어두운 장소에서 하지만 이상적으로 진공에서 desiccator 밀봉된 한 콘테이너에서 저장할 수 있습니다. 이 관심의 화합물의 안정성에 따라 달라 집니다. 주의-80 ° C 냉동 고에 저장을 선택 하는 경우. 되도록 건조는 오프닝 전에 실내 온도에 따뜻한이 컨테이너 허용 잎에에서 있고 방수 컨테이너, 저장소, 제거에. 이렇게 하지 않으면 다운 스트림 처리를 방해 하는 잎의 rewetting 발생 합니다.
이 프로토콜의 수확 후 단계 설명을 위해 제공 됩니다 그리고 그 연구자의 실용적인 화학 제한 할 수 있습니다 경험을 돕기 위해. 그들은 많은 다른 천연 제품 추출/정제 기술에 대 한 대체 될 수 있습니다. 그러나에 설명된대로 도입, PSE 많은 장점을, 수도의 상용 PSE 기구 비용 금지 있을 수 있습니다 있으며 중요 하지 않습니다. 기본 이온 교환 수 지 처리 액체/액체 분할 뒤 전통적인 비 누화를 대체 하는 매우 편리한 방법입니다. 그러나, carboxylic 산 그룹 또는 에스테 르 등 기본적인 조건 하에서 분해 될 것 이다 기능적인 그룹을 포함 하는 제품을 위해 적당 하다. 이 제품 기본 이온 교환 수 지에 보관 예상 될 것 이다. 그러나, 잠재적인 캡처를 위해 이것을 악용 및 릴리스 절차 (여기 설명 하지)이 있다. 전통적인 비 누화 적절 한 될 것 이라고, 기본 이온 교환 수 지 처리 편리한 대안 역할. 9, 단계에서 설명 하는 크로마토그래피 방법은 그림 3에 설명 된 화합물에 대 한 일반화할 수 발견 되었습니다. 그러나, 증가 극성의 화합물 100% 에틸 아세테이트 차입 기간이 필요할 수 있습니다. 9.2 단계에 관하여 다운스트림 잘 정화 완전히 복합 특정 이며 또한 규모에 의존. 최적화 된 그라디언트, 작은 규모 플래시 크로마토그래피의 반복된 라운드 일반적으로 NMR 분석에 대 한 적절 한 순도 달성 하기 위해 충분 하다. 큰 저울에 결정 화 자주 편리한 대안 이다. 어려운 경우, 대리점 또는 반 대리점-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 격리 화합물의 원하는 수량에 따라 사용할 수 있습니다. 대표적인 화합물의 범위에 대 한 다운스트림 정화 프로세스의 예 다른8을찾을 수 있습니다.
현재 프로토콜, 여기, 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 유틸리티를 입증 했다. 그러나, 추가 식 플랫폼의 최적화를 위해 아직도 중요 한 범위가입니다. 작업은 얼마나 더 통로 공학 조사를 우리의 실험실에 지속적인 고 단백질 식 레벨의 차동 제어 호스트 세포 독성을 중재 하는 동안 또한, 보관 생산을 향상 시킬 수 있습니다. 또한 있다 잠재적인 세포내 수송 시스템20,21, 조작 및 다른 세포질 구획22,23, 효소 향상 시킬 수 있는 길의 방향을 조사 하 여러 산화 이벤트의 효율성입니다. 잠재적인 혜택 주요 세포의 기본 형태를 수정 하는 또한 탐험 수 있습니다. 예를 들어 애기 thaliana HMGR의 막 도메인의 overexpression 식물24; 바인딩과 그물의 비 대를 유도 하기 위해 관찰 되었습니다. CYP450 활동에 대 한 주요 사이트입니다. 이 프로토콜의 밀리 그램 그램 규모 보관 제품의 수량을 생산 것이 가장 적합 하 고 다운스트림 연구 (예를 들어, 구조 활동의 체계적인 탐사에 대 한 화합물에 액세스 하는 연구에서 채택 될 수 있다 관계, 그리고의 pharmacodynamic pharmacokinetic 속성에 예비 조사 리드 임상 관심사의 화합물). 그러나, 플랫폼은 선형 및 사용, 식물의 수 및 agroinfiltration 통해 과도 식의 실용성을 증가 하면 안정적으로 확장 가능한 입증 되었습니다 제약 단백질의 생산을 위한 산업 규모 14, 이렇게 있다 높은 값 triterpenes의 상업 생산에 대 한 확장을이 플랫폼에 대 한 가능성. 또는, 그것은 또한 최종된 욕망 multigene 생 합성 통로 들고, 대량 재배를 수 있도록 안정적인 transformants의 생산을 구상 하 고 유전자 변형 명 benthamiana 의 ' 농업' 지속적인 긴장 상업적 가치가 다른 화합물을 생산.

triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 모든 천연 제품을 보관 같은 선형 전조 2, 3-oxidosqualene, 식물에 mevalonate 통로의 제품에서에서 파생 될 여겨진다. 2, 3 oxidosqualene의 cyclization 시작 하 고 oxidosqualene cyclases (OSCs) 라고 하는 효소의 가족에 의해 제어. 이 cyclization 단계 자연1에서 보고 되었습니다 데 다른 보관 장비의 수백 다양화의 첫 번째 레벨을 나타냅니다. 이러한 건설 기계는 효소 (CYP450s)1,2포함 하 되이 제한 되지 않고, 시 토 크롬 p450s 조정에 의해 더 다변화 된다. 이러한 생 합성 경로 때로는 부모 보관에서 거의 인식할 수 있는 최종 제품의 결과로 엄청난 복잡성으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어 강력한 살 충 용 및 antifeedant limonoid azadirachtin의 복잡 한 구조 tirucallane 유형3의 tetracyclic 보관에서 믿어진다.
많은 보관 파생 된 천연 제품, 심지어 그 상대적으로 수정 되지 않은 부모 건설 기계, 약 관련 생물 학적 활동4,5,,67을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다.
명. benthamiana 잎에 다른 식물 종에서 보관 생 합성 효소의 일시적인 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품 (그림 1)의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 이 프로세스는 기능적으로 특성화 후보 효소 자연스럽 게-발생 중요 한 대사 산물의 생 합성 경로 재구성 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 또한 악용 될 수 있습니다 소설 보관 제품, 구조 활동 관계의 체계적인 탐사 수 있도록 구조적으로 관련된 유사 체의 라이브러리에서 발생할 수 있는 전략 생산 조합 생 합성 접근 생물학적 활성 화합물8,9.
Agroinfiltration는 과도 식 명 benthamiana 잎에 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 A. tumefaciens 들고 관심의 이진 식 construct(s)의 서 스 펜 션의 침투를 포함 한다. 이 stomata, 세포 공간에 공기를 전치 하 고 A. tumefaciens 현 탁 액으로 교체를 통해 액체 압력의 응용 프로그램을 통해 달성 된다. 박테리아는 침투 잎 조직에 지역화 및 과도 단백질 표정 인 식물 세포의 내부에 각각 T-DNAs를 전송 합니다.
어떤 이진 벡터 적합 한 동안 생성 하는 유전자 변형 식물 과도 식에 대 한 고용 수 있습니다에 대 한 활용 Cowpea 모자이크 바이러스 CPMV 파생 된 Hypertranslational (HT) 단백질 표정 시스템10, 11.이 시스템에서 관심사의 유전자는 번역 되지 않은 영역 (UTR) CPMV RNA-2에서에 의해 형벌 이다. 5' UTR 수정 없이 의존 바이러스 성 복제12와 단백질 번역의 매우 높은 수준의 결과 포함 합니다. 이 기술은 복제 프로토콜 호환 구문 (pEAQ-HT-DEST)10,11사이트별 재결합을 포함 하는 쉬운 및 빠른 (pEAQ) 이진 벡터 시리즈도 개발 되었습니다. 대부분 pEAQ 벡터도는 토마토 덤 불 같은 곡예 바이러스 파생 P19 입을 억압 유전자13 circumvents 별도 P19 들고 긴장 coinfiltrate 필요 하 고 매우 월급 식 카세트의 T DNA 부분을 포함 호스트에서 고급 단백질 표정 식물 세포10,11.
