Name: Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een uitgebreide evaluatie van placenta-gerichte drug delivery met behulp van in vivo imaging, high-frequency ultrasound en HPLC. Deze methode maakt real-time monitoring en accurate biochemische metingen van geneesmiddelen in de placenta mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Stichting voor Natuurwetenschappen (81771617) en de Natural Science Foundation van Guangdong provincie (2016A030313178) uitgereikt aan X.F.; een subsidie van de Shenzhen Basic onderzoeksfonds (JCYJ20170413165233512) uitgereikt aan X.F; en de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development van de National Institutes of Health onder Award nummer R01HD088549 (de inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de ambtenaar uitzicht op de National Institutes of Health) met N.N.

Alle experimenten strikt gevolgd protocollen van de muis (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academie van Wetenschappen.
1. synthese van placenta Chondroitin sulfaat A-gerichte lipide-Polymer nanodeeltjes
<ol><li>Synthetiseren MTX - en IGC-loaded lipide-polymeer nanodeeltjes (MNPs en INPs respectievelijk) en plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes (plCSA-MNPs en plCSA-INPs) zoals beschreven in detail elders18.</li>
</ol>2. in vivo Imaging fluorescentie
<ol><li>
Voorbereiding van zwangere muizen
	<ol>
<li>Plaats van vrouwelijke CD-1 mice (8-12 weken) met een vruchtbare man van dezelfde stam in een kooi (mannelijke: vrouwelijke = 1:2) in de middag en controleer de vaginale stekkers de volgende ochtend. Als een vaginale plug wordt waargenomen, definieert u de muis als embryonale dag 0,5 (E0.5).</li>
		<li>Huis zwangere muizen alleen in dierlijke pathogenen vrije speelkamer met een 14 licht/10 uur donker cyclus en bieden gratis toegang tot voedsel en water tot E14.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intraveneuze injectie van nanodeeltjes
	<ol>
<li>Voordat de procedure, steriliseren nanoparticles door filtratie door een 0,22 μm spuit filter. Weeg de zwangere muis op E11.5 om te bepalen van de hoeveelheid en het volume van nanoparticle injectie. Opmerking: Het nanoparticle geïnjecteerde volume moet minder dan 1% (gewicht/volume) van het lichaamsgewicht van de zwangere muis. Bijvoorbeeld moet het nanoparticle geïnjecteerde volume minder dan 0,25 mL in een muis 25 g.</li>
		<li>Warm om te verwijden de staart ader, de staart voor 5-10 min met een verwarming pad.</li>
		<li>Gecombineerd het INPs of plCSA-INPs in een 28 g insuline spuit vóór injectie.</li>
		<li>De zwangere muis overbrengen in een bedrijf-apparaat dat de muis weerhoudt terwijl het toestaan van toegang tot de staart ader. Reinig de staart met een alcohol doekje. Voeg vervolgens de spuit in de ader van de staart. Langzaam het INPs of plCSA-INPs (5 mg/kg ICG equivalent) injecteren met zelfs druk 5-10 s. Opmerking: Stop injecteren als een blaar op de staart verschijnt omdat dit resultaat geeft aan dat de naald niet in de ader. Spuiten mag niet worden gedeeld tussen muizen voor de transmissie van de ziekte minimaliseren en kruisbesmetting.</li>
		<li>De injectie tijd vastleggen. Ondertussen, zachte druk uitoefenen op de injectieplaats tot het bloeden stopt, die normaal gesproken 30-60-s duurt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vivo imaging
	<ol>
<li>30 min na de injectie, het imago van de zwangere muizen met behulp van de fluorescentie in vivo imaging systeem.</li>
		<li>Anesthetize de zwangere muizen met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min en Isofluraan op 2-4% in een bijbehorende zaal van de narcose-unit en controleer of de volledige narcose door trage en regelmatige ademhaling. Verplaatst u ze in de beeldvorming kamer. Plaats de narcose zwangere muizen in de beeldvorming zaal, houden van de dieren in een liggende positie.</li>
		<li>Plaats een neus kegel boven de mond en de neus om de inhalatie van 1-2% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min te houden van de verdoving.</li>
		<li>Selecteer 2D-fluorescentie en fotografische parameters om het imago van de ICG fluorescentie signalen. Instellen van de blootstelling aan de auto en de excitatie/emissie golflengten te 710/820 nm.</li>
		<li>Aan het einde van de beeldvorming procedure, de Isofluraan toestroom te stoppen met de narcose uitschakelen en de zwangere muizen zorgvuldig terug te keren naar hun kooien.</li>
		<li>48 uur na de injectie van de nanoparticle, anesthetize de zwangere muizen met isofluorane, en vervolgens het offeren van de dam door cervicale dislocatie. Het verzamelen van de foetussen en placentas met behulp van Graefe pincet, Graefe weefsel pincet, en de ontrafeling van de schaar.</li>
