Name: 인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 학습하세요 석영 결정 미세천칭을 사용하여 Annexin A2와 고체 지지 지질 이중층의 칼슘 의존적 결합 역학을 분석하는 방법을. 이 기술은 무표지, 실시간 정량적 측정이 가능합니다.

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이 작품은 보조금 SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04, 및 SFB 1348/A11 도이치 가운데에 의해 지원 되었다.

참고: 0.22 μ m 필터를 사용 하 고 1 시간에 대 한 진공에 의해 degassed 버퍼 필터링 할 합니다.
1. 지질 기 준비
<ol><li>2 mL 유리 튜브를 사용 합니다. 각 지질 분해 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (아빠), 그리고 클로 프롬의 혼합물에 (철), 콜레스테롤 / 메탄올 (50: 50 v/v) 분명 5mm 지질 솔루션을 준비 하. 클로 프롬/메탄올/물 (20:9:1 v/v)의 혼합물에 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4, 5) P2)을 용 해.</li>
	<li>POPC/팝 (80/20), POPC/PI (4, 5) P2 의 원하는 어 금 니 비율에서 녹은 지질 결합 (95/5), POPC/팝/철 (60/20/20), POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (60/17/3/20), 및 POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (37/20/20/3/20) ( 표 1) 10 mL 유리 튜브. 참고: 총 지질의 최종 금액은 500 µ g.</li>
	<li>질소의 건조 스트림을 사용 하 여 유기 용 매를 증발. 3 h 용의 모든 잔여 자취를 제거를 위한 높은 진공 (동결은) 시스템에 지질 혼합물을 남겨 주세요. 참고:이 결과 건조 분명 영화.</li>
	<li>구 연산 염 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m m NaCl, pH 4.6)의 1 mL에서 지질 필름을 resuspend. 물 목욕, 소용돌이에 30 분 동안 60 ° C (이 온도 약 10 ° C의 혼합물에서 높은 녹는 지질 위상 전환 온도 이상)에서 지질 정지를 품 어 그것은 적극적으로 모든 5 분. 참고:이 대형, multilamellar 소포 (MLVs)의 형성 결과입니다. 전환 온도 이상 정지를 유지.</li>
	<li>예 열 (이 경우에 60 ° C)에서 압출 기 30 분에 대 한 전환 온도 (이 여기는 40-50 ° C) 위에 50 nm 직경 구멍 크기 폴 리카 보 네이트 막 장착.</li>
	<li>MLV 정지 preheated 압출 기에 로드 하 고 부드럽게 작은 unilamellar 소포 (Suv)14를 폴 리 카보 네이트 막 통해 혼합물 31 x를 통과. 전이 온도 이상의 온도 유지.</li>
	<li>2 mL 플라스틱 반응 배 SUV 정지 전송 및 구 연산 염 버퍼 추가 (단계 1.4 참조) 2 mL를 최종 볼륨을가지고. 참고:이 250 µ g/mL의 최종 지질 농도 얻을 것입니다.</li>
</ol>2. 처리 석 영 센서
참고: 항상 석 영 센서는 족집게를 처리 합니다.
<ol><li>4 품 어 센서 삽입에 ≥ 30 분 세척에 대 한 2 %SDS 솔루션에 소계 홀더 그들 광범위 하 게 완전히 제거 하는 SDS 고 그들이 말리 면 건조 아르곤 또는 질소의 스트림을 사용 하 여 매우 순수한 물으로.</li>
	<li>플라즈마 클리닝 시스템을 사용 하 여 어떤 오염 물질을 완전히 제거. 플라즈마 청소 챔버에 건조 센서를 삽입 하 고, 챔버, 철수 하 고 그것을 플러시 산소와 3 배. 플라스마 설정에 청소기. 다음 프로세스 매개 변수를 사용 하 여: 1 x 10-4 Torr 압력, 높은 무선 주파수 (RF) 전력 및 프로세스 시간 10 분. 컴퓨터를 끄고 꺼내 센서.</li>
</ol>3. 중량 작업
참고: 중량 시스템 병렬 구성, 연동 펌프에 연결 하 고 80 µ L/분의 유량으로 설정에 4 개의 온도 제어 흐름 챔버와 함께 사용 되었다. 오픈 흐름 모드에서 버퍼 받는 탱크로 급지대 저수지에서 펌핑 했다. 루프 모드에서 받는 탱크 폐쇄 루프를 생성 하는 피더 저수지와 연결 되었다. 온도 20 ° c.로 설정
<ol><li>신중 하 게 도킹 플라즈마 청소 센서 4 흐름 챔버에 핀셋을 사용 하 여. 어떤에 압력 또는 약 실 및 누수가 발생할 수 있는 튜브의 비틀림을 피하십시오.</li>