명. benthamiana 의 식 호스트 장점이 특정 식물 생 합성 경로 작업할 때 사용 합니다. 셀 구조는 본질적으로 적절 한 mRNA, 단백질 처리, 및 필요한 공동 효소, (CYP450s)에 대 한 reductases 및 대사 선구자 뿐만 아니라 적절 한 구획을 지원 합니다. 탄소 소스가 이다 광합성; 따라서, 식물 입력으로만 물, CO2 (공중에서), 그리고 햇빛을 필요로 하는 좋은 품질 퇴 비에서 자란 단순히 있습니다. 플랫폼은 또한 단백질의 다른 조합의 공동 식에 대 한 매우 편리한으로이 손 쉽 세 A. tumefaciens 큰 multigene 식 구축 필요성을 negating의 다른 긴장의 공동 침투에 의해 달성 될 수 있다 카세트입니다. 또한, 과정 확장할 수 있습니다 선형 및 안정적으로 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도.
우리의 실험실에 이전 작업 대리점 규모 실험을 위해이 플랫폼의 유틸리티를 시연 하고있다. 이 절연된 제품의 그램 수량을 달성 하기 위해 최대 bioactivity 분석 실험 규모에 사용 하기 위해 소설 triterpenes의 준비를 포함. 또한, 이기종 보관 제품의 축적을 증가 시킬 수 있다 몇몇 reductase (tHMGR), 속도 제한 3-hydroxy, 3-methyglutary-코엔자임의 N 터미널 잘립니다, 피드백을 구분 하지 않는 형태의 공동 식 여 접을 업스트림 mevalonate 통로8효소입니다.
키 같은 대리점 규모 실험을 편리 하 게 최대 규모 침투 과정을 기능입니다. 전형적인 실험에서 식물의 수백 수만 절연된 제품의 목표 수량 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. (불필요 한 주사기를 사용 하 여) 개별 잎 손으로 침투 운영 요구 하 고 종종 매우 시간이 걸리는,이 방법은 비현실적 일상적인 스케일-업에 대 한 렌더링. 연산자의 기술 수준에 종속 되지 않습니다 그것과 잎 표면의 더 중대 한 지역에의 침투를 허용 한다 진공 침투 손 침투, 이점을 제공 합니다. 이 절차는 제약 단백질14의 대규모 생산을 위해 상업적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜 상용 부분에서 생성 될 수 있습니다 쉽게 복제할 진공 침투 기구를 이용 한다. 그러면 최대 4 식물, 시간의 짧은 기간에의 신속 하 고 실용적인 batch-wise 침투 식물의 수백을 affording의 동시 침투 (그림 2a -2b). 침투 챔버 (그림 2f)을 형성 하는 진공 오븐 진공 침투 기구에 의하여 이루어져 있다. 오븐 진공 저수지를 통해 펌프에 연결 된다. 이 크게 침투 챔버에 원하는 진공을 달성 하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 식물에 맞춤된 홀더 확보 및 A. tumefaciens 현 탁 액으로 가득 10 L 스테인리스 물 목욕으로 거꾸로 (그림 2a -2 c). 완전 한 침수 식물의 공중 부분의 효율적인 침투에 대 한 중요 하다. 물 목욕 챔버 내에 침투 배치 됩니다 (그림 2d -2e), 및 잎 중간 공간에서 공기를 그릴에 적용 하는 진공. 일단 압력 880 mbar (프로세스는 약 1 분 소요)으로 단축 되었습니다 침투 챔버는 들어온 신속 하 게 다시 대기압에 침투 완료 되 면 위에 오븐 입구 밸브를 개방 하 여 20-30 s.