		<li>Plaats de placentas en foetussen in de beeldvorming kamer, en beeld met behulp van de methode in stap 2.3.4 beschreven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HFUS evaluatie van embryonale ontwikkeling
<ol><li>
Dierlijke modellen
	<ol>
<li>Verkrijgen en de zwangere muizen te bereiden zoals beschreven in stap 2.1.</li>
		<li>Gebruik HFUS om de zwangere muizen afbeelding op E 6.5 (protocollen 3.2 en 3.3.3). Ten eerste zwangerschap te bevestigen door het visualiseren van de embryo's op dag E6.5, en vervolgens willekeurig verdelen de zwangere muizen in drie groepen: de groep MNP, plCSA-MNP groep en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) groep.</li>
		<li>Injecteren PBS, MNPs of plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalent) in de aders van de staart van de zwangere muizen om de andere dag basisgewicht van E6.5 zoals beschreven in stap 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding voor imaging
	<ol>
<li>24 uur na de injectie van nanodeeltjes, het imago van de zwangere muizen met behulp van het imaging systeem HFUS.</li>
		<li>Anesthetize de zwangere muizen zoals beschreven in stap 2.3.2. Inschakelen van de geïntegreerde kleurtemperatuurregelaar van de imaging platform en verwarm het platform tot 37-42 ° C. Beveilig de zwangere muizen in een liggende positie op het platform met behulp van tape.</li>
		<li>Plaats de neus kegel verbonden aan de eenheid van de verdoving via de snuit. 2% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min om gestage verdoving toepassen.</li>
		<li>Chemisch verwijderen haren uit de buik met behulp van een ontharende room. De resterende room grondig met water doordrenkte gaas uitroeien, en vervolgens de jas van de buik met akoestische koppeling gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging-procedure
	<ol>
<li>Plaats de 40 MHz transducer in de mechanische arm.</li>
		<li>Pas de transducer positie te verkrijgen van longitudinale beelden van de foetus en de placenta met de regio van belang in de focale zone.</li>
		<li>
B-Mode beeldvorming en analyse Opmerking: Zie film 1.<ol>
<li>Klik op de knop B-modus en de transducer over de buik te verlagen totdat de foetus en de placenta in zicht komt. Druk op Scannen/bevriezen voor initi├½er/stop imaging, druk op Cine slaan slaan de cine lus, en drukt u op Frame opslaan om te slaan Frameafbeeldingen.</li>
			<li>Klik op de knop van de maatregel om de lengte van de zwangerschapsduur oss (GS), foetale crown rump length (CRL), biparietal diameter (BPD), buik omtrek (AC), placenta diameter (PD) en placenta dikte (PT) te analyseren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
PW-Doppler Beeldvorming en analyse Opmerking: Zie film 1.<ol>
<li>Met behulp van hetzelfde projectie scannen, klikt u op de knop van de PW , plaatst u het volume bemonstering in het midden van de navelstreng ader en druk op Scan/bevriezen tot imaging. Klik op Cine opslaan voor het verzamelen van beelden van de navelstreng slagader.</li>
			<li>Klik op de knop van de maatregel voor het berekenen van de navelstreng ader piek snelheid (UA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kleur Doppler modus beeldvorming en analyse
		<ol>
<li>Met behulp van hetzelfde projectie scannen, klikt u op de knop kleur en pas de positie van de transducer om te halen beelden van het foetale hart. Druk op scannen/bevriezen tot beeldvorming en Cine Opslaan voor het verzamelen van beelden.</li>
			<li>Klik op de knop van de maatregel voor het berekenen van de foetale hartslag (HR).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HPLC analyse
<ol><li>
Weefsel voorbereiding
	<ol>
<li>Injecteren van de zwangere muizen met een enkelvoudige dosis van MNPs- of plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalent) op late zwangerschap (bv., E14.5) zoals beschreven in stap 3.1.3.</li>
		<li>Anesthetize na 24 h, de muizen door een intraperitoneale injectie van avertin op 240 μg/lichaamsgewicht (g). Geen reactie is op een snuifje van de voet om te verifiëren dat de muizen zijn volledig verdoofd te zorgen.</li>
		<li>Spray de borst gebied met 75% ethanol. Uitvoeren van cardiale perfusie (de juiste atria knippen en perfuse via het linkerventrikel) zoals eerder beschreven in detail19,20 met 50 mL ijskoud 0,9% zoutoplossing voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke nanodeeltjes.</li>
		<li>Euthanaseren van de dam. Uitvoeren van een keizersnede voor het verzamelen van de foetussen en placentas met behulp van Graefe pincet, schaar, en Graefe weefsel pincet, ontleden en bewaar de weefsels bij-80 ° C vóór de analyse.</li>