	<li>시트르산 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m NaCl, pH 4.6 m) 10 분 오픈 흐름 모드에서 시스템을 플러시. 참고:이 버퍼의 정확 하 게 3.2 mL를 필요 하지만 그것은 버퍼 (10 mL) 초과 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>프로그램을 시작 합니다. 주파수와 첫 번째 기본 톤의 변경한 녹음을 시작 (n = 1) 및 상 음 (n = 3-13) 주파수와 소비 기준을 안정 될 때까지 소프트웨어를 사용 하 여 (이 약 40-60 분을 걸릴 것 이다). 참고: 주파수 잡음 레벨 (피크-피크)는 0.1·10 보다 낮은 소비에 대 한, 그리고 0.5 Hz 보다 낮은 되어야 합니다.-6, 1/h 주파수 0.3·10의 (수 용액)에서 최대한 드리프트로 분산/h-6.</li>
	<li>베이스 라인은 안정, 시트르산 버퍼 (2 mL 작은 관)에 SUV 정지 적용. 반응 배를 사용 하 여, 죽은 양의 1.5 mL를 제거 합니다. 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 또 다른 10 분 동안 주파수/소비 변화를 기록 합니다. 참고:이 기간 동안에 소포 SiO2 표면에 확산 되며 연속 bilayer15,16 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3에서 단계 2)를 융합. 센서의 표면에 Suv 흡착 2 phasic 이며 전형적인 주파수 최소 및 최대는 분산에 있다. 26-29 Hz에서 (지질 구성)에 따라 특성 주파수 변화는 안정적인 새로운 주파수/분산 베이스 표면에 연속 bilayer를 나타냅니다 ( 표 1참조).</li>
	<li>SLB는 안정 (단계 3.4 참조) 시스템에 필요한 캘리포니아2 + 농도 (까지 50 µ M에서 최대 1 mM CaCl2, 실험에 따라)에 대 한 오픈 흐름 모드에서 실행 중인 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 equilibrate 40 분입니다.</li>
	<li>단백질을 추가 (여기, AnxA2)는 실행 버퍼 포함 캘리포니아2 + (단계 3.5 참조). 평형 안정 상태 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3의 3 단계)에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질의 응용 프로그램을 수행 합니다. 참고: 단백질 농도 범위는 수 있습니다 1에서 400 nM. 단백질 흡착 반영 질량 (단백질) 흡착 농도 의존 주파수 변화에서 발생 합니다.</li>
	<li>5 m m EGTA 오픈 흐름 모드 ( 그림 1 과 그림 2에서 단계 4)에서 실행 중인 버퍼에 캘리포니아2 + 이온을 킬레이트 화 하 여 바인딩된 단백질을 분리. 참고: 주파수의 분산 SLB 기준선을 복구 단백질 바인딩의 총 가역을 나타냅니다. 다른 농도 또는 단백질 비교 하 협회 분리 사이클을 반복할 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 중량 청소
참고: 각 측정 후 최소한의 청소 절차를 수행 합니다.
<ol><li>재생성 ddH2O 연속 오픈 흐름 모드에서의 50 mL와 중량 시스템, 물 컨테이너에서 튜브를 제거 하 고 건조를 실행 하는 시스템.</li>
	<li>조심 스럽게 크리스탈 센서를 제거 하 고 2 %SDS 솔루션 소계 홀더를 사용 하 여 청소 (단계 2.1 참조).</li>
	<li>센서 배치 했다 흐름 모듈 인테리어의 보이는 부분을 건조. 참고: 일련의 10 측정 절차를 청소 집중적인을 수행 합니다.</li>
	<li>세제와 확장 된 접촉에 대 한 20 µ L/분의 유량을 사용 하 여 연속 오픈 흐름 (튜브) 모드에서 40 ° C (소프트웨어에서 설치)에서 2 %SDS 솔루션 (50 mL) 시스템을 청소.</li>
	<li>DdH2O 160 µ L/min 흐름 속도로 연속 오픈 흐름 모드의 250 mL를 청소 합니다. 참고: 4 개월 후, 제조업체의 설명서에 따라 광범위 한 청소 절차를 수행 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

양적 및 질적으로 모두 세포 막의 구조-기능 관계에 관한 질문에 대답, 세포 생물학 생물 접근의 사용에서 대단히 잘 설립에 따라 이익과 널리 이용 되는 기법 원자를 포함 하 여 현미경 검사 법 (AFM), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 고 QCM D 기술을 여기에 고용. 우리는 캘리포니아2 +에서 annexin 단백질 바인딩 이전 연구에서 보여주었다-높은 선호도와 고정된 막에 의존 방식으로. 우리가 사용 하는 주파수 및이 검출 감도 진동 안정성의 좋은 타협을 나타냅니다 때문에 소비 7 상 음 (Δf7)의 교대.