침투 후 5 일 식물 재료는 수확 하 고 후속 추출 및 원하는 제품의 절연에 대 한 준비. 이 시점에서 과정은 단순히 자연 제품 추출 및 잎 소재, 모든 자연 제품 화학자에 익숙한 워크플로에서 정화의 하나. 초기 추출 및 후속 정화에 대 한 여러 가지 방법15를존재 한다. 방법 및 정확한 조건 사용의 가장 적절 한 선택 높은 관심, 능력 및 장비의 가용성 뿐만 아니라 화합물의 특정 화학 속성에 따라 달라 집니다. 그것은 관심, 보관 제품에 대 한 맹목적으로 따라 할 수 있는 절연된 제품에 수확된 식물 잎 재료의 다운스트림 처리에 대 한 완벽 하 게 받아들이기는, 단계별 방법이이 프로토콜에 포함 될 수도 있을 것 이라고 그렇게 하려고 하는 것 적절 한. 그러나,이 프로토콜은 우리의 실험실에 있는 우리의 경험에서 가장 산소 aglycone 보관 제품 받아들이기는 입증 과정의 초기 단계에 대 한 몇 가지 방법을 사용 하는 기본 워크플로 대 한 개요를 제공 합니다. 2 비교적 드문 기술, 즉, 가압 용 매 추출 (PSE) 및 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 엽록소 제거에 대 한 편리한 이기종 단계 방법 포함 됩니다.
PSE 고체 행렬에서 작은 유기 분자의 추출에 대 한 매우 효율적인 기술입니다. 추출 압력 (ca. 100-200 bar)에서 수행 됩니다, 그리고 끓는 초과 하는 의료진된 온도 사용 하 되 주요 장점은 추출 용 매에의 합니다. 이 크게 시간과 간단한 환류 등 Soxhlet 추출16다른 뜨거운 용 매 기술에 비교 될 때 완전 한 추출, 달성 하는 데 필요한 용 매의 양을 줄일 수 있습니다. 상업적인 벤치탑 PSE 악기는 상호 추출 셀 및 자동된 용 매 처리, 난방, 그리고 모니터링을 활용 수, 있습니다. 이것은이 기술을 매우 편리 합니다. 그것은 또한 틀림 없이 덜 위험, 특히 제한 된 실용적인 화학 경험을 가진 사업자에 대 한입니다.
비 누화 퇴조 액체/액체 분할 뒤에서 원유 잎 추출 물의 후속 정화 또는 분석 전에 chlorophylls의 대량 제거를 위한 일반적인 기술입니다. 그러나,이 수 자주 될 운영 체제 요구 더 큰 가늠 자에. 또한, 인터페이스, 또는 유화 액의 형성으로 인 한 제품 손실의 문제가 될 수 있습니다. 이기종 단계 가수분해 수행을 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 편리한 대안이 될 수 있습니다. 분해 된 엽록소의 색소 부분 수 지에 준수 남아 있고 단순히 여과 의해 제거 될 수 있다. 이 프로토콜의 상용 기본 이온 교환 수 지를 사용 하는 이전에 보고 된 분석 절차17 대리점 규모 적응을 활용 합니다.
아래는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 대리점 규모 생산에 대 한 상세 하 고 빠른 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 사용 정기적으로 우리의 실험실에 격리 보관 제품의 밀리 그램의 수백 수만 응용 프로그램에 대 한 구조적 특성화 하 여 준비 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 추가 기능에서 공부 하 분석 실험입니다.