		<li>Bereid de homogenisering oplossing (10% perchloorzuur) en houd op ijs. Verzamelen van ongeveer 200 mg van weefsel, en voeg 500 μL van homogenisering oplossing aan elk monster. Meng de monsters met behulp van een homogenizer op volle snelheid voor 30 s, en herhaal deze procedure tweemaal.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij 14.000 × g gedurende 20 min bij 4 ° C. Filtreer het supernatant (ongeveer 300 μL) door een 0,45 micrometer spuit filter, en de resulterende vloeistof overbrengen in een flacon van HPLC. Schakel Monster flesjes in de lade van een autosampler voor injectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opstelling van normen
	<ol>
<li>Bereid de volgende oplossing voor de mobiele fase: 40 mM kalium fosfaat dibasische (pH 4.5) en acetonitril (88:12, v/v). Filtreer de oplossing door een 0,45 micrometer porie grootte spuit filter en de resulterende vloeistof overbrengen in een schone fles van HPLC reservoir. Opmerking: Breng de pH met 0,1 M fosforzuur. Kunt ultrasone trillingen voor 15 min ontgas de mobiele fase telkens vooraf te gebruiken.</li>
		<li>Weeg 10 mg MTX in een centrifugebuis 1,5 mL. Voeg 1 mL 1 M natronloog.</li>
		<li>Vortex op hoge snelheid tot de MTX volledig oplost. Opmerking: Dit is de primaire voorraad en kan worden opgeslagen bij-20 ° C voor enkele maanden.</li>
		<li>Als u wilt maken van de secundaire MTX voorraad (500 μg/mL), Verdun 50 μl van het primaire bestand in 950 μL van de mobiele fase. Opmerking: Bewaren in de ijskast tot gebruik, en voor te bereiden verse dagelijks. Het is belangrijk om het gebruik van de mobiele fase voor de opstelling van normen te voorkomen pieken die voortvloeien uit ongelijke mengoplossingen na injectie van de steekproef.</li>
		<li>Zorg verder verdunningen maken de normen (tabel 1). Opslaan van de normen op ijs en vers dagelijks te bereiden. De normen in serie met de experimentele monsters worden uitgevoerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nummer</td>
			<td>Eindconcentratie (μg/mL)</td>
			<td>Standaard, μL van 500 μg/mL</td>
			<td>Mobiele phase(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>998</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>980</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>800</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Voorbereiden van standaard curve MTX. De uiteindelijke concentratie van MTX standaardoplossing is van 0,5-100 μg/mL.
<ol start="3"><li>
HPLC instrumentatie en bewerkingsparameters Opmerking: Monsters werden geanalyseerd op een HPLC-systeem voorzien van een oplosmiddel pomp, een spectrofotometrische UV-detector (313 nm), en een C18-kolom (250 × 4.6 mm, 5 micrometer deeltjesgrootte).<ol>
<li>De HPLC-degasser lucht uit het systeem verwijderen inschakelen. Inschakelen van de stroom, zo van de kolom met de mobiele fase voor 30 min ter vermindering van lawaai van de basislijn.</li>
		<li>De temperatuur van de kolom ingesteld op 25 ° C, injecteren 20 μL monster volumes op een debiet van 1 mL/min, en klikt u op de Methode Run om te beginnen met de analyse.</li>
		<li>Wanneer de punten voltooid zijn, handmatig wijzigen in de mobiele fase HPLC-grade acetonitril. Een looptijd van ongeveer 15 min om het systeem te beschermen. Opmerking: Niet uitvoeren van deze stap na de aanbevolen lopende tijd kan leiden tot schade aan de kolom.</li>
		<li>Berekenen voor kwantitatieve analyse, de gebieden die onder de standaard MTX pieken van belang met behulp van de HPLC-systeemsoftware.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+of+Factor+V+Leiden+and+Prothrombin+Gene+Mutation+and+Placenta-Mediated+Pregnancy+Complications%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis+of+Prospective+Cohort+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies.</a> PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).</li>
<li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+thrombophilia+and+pregnancy+complications+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited.</a> Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).</li>
<li>Brenner, B., Aharon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombophilia+and+adverse+pregnancy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Thrombophilia and adverse pregnancy outcome.</a> Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).</li>
<li>Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+addressability+of+global+disease+burden+in+maternal+and+perinatal+health+by+investment+in+R%26D%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+%26+International+Health%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D.</a> Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).</li>