이 기술은 또한 막 단백질 상호 작용의 양적 설명을 허용합니다. 막에 AnxA2 바인딩 보존된 annexin 핵심 도메인에 의해 중재 되 고 콜레스테롤의 존재에 따라 긍정적인 cooperativity 특징 이다. AnxA2와 AnxA8에 보고 됩니다 위한 얻은 정량적 데이터 자세히 다른6,8.
이 프로토콜에는 많은 중요 한 단계가 있습니다. 에 리를 사용 하 여 즉시; 그렇지 않으면, 작은 소포 적은 표면 장력, 지질 bilayer 형성의 억제에 지도 함께 더 큰 소포에 융합 될 수 있습니다. 측정 하는 동안 일정 한 온도 유지 합니다. 온도 있는 작은 탈 각 하지 무시할 주파수와 소비 변화에 발생합니다. 공기 방울; 방지 그렇지 않으면, 시스템은 불안정 하 고 초기 계획을 설정 하지 않습니다.
Sauerbrey 방정식에는 관찰 된 주파수의 직접 변환 질량에서 변화에 변경 하 고, 따라서, 널리 사용 되는 수 있습니다. 그러나, 공 진 주파수에 변화 그리고 추가 질량 사이의 선형 상관 관계의 가정에만 센서 표면에 견고 하 고 균일 한 필름을 형성 하는 구성 요소에 대 한 진정한 보유. Sauerbrey 방정식 점 탄성 adsorbents 물 풍부한 단백질 영화, 통합 물, 지질 층 등에 사용할 수 없습니다 또는 심지어 세포를 흡착. 여기, 더 복잡 한 수학적 모델은 필요. 따라서, 동시에 주파수와 소비 변화를 모니터링 하는 매우 중요 하다. 측정 도중 구조적인 변화를 감지, δ 비율 대 ΔD 그릴 수 있습니다, 구조적 변경 나타내는 직선으로.
이 기술의 주요 장점은 기판으로 매우 광범위 한 재료를 사용 하는 가능성입니다. 또한, 그것은 안정적이 고 직접적인 방법은 더 단백질 지질 상호 작용 뿐만 아니라 표면 코팅 필름 (SLB), 등의 적절 한 형성으로 다양 한 고분자 상호 작용을 공부 하는 온라인으로 모니터링할 수 있습니다.
이 프로토콜 수에 적용 다른 상호 작용 하는 막 단백질, 예를 들어 도메인 단백질19, 바 막-골격 연계20,21에서에서 중요 한 역할은 ERM (ezrin, radixin, 및 moesin) 단백질 가족 ,22또는 C2 또는 PH 도메인을 포함 하는 단백질. 또한, 다양 한 생물 학적 자료를 공부이 기술의 응용 프로그램 성공적으로 게시 된, 따라서 QCM 더 복잡 한 고분자 어셈블리 또는 상호 작용을 공부 하기 적합된 실험 플랫폼으로 구축 23,24셀이 됩니다.

세포 막에는 매우 역동적이 고 복잡 한 구조입니다. 막 지질, 함께 주변 및 integrally 관련된 막 단백질의 복합 혼합물 형태 microdomains를 조립 한다. 이러한 멤브레인 microdomains의 조정된 템포 공간 조직 주요 생리 적 프로세스1에 포함 된다. 막 microdomain 역학의 막 지질 작용 뿐만 아니라 인식 하 고 여기서는 microdomains에 농축 지질 주변 막 단백질의 능력에 의해 구동 됩니다. 특정 지질 단백질의 신규 모집은 종종 달성 을 통해 지질 인식 모듈, pleckstrin 상 동 (전화) 또는 C2 도메인2,3등. 생물 분석 방법 막 모델을 사용 하 여 분자 수준에서이 프로세스를 제어 하는 기본 원리를 이해 하는 열쇠는.