<table><tbody><tr><td>GC-MS 기기</td><td>PCR</td> 반응 수행에 적합한 모든 <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>젤 전기영동 장치</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 공기 변위 마이크로피펫(크기: 1000 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 20 &마이크로; L, 10 &마이크로; L, 및 2 &마이크로; L )</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>와이드 탑 액체 질소 캐리어(크기: 2 L)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 마이크로 원심분리기(용량: 24 x 1.5/2mL, 최대 속도: =/> 15000rpm)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기(용량: 20 x 50mL, 최대 속도: =/> 4000rpm)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>대형 플로어 스탠딩 원심분리기(용량: 4 x 1L, 최대 속도: =/> 4000rpm)</td><td>모든</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>스탠딩 인큐베이터</td><td>해당</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터(플라스크 클램프 크기: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>모든</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 병(1 L)</td><td>모든</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>진공 침투 장치</td><td>맞춤형</td><td>해당 없음 9</td><td></td></tr><tr><td>x 9 cm 화분</td><td>해당</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조 장치(=/> 8리터 콘덴서 용량)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>120mL 추출 셀이 있는 Buchi SpeedExtractor 914(PSE 기기)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기 장치</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>증발 플라스크(크기: 100mL, 500mL, 1L, 2L)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran 병(크기: 1L, 10L)</td><td>모든</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 플라스크 (크기 100 mL, 2 L)</td><td>모든</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>주걱 (다양한 크기)</td><td>모든</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울 (5 그림)</td><td>모든</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>저울 (2 그림)</td><td>모든</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>측정 실린더 (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>모든</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 냉동고</td><td>any</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>250mL 수집 랙 및 병이 있는 Biotage Isolera 기기(자동 플래시 크로마토그래피 기기</td>, <td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>안전 안경</td><td></td>, <td>모든 N/A</td><td></td></tr><tr><td>, 실험실 코트</td><td></td>, 모든 N<td>/A</td><td></td></tr>, <tr><td>오토클레이브</td><td></td>, <td>모든 N/A</td><td></td></tr><tr><td><강력한>소모품</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁(크기: 1000 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 20 &마이크로; L, 10 &마이크로; L, 및 2 &마이크로; L )</td> <td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (크기: 2 mL)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 (크기: 15 mL, 50 mL)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>일회용 전송 피펫 (크기 2 mL)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (크기: 100 mL)</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100g 플래시 카트리지</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 바이알(1mL), 바이알 인서트 및 캡</td><td></td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>일회용 보라색 니트릴 장갑</td><td>N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>E-914용 상단 필터, 셀룰로오스</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>E-916/914용 하단 필터, 유리 섬유</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td> 시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>석영 모래, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (규조토)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-디메톡시-4'-아세토페논(아세토시링곤)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>MP 생물 의학</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 LE 젤</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB 국물 Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>시그마-알리치</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-알리치</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>앰버셉&reg; &nbsp; 900 수산화물 (염기성 이온 교환 수지)</td> <td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>피셔</td><td>H / 0406 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이</td>트 <td>피셔</td><td>E / 0900 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>디클로로 메탄</td><td>피셔</td><td>D / 1852 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔</td><td>M / 4056 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>브롬화 에티듐</td><td>시그마 알리치</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 물</td><td></td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 퇴비</td><td>해당</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 퇴비</td><td>해당</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (플라스미드 정제 키트).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha 유능한 대장균</td><td>공급업체 New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 벡터</td><td>Lomonossoff 실험실 John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX(부위 특이적 재조합 클로닝 프로토콜)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX(부위 특이적 재조합 클로닝 프로토콜)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>써모-피셔</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana Benthamiana 씨앗</td><td>평판이 좋은 공급 업체</td><td>없음</td><td></td></tr></tbody></table>

nicotiana benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 많은 보관 파생 상품 약 관련 생물 활성을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 triterpenes 모두에서 파생 된 단일 선형 전조, 2, 3-oxidosqualene. 명. benthamiana 에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식에는 자연스럽 게이 호스트에 의해 생산 되지 않습니다 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급 착륙 장이 있습니다. 농업-침투는 북 아 일 benthamiana에 과도 식 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 Agrobacterium tumefaciens 관심의 식 construct(s) 운반의 현 탁 액으로 식물 잎의 침투를 포함 한다. 추가 A. tumefaciens 의 공동 침투 변형 생성 효소 선구자 공급을 크게 향상 증가 인코딩 식 구문 들고. 5 일의 기간 후 침투 잎 재료는 수확 고 추출 하 고 결과 보관 제품을 분리 처리 될 수 있습니다. 이 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도 선형 및 안정적으로 확장 되는 프로세스입니다. 여기는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 빠른 대리점 규모 생산을 위한 프로토콜을 설명. 프로토콜 활용 쉽게 복제할 진공 침투 기구, 시간의 짧은 기간에 식물의 수백의 batch-wise 침투 수 있도록 최대 4 개까지 식물의 동시 침투를 허용 합니다.