<li>Fisk, N. M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Market+failure+and+the+poverty+of+new+drugs+in+maternal+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Market failure and the poverty of new drugs in maternal health.</a> PLOS Medicine. 5 (1), e22(2008).</li>
<li>Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticle+delivery+of+doxorubicin+into+placental+tissues+to+treat+ectopic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies.</a> Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).</li>
<li>King, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-homing+peptides+as+tools+for+targeted+delivery+of+payloads+to+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta.</a> Science Advances. 2 (5), e1600349(2016).</li>
<li>Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Homing+Peptide-microRNA+Inhibitor+Conjugates+for+Targeted+Enhancement+of+Intrinsic+Placental+Growth+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling.</a> Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).</li>
<li>Cureton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Targeting+of+a+Novel+Vasodilator+to+the+Uterine+Vasculature+to+Treat+Impaired+Uteroplacental+Perfusion+in+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy.</a> Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).</li>
<li>Paul, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+human+and+mouse+uterus+using+immunoliposomes+targeted+to+the+oxytocin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-specific+drug+delivery+by+trophoblast-targeted+nanoparticles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice.</a> Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+placenta-specific+transgene+expression+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging.</a> PloS One. 6 (1), e16348(2011).</li>
<li>Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+surface-modified+liposomes+to+evaluate+their+behavior+after+pulmonary+administration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).</li>
<li>Ito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+whole-body+multimodality+imaging+of+gastric+cancer+peritoneal+metastasis+combining+fluorescence+imaging+with+ICG-labeled+antibody+and+MRI+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).</li>
<li>Mazza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-Indocyanine+Green+Nanoprobes+for+Optical+Labeling+and+Tracking+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+Post-Transplantation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+ultrasound+for+in+vivo+pregnancy+diagnosis+and+staging+of+placental+and+fetal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice.</a> PloS One. 8 (10), e77205(2013).</li>
<li>Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound+database+profiling+growth%2C+development%2C+and+cardiovascular+function+in+C57BL%2F6J+mouse+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/58209/synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa">Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+the+central+nervous+system+of+rats+with+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 527(2007).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1367593103001091">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+staging+of+spontaneous+embryo+resorption+by+ultrasound+biomicroscopy+in+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).</li>
<li>Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+high-frequency+ultrasonography+to+evaluate+cardiovascular+and+uteroplacental+blood+flow+in+mouse+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pregnancy+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy.</a> Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).</li>
<li>Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+ultrasonographic+characterization+of+phenotypic+changes+during+embryo+development+in+non-anesthetized+mice+of+different+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes.</a> Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).</li>
<li>Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+%CE%B23+integrin+by+targeted+ECO%2FsiRNA+nanoparticles+inhibits+EMT+and+metastasis+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+doxorubicin+by+CSA-binding+nanoparticles+for+choriocarcinoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment.</a> Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).</li>
<li>Jenkins, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+%28BLI%29+to+improve+and+refine+traditional+murine+models+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).</li>
<li>Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+safety+considerations+of+nanoparticle-mediated+drug+delivery+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy.</a> Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).</li>
</ol>