Annexins, 큰 multigene 가족, 캘리포니아2 +에서 부정 청구 막 지질, 주로 phosphatidylserine (PS), 바인딩할 그들의 능력에 대 한 잘 알려져 있습니다-제어 방식2. Annexin 가족의 두 번째 특징은 보존된 구조 세그먼트의 존재는 annexin 반복, 즉 현재 4 또는 8 시간 및 캘리포니아2 +-및 인지질 바인딩 사이트4항구. 캘리포니아2 +-종속 지질 상호 작용을 감지 하 고 전달 캘리포니아2 +완벽 한 위치에는 annexins를 배치-중재 대상 세포 막 신호. 일관 되 게, annexins microdomains 세포 및 인공 막 시스템5둘 다 콜레스테롤, phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PI (4, 5) P2), 및 PS, 농축의 형성을 유발 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 크리스털 중량 분산 (QCM-D)6,,78을 사용 하 여 annexin 막 상호 작용을 분석 하는 방법을 설명 합니다.
이 중량에 구성 하는 기본 요소는 진동 크리스탈 센서 표면 역할 이다. 흡착 및 바인딩 센서 표면에 분자의 질량에 있는 증가에 비례하여 공명 주파수 (f) 감소 합니다. 표면 균일 하 게 필름으로 코팅 되어, 추가 물질의 바인딩이이 계층의 구조적 무결성을 방해할 수 있습니다 그리고 점 탄성 (에너지 손실 계수 D)에서 이러한 변화는 또한 감시 될 수 있다. 이것은 지질 bilayers와 단백질의 상호 작용을 공부 하는 광범위 한 기술 이다. 이 방법에서는, 지질 소포는 적절 하 게 코팅된 센서 표면에 흡수 된다. 지질 bilayer 형성은 실리 카 기반 자료9,10, 유리한 소포 자주 하지 다른 친수성 표면에 파열 할 금11 UV 오존 노출, 티 오212또는 알 후 산화와 같은 2O313. 병합 vesicles의 파열 질량 및 분산 특성 변화를 선도 하는 수성 단계를 해제 합니다. 고체 지원 (SLB) bilayers 소포 융해에 의하여의 생성은 간단 하 고 강력한 고 모방 세포 막 복잡 한 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
되는 낭비 적인 크리스털 중량 레이블 및 중요 한 기술입니다. 주요 이점은 따라서 광범위 한 다양 한 연구 분야에 응용 프로그램을 제공 하는 표면에 충분히 박막을 생성 하는 어떤 물자 든 지 코트 가능성 이다. 단백질 막 상호 작용에서 관찰은 실시간, 그리고 결과 직접 분석할 수 있습니다. 동일한 센서 표면 (수행한 후 최소한의 청소이 프로토콜에서 설명), 후속 측정에 사용할 수 있습니다 따라서 정확한 내부 통제 및 analytes 사이 comparability에 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>< 강> 화학 물질 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>칼슘 클로</td>라이드 <td>Merck</td><td>017-013-00-2</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>클로로포름</td><td>로스</td><td>4432.1</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0878</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3493</td><td></td></tr><tr><td>PiP2</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850155P</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>아반티&nbsp;</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>팝스</td><td>아반티&nbsp;</td><td>840034P</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 염화물</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>183</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>압출기 Liposofast</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qsense E4 분석기</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QSense Dfind</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펌프 IPC 4</td><td>Ismatec</td><td>ISM 930</td><td></td></tr><tr><td>QSX 303 SiO2 이산화 규소 50nm</td><td>Qsense</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>PC 멤브레인 0.05&뮤; m</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>610003</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>버전 8 및 9</td></tr></tbody></table>

인지질 단백질 annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 microgravimetry

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

되는 낭비 적인 크리스털 중량 기술은 간단 하 고 레이블 없는 접근 방식을 동시에 통풍 관 및 점 탄성 물성 상호 작용의 측정을 허용 하는 센서 표면에 흡수/움직일 질량의 측정 단백질 지질 bilayers, 실시간에서 같은 단단한 지원 표면, 그리고 높은 감도. Annexins는 칼슘 이온의 조화를 통해 부정 청구 headgroups와 역 상호 작용 하는 인지질-바인딩 단백질의 높은 보존된 그룹. 여기, 우리가 양적 annexin a 2의 바인딩 분석을 고용 했다 프로토콜 설명 (AnxA2) 평면 지질 bilayers 석 영 센서의 표면에 준비를. 이 프로토콜 강력 하 고 재현할 수 데이터를 최적화 하 고 자세한 단계별 설명을 포함. 메서드는 다른 막 바인딩 단백질과 bilayer 작곡에 적용할 수 있습니다.