일반적인 격리 된 수익률 조사, 대상 화합물의 화학 안정성 및 어떻게 했다 도전 정화 과정에서 효소/효소 조합에 따라 달라 집니다. 우리는 이전 β-amyrin의 고립 된 수익률을 보고 3.87 mg의 그램 당 0.12에서까지 우리의 조합 생 합성 실험에서 파생 상품 명. benthamiana 잎 분말 건조. 이러한 화합물의 산화의 수준에 넓게 배열 하 고 부자연 스러운 조합의 효소 (그림 3)8포함. 이 프로토콜이 사용 됩니다 정기적으로 우리의 실험실에 수십 또는 수백 밀리 그램 구조 특성에 대 한 정제 제품의 생산을 NMR 분광학 및 하류 기능 분석 실험. 우리도 보관 비 β-amyrin에서 98% 이상의 순도의 0.8 g을 생산 하 여이 플랫폼의 대리점 유틸리티 시연 했다. 이 실험은 459 식물을 사용 하 고 드라이의 그램 당 3.3 m g의 고립 된 수익률을 나타냅니다 명. benthamiana 잎 분말8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> 그림 1: 도식 요약. 새로운 고부가가치 보관 제품의 대리점 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급을 다른 곳으로 명. benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 식 악용 하는 프로세스의 도식 적인 표현입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> 그림 2: 진공 infiltrator 건설과 과정.는) 공장 소유자 한 날개 분리 맞춤 b) 서비스 공장 홀더 날개 부착. c) 역전과 식물의 침수. d) 침투 목욕의 삽입. e) 침투 침투 챔버 내에 목욕. f) 완전 한 진공 infiltrator: (1) 진공 펌프 진공 펌프 진공 저수지 (3) 진공 저수지 격리 밸브 진공 저수지와 침투 챔버 (5) 압력 게이지 (6) 공기 흡입구 밸브 (7) (4) 연결에서에서 연결 (2) 침투 챔버 (8) 진공 저수지 g) 대표는 5 일 후 침투 성장 후 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 식 구문을 함께 침투 한 공장에서 출발 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> 그림 3:8이 프로토콜 사용 하 여 β-amyrin 파생 상품의 대리점 생산에 대 한 대표적인 결과 이전 보고. 이 테이블은 고립 된 수익률으로 정렬 됩니다. 열 조건에 따라 상대적인 값의 색상 표시로 포맷 됩니다. 레드 그린 = 높은, 낮은 (비록 중간 노란색) =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

이 프로토콜은 구조적 특성화 또는 의학적으로 관련된 생물학적 활성의 만료와 같은 다운스트림 연구에 사용하기 위해 트리테르펜 화합물에 대한 편리한 분취 규모 접근을 제공합니다. 이 프로토콜은 빠르고 확장 가능하며 서로 다른 Agrobacterium 균주의 동시 침투에 의해 효소 조합을 간단히 활용할 수 있으므로 대규모 다중 유전자 벡터를 구축할 필요가 없습니다. 시작하려면 글리세롤 스톡 배양에서 원하는 Agrobacterium tumefaciens 균주의 줄무늬를 선택적 LB 한천 플레이트에 접종합니다.스탠딩 인큐베이터에서 섭씨 28도의 온도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 각 Agrobacterium tumefaciens 균주의 샘플과 함께 50ml의 선택적 LB 배지를 개별적으로 접종합니다. 