X.F. en B.Z. zijn uitvinders op octrooi PCT/CN2017/108646 ingediende aanvraag door SIAT dat betrekking heeft op een methode voor het bezorgen van placenta-specifieke drug en de toepassing ervan. Alle andere auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

In dit manuscript schetsen we een drie-methode-systeem om te bepalen of plCSA-BP-geleide nanodeeltjes een doeltreffend instrument zijn voor het gericht op de levering van geneesmiddelen aan de placenta. Het gebruik van in vivo imaging als u wilt controleren het infrarood signaal voor fluorescerende ICG bevestigd de placenta targeting specificiteit van plCSA-BP. gebruiken HFUS en HPLC, we laten zien dat plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes MTX efficiënt kunnen leveren alleen aan de placenta cellen, niet voor de fo...

Placenta-gemedieerde zwangerschapscomplicaties, met inbegrip van pre-eclampsie, verlies van de zwangerschap, placenta abruption en kleine zwangerschapsduur (SGA), zijn gemeenschappelijk en leiden tot aanzienlijke foetale en maternale morbiditeit en mortaliteit1,2, 3, en zeer weinig drugs hebben bewezen effectief te zijn voor de zwangerschap te behandelen aandoeningen4,5. De ontwikkeling van strategieën voor meer selectieve en veiliger placenta-gerichte drug delivery tijdens de zwangerschap blijft uitdagend in moderne medicamenteuze therapie.
In de afgelopen jaren hebben verschillende rapporten als placenta-gerichte instrumenten gericht op de gerichte levering van drugs aan uteroplacental weefsels door coating nanodeeltjes met peptiden of antilichamen. Deze omvatten een anti-epidermale groeifactor receptor (EGFR)6 antilichaam, tumor-homing peptiden (CGKRK en iRGD)7, placenta-gerichte peptiden8, placenta therapieën-gerichte peptiden9 en antistoffen tegen de oxytocine receptor10.
Hier, we laten zien dat een synthetische placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP) kan worden gebruikt voor de gerichte levering van nanodeeltjes en hun drug lading aan de placenta11. De plCSA-BP-geleide nanodeeltjes zijn een aanvulling op de gerapporteerde uteroplacental dat targeting methoden omdat ze gericht zijn de placenta trofoblast.
Als een niet-invasieve methode, in vivo imaging is gebruikt voor het controleren van de placenta-specifieke genexpressie in muizen12en indocyanine groen (ICG) is wijd verbeid gebruikt voor het bijhouden van nanodeeltjes met behulp van fluorescentie imaging systemen13, 14,,15. Dus, we intraveneus geïnjecteerd plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met ICG (plCSA-INPs) de verdeling van de plCSA-INP bij zwangere muizen met een fluorescentie imager visualiseren. Wij vervolgens intraveneus geïnjecteerd methotrexaat (MTX)-plCSA-NPs in zwangere muizen geladen. Hoge-frequentie echografie (HFUS), een ander niet-invasieve, real-time imaging tool16,17 werd gebruikt voor het bewaken van de foetale en placenta ontwikkeling in de muizen. Tot slot hebben we gebruikt krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) te kwantificeren MTX distributie in de placentas en foetussen.
In dit protocol beschrijven we in detail het systeem van de drie-methode gebruikt om de efficiëntie van placenta-gerichte drug delivery te beoordelen door plCSA-BP-geleide nanocarriers.