섭씨 28도의 쉐이킹 인큐베이터에서 200rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다.50ml 배양액을 1,000ml의 선택적 LB 배지로 개별적으로 옮기고 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 28도의 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날, 개인적으로 4, 000 시간 g에 원심 분리에 의해 액체 배양물에서 Agrobacterium tumefaciens를 펠릿으로 만드십시오. 상등액을 버린 후, 펠릿을 갓 준비한 MMA 완충액 50ml에 개별적으로 재현탁합니다.재현탁된 펠릿을 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 10리터의 총 최종 부피에서 최소 0.2의 최종 OD 600을 생성하기 위해 각 Agrobacterium tumefaciens MMA 현탁액의 적절한 부피를 결정합니다. 각 현탁액의 결정된 부피를 결합합니다.이제 진공 침투에 즉시 사용할 수 있도록 결합된 현탁액에 MMA 버퍼를 추가하여 최종 부피 1리터를 추가합니다. 1리터의 침투 현탁액과 10배 강도의 MMA 완충액 1리터를 침투 수조로 옮긴 다음 추가로 8리터의 물을 넣습니다. 맞춤형 식물 홀더의 분리 가능한 날개를 제거합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자란 5주 된 식물 4개를 삽입하고 날개를 다시 부착합니다. 잎이 침투 현탁액에 완전히 잠기지 않으면 침투 범위가 손상됩니다. 이 문제는 진공 처리 전에 현탁액의 높이가 플랜트 홀더의 상단 표면에 도달하도록 함으로써 최소화됩니다.홀더를 뒤집어 침투 수조 위에 올려 놓고 잎이 침투 현탁액에 잠기도록 합니다. 물에 잠긴 식물이 있는 침투 욕조를 침투 챔버로 옮기고 문을 닫습니다. 침투기의 공기 흡입 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오.진공 펌프를 켠 후 침투 챔버의 진공 흡입 밸브를 엽니다. 침투실의 압력이 880밀리바 감소하면 진공 흡기 밸브를 닫고 공기 흡입 밸브를 엽니다. 대기압으로 돌아오면 문을 열고 침투 욕조를 제거합니다.이제 식물이 더 이상 침투 현탁액에 잠기지 않을 때까지 식물 홀더를 들어 올립니다. 그런 다음 홀더를 부드럽게 흔들어 과도한 현탁액이 잎에서 흘러나와 침투 수조로 다시 들어갈 수 있도록 합니다. 마지막으로 홀더를 똑바로 세우고 분리 가능한 날개를 제거하고 식물을 제거합니다.침투 한 식물을 섭씨 25도에서 5 일 동안 매일 물을 주면서 하루 16 시간 동안 빛으로 키웁니다. 5일 동안 자란 후 잎을 수확한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 건조시킵니다. 말린 잎을 가정용 푸드 프로세서를 사용하거나 가방에 넣은 상태에서 잎을 수동으로 으깨는 것과 같은 편리한 방법을 통해 굵은 가루로 갈아줍니다.적절한 용기에 잎 가루와 석영 모래를 섞습니다. 이것은 분산제로 작용하여 추출 공정의 효율성을 향상시킵니다. 이제 4개의 추출 셀을 먼저 반전하여 채울 준비를 합니다.그런 다음 유리 섬유 필터를 삽입한 다음 금속 프릿과 홀딩 플러그를 삽입합니다. 추출 셀을 똑바로 세우고 1cm 깊이의 석영 모래 층을 추가합니다. 추출된 잎 가루를 충진 선까지 채웁니다.필요한 경우 이 과정에서 분말을 부드럽게 압축하여 각 추출 셀에 더 많은 양을 쉽게 추가할 수 있도록 합니다. 이제 포장된 분말 상단에 작은 석영 모래 층을 추가하고 상단 셀룰로오스 필터를 삽입합니다. 패킹된 추출 셀을 가압 용매 추출 기기에 삽입하고 원하는 Method를 실행합니다.분석법이 완료되면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 진공 상태에서 회전 증발을 통해 결합된 추출 액을 건조에 농축합니다. 짙은 녹색 슬러리의 예상 출력을 확인하십시오. 엽록소를 제거하려면 염기성 이온 교환 수지를 사용하여 먼저 조잡한 추출물을 최소한의 에탄올에 용해시킵니다.