<table><tbody><tr><td>CD-1 muizen</td><td>Beijing Vital River</td><td>201</td><td>Vrouw (8-12 weken)</td></tr><tr><td>Insuline-injectiespuit</td><td>BD</td><td>328421</td><td>voor IV-injectie</td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10009218</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>Sojabonen lecithine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>Ultrasonische processor</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>Methotrexaat (MTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900324</td><td>voor nanoparticle-synthese</td></tr><tr><td>Indocyanine groen (ICG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1340009</td><td>voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>IVIS spectrum instrument</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Ultrasound transmissiegel</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>voor ultrasound beeldvorming</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Lunan Pharmaceutical</td><td>I0040</td><td>voor het onderhouden van anesthesie</td></tr><tr><td>Ontharingscreme</td><td>Nair</td><td>TMG001</td><td>voor het verwijderen van vacht</td></tr><tr><td>40 MHz transducer</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>voor ultrasound beeldvorming</td></tr><tr><td>Ultrasoon beeldvormingssysteem met hoge frequentie</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>voor ultrasound beeldvorming</td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>voor anesthesie</td></tr><tr><td>Injectiepomp</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>voor hartperfusie</td></tr><tr><td>0,9% zoutoplossing</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>voor hartperfusie</td></tr><tr><td>1,5 mL Polypropyleenbuisjes</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg;C vriezer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>Perchloorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>voor het bezinken van eiwitten</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>voor het homogeniseren van weefsel</td></tr><tr><td>Spuitfilter (0,45 &mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10019763</td><td>voor het oplossen van MTX</td></tr><tr><td>HPLC-vial</td><td>Waters</td><td>670650620</td><td>voor HPLC</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>20032117</td><td>voor HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>JKchemical</td><td>932537</td><td>voor HPLC</td></tr><tr><td>C18-kolom</td><td>Waters</td><td>186003966</td><td>voor HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-systeem</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>voor HPLC</td></tr></tbody></table>

uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van placenta-gerichte drug delivery met behulp van drie aanvullende methoden

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Geen effectieve behandelingen bestaan momenteel voor placenta-geassocieerde zwangerschapscomplicaties, en ontwikkelen van strategieën voor de beoogde levering van drugs aan de placenta terwijl het minimaliseren van de foetale en maternale bijwerkingen blijft uitdagend. Gerichte nanoparticle vervoerders bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van aandoeningen van de placenta. We onlangs aangetoond dat een synthetische placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP) kan worden gebruikt om het begeleiden van nanodeeltjes om drugs te leveren aan de placenta. In dit protocol, beschrijven we in detail een systeem voor de beoordeling van de efficiëntie van de drug levering aan de placenta door plCSA-BP die drie afzonderlijke methodes gebruikt in combinatie hanteert: in vivo imaging, hoge-frequentie echografie (HFUS), en high-performance vloeibare chromatografie (HPLC). Met behulp van in vivo zijn imaging, plCSA-BP-geleide nanodeeltjes gevisualiseerd in de placentas van levende dieren, terwijl HFUS en HPLC aangetoond dat plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes efficiënt en in het bijzonder bezorgd methotrexaat bij de placenta. Dus, kan een combinatie van deze methoden worden gebruikt als een effectief instrument voor de beoogde levering van drugs naar de placenta en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën voor verschillende zwangerschapscomplicaties.

In dit manuscript, waren plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met MTX (plCSA-MNPs) of ICG (plCSA-INPs) intraveneus geïnjecteerd in zwangere muizen. In vivo imaging geopenbaard sterke ICG signalen in de regio van de baarmoeder 30 min na plCSA-INP injectie. Het INPs waren voornamelijk gelokaliseerd aan de lever en milt regio (figuur 1A). 48 uur na plCSA-INP injectie, werden zwangere muizen opgeofferd, onthullend ICG signalen alleen in de placent...

Beschrijven we een systeem dat gebruik maakt van drie methoden voor evaluatie van de veiligheid en effectiviteit van placenta-gerichte drug delivery: in vivo imaging als u wilt controleren nanoparticle accumulatie, hoge-frequentie echografie placenta en foetale ontwikkeling te volgen , en HPLC te kwantificeren drug levering aan weefsel.