생성된 용액에 50ml의 염기성 이온 교환 수지 비드를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 교반합니다. 반응이 완료될 때까지 30분마다 50ml의 염기성 이온 교환 수지 비드를 추가합니다.처음에는 염기성 이온 교환 수지 비드가 분홍색이고 액상이 녹색입니다. 반응이 진행됨에 따라 수지 비드는 녹색으로 변하고 액상은 스케일에 따라 주황색 또는 탁한 갈색으로 변합니다. 유리 플래시 크로마토그래피 컬럼을 통해 규조토의 짧은 컬럼을 통해 반응 혼합물을 여과하고 핸드 벨로우즈를 사용하여 압력을 가합니다.수집된 수지 비드를 에탄올로 헹구고, 일대일 에탄올을 헥산으로, 마지막으로 헥산으로 헹굽니다. 규조토 기둥 위에 비드를 다시 현탁시키기에 충분한 헹굼량을 사용하십시오. 마지막으로, 여과액, 헹굼물 및 농축액을 진공 하에서 회전 증발에 의해 건조되도록 결합합니다.여기에 표시된 것은 침투 성장 후 5일 후에 형광 단백질 GFP에 대한 발현 구조체로 침투한 한 식물의 잎 이미지입니다. 이는 예상할 수 있는 침투 범위의 범위를 보여줍니다. 잎은 식물의 원래 높이를 기준으로 이미지의 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단까지 내림차순으로 정렬됩니다.이 이미지는 이 프로토콜을 사용하여 생산된 0.8g의 베타 아미린을 나타내며, 이는 순도 98%보다 큽니다. 이 실험은 459 식물 규모로 수행되었으며 마른 잎 물질 그램 당 3.3 밀리그램의 분리 수율을 나타냅니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안, 침투한 잎만이 관심 화합물을 생성한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 비생산적인 조직으로 샘플이 희석되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 이러한 잎을 선택적으로 수확하는 것이 유리합니다. 이 프로토콜의 수확 후 단계는 설명 목적으로 제공됩니다. 이는 해당 기관의 전문 지식 및/또는 시설의 가용성에 따라 다른 천연 제품 추출 정제 기술을 대체할 수 있습니다.우리는 이 프로토콜에 제시된 기본 이온 교환 수지 처리가 더 큰 규모의 엽록소를 제거하기 위해 액체/액체 분할에 이어 보다 전통적인 비누화에 대한 편리한 대안임을 발견했습니다. 이 프로토콜을 따르기 전에 사용된 모든 물질에 대한 물질 안전성 데이터를 숙지하고 적절한 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 유전자 변형 물질 취급에 관한 현지 법규를 점검하고 준수해야 하며, 적절한 격리 절차를 따라야 한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

우리는 식물에서 단일 클론 항체와 리포터 단백질의 과도 발현 유전자 조절 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건의 영향을 결정하고 모델링하는 데 사용될 수있는 실험 방법의 설계를 설명한다.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

여기, 선물이 식용 식물에 타입 1 당뇨병에 대 한 경구 백신 후보자를 생산 하는 프로토콜.

타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

학습하세요 Nicotiana benthamiana 잎에서 과도식 보관 생산 규모로 트리터펜을 생산하는 방법을. Agrobacterium 진공 침투를 활용하여 고가치 천연 화합물을 신속하게 합성하는 이 기술은 약리학적 연구에 활용됩니다.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

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