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het nanogeneeskundeveld over de effectiviteit en de veiligheid van geneesmiddelen geladen op nanodeeltjes die worden afgeleverd aan de moeder en de foetus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige biochemische meting van de hoeveelheid geneesmiddel die naar de placenta wordt afgegeven, mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van door de placenta bemiddelde zwangerschapscomplicaties, omdat het belangrijk is om een nauwkeurige targeting van de geneesmiddelafgifte naar de placenta te garanderen.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien evaluatie van embryonale ontwikkeling met hoogfrequente echografie geduld en ervaring vereist om te beheersen. Voor intraveneuze injectie van nanodeeltjes, breng een zwangere muis op embryonale dag 14,5 met warmte-uitgebreide staarvenen in een begrenzer, en maak de staart schoon met een alcoholdoekje. Steek vervolgens de naaldtip van een insulinesyringe van 28 gauge in een uitgebreide staarvene, en druk de plunjer gedurende vijf tot 10 seconden langzaam met gelijkmatige druk in om de nanodeel

comprehensive-evaluation-effectiveness-safety-placenta-targeted-drug

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Twin-to-twin transfusie syndroom en twin bloedarmoede polycythemia volgorde zijn twee potentieel verwoestende problemen in de perinatale geneeskunde. Beide aandoeningen komen alleen in monochoriale tweeling en het gevolg zijn van onevenwichtige de bloedstroom door de placenta vasculaire anastomosen. Wij bieden een eenvoudig protocol om nauwkeurig te evalueren van de aanwezigheid van vasculaire anastomosen met behulp van kleurstof injectie van de placenta schepen na de geboorte.

Nauwkeurige en eenvoudige evaluatie van de Vasculaire Anastomosen in monochoriale placenta met behulp van kleurstof

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Wij presenteren een gedetailleerde methode om de menselijke placenta fysiologie in vivo op termijn te bestuderen. De methode combineert bloedmonsterneming van de inkomende en uitgaande vaten op de moeder- en foetale zijkanten van de placenta met ultrasone metingen van volume bloedstroom en placenta weefselmonstering.

De 4-vaartuig Steekproef Aanpak bij Integratieve Studies van Menselijke Placentale Fysiologie<em&gt; In Vivo</em

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Hier presenteren we een protocol voor de synthese van placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP)-geconjugeerd lipide-polymeer nanodeeltjes via -voor-stapmodus ultrasoonapparaat en bioconjugate technieken. Deze deeltjes een roman hulpmiddel vormen voor de gerichte levering van therapeutics aan de meeste menselijke tumoren en placenta trophoblasts voor de behandeling van kanker en placenta aandoeningen.

Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren en beoordelen van de chemo-functie van Natural killer cellen van placentas door een colorimetrische plaat assay. De verminderde uteriene bloeddruk rat model van placentale ischemie werd gekozen om de antilichaam-gemedieerde isolatie en beoordeling van de chemo-functie van Natural killer cellen aan te tonen.

Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie

Hier wordt een protocol van ex vivo moeder-foetale vasculaire doorbloeding aangeboden om de toediening van een test artikel in de moeder vasculatuur mogelijk te maken en om de placentale overdracht van xenobiotische deeltjes of farmacologische agentia te evalueren in aanvulling op wijzigingen in placentale fysiologie.

Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

Er wordt een protocol gepresenteerd om te evalueren of kleine EV's (sEV's) geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van één aspect van pre-eclampsie) de bloed-hersenbarrière verstoren bij niet-zwangere volwassen vrouwelijke muizen.

Verstoring van de bloed-hersenbarrière van muizen door kleine extracellulaire blaasjes van hypoxische menselijke placenta's

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Leer een uitgebreide evaluatie van placenta-gerichte drug delivery met behulp van in vivo imaging, high-frequency ultrasound en HPLC. Deze methode maakt real-time monitoring en accurate biochemische metingen van geneesmiddelen in de placenta mogelijk.

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden (Video) | JoVE Journal

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

Meer video's verkennen