공 진 주파수 (δ)에서 감소 Sauerbrey 방정식에 의해 정의 된 흡착된 질량 (Δm)와 선형 방식에 연관 시킵니다. 17
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg">
여기, f 공명 주파수, Cf 는 주어진된 석 영과 공 진 주파수의 형상 및 물리적 특성에 의존 하는 상수 이며 A 센서 표면 영역입니다.
대부분의 응용 프로그램에서 흡착된 층 점 탄성 하지만 완전히 딱딱한 아니다. 석 영 센서 진동의 결과 감쇄 라고 하 분산 (D). 모니터링된 소비 변화 (ΔD) 바인딩된 대량18 점 탄성 속성을 연관 되며8을정의 다음과 같습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg">
여기, 전자방출 한 발진 기간 동안 손실 에너지 이며 자유롭게 진동 센서의 총 에너지는 전자저장 .
분석 하 고 바인딩 매개 변수를 계량, 주파수 등온선 평형 주파수 변화 (ΔΔfe) 단백질 농도 대 한 플롯에 의해 파생 됩니다. ΔΔfe 로 정의 됩니다.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg">
여기, δt 1 는 단백질 흡착과 δt 2 평형 상태의 시작을 나타냅니다. 비선형 커브 피팅6,8다음과 같이 Langmuir 방정식의 언덕 확장을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg">
여기, ΔΔf최대 최대 (포화) 바인딩 결과로 단백질 농도의 ΔΔfe , Kd 는 복잡 한, 단백질/멤브레인에 대 한 명백한 분리 상수 이며 n은 언덕 계수.
힐 계수 (n) 바인딩의 cooperativity에 설명합니다. N = 1, 힐 흡착 모델은 간단한 Langmuir 등온선 (동등한 바인딩 사이트 및 모든 분자 바인딩할 서로 독립적으로 지질 bilayer). N ≠ 1, 바운드 ligand 바인딩 다른 ligands에 대 한 선호도 막 변경, 하나 (n &gt; 1, 긍정적인 cooperativity)를 증가 또는 감소 (n &lt; 1, 네거티브 cooperativity) 선호도.
그림 1 실험 워크플로 동안 캘리포니아2 +공명 주파수에 교대를 측정 하는 우리의 실험실에 있는 사용의 회로도 보여준다-종속 바인딩 및 액체 단계에 있는 지질 bilayer에 AnxA2의 릴리스. 모범적인 녹음은 그림 2에 표시 됩니다. 그림 2 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 2B 분산 교대. 리 (그림 2A [1 단계])의 추가 따라 주파수에 눈에 띄는 드롭 그들의 흡착을 나타냅니다. 때문에 버퍼 가득 vesicles은 딱딱한, 하지만 점 탄성, 고 소비 증가 (그림 2B [단계 1]). 그 후, 병합 소포 파열. 안정적인 고원 (그림 2A [2 단계])에 도달할 때까지 수 반하는 릴리스는 소포 내부 버퍼의 흡착된 질량을 감소 합니다. 메모의 소포 추가 결과 높은 소비 변화는 bilayer에 대 한 응답에 변화는 SLB (그림 2B [2 단계])의 경직 된 동질적인 특성으로 인해 훨씬 작은. 단계 그림 2A 및 2B 기록 3 AnxA2의 바인딩 명확한 주파수 변화에 의해 보이는 것과 같이 질량을 추가 하지만 bilayer 구조와 방해 하지 않는, 지질, 소비에만 작은 변화에 의해 표시 된 대로. 캘리포니아2 + chelating 에이전트 EGTA (그림 1 및 그림 2 [단계 4])에 의해 제거, AnxA2 지질 영화에서 dissociates. 소산 녹음 뿐만 아니라 주파수, AnxA2 바인딩 Ca에 완전히 의존을 나타내는 bilayer (비교 2 단계와 4 단계 그림 2A와 2B)와 본 수준에 이동2 + 와 그 지질 영화 그대로 남아 있습니다.
AnxA2, 가장 할 추 등 부정 청구 지질에 따라 annexins의 이것은 명확 하 게 볼 때 아빠는 결 석 지질 bilayer (그림 3)에서. 그림 3 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 3B 분산 교대. 참고-25 Hz에서 안정 된 기준 주파수 이동 아직 소실 되지 않습니다 적절 한 bilayer 형성 (그림 3B [단계 2]), 표시 변경. 그러나, 주파수 (그림 3A) 또는 분산 (그림 3B) 변경 후의 캘리포니아2 + (그림 3A 와 3B [3 단계]) AnxA2의 추가 또는 EGTA (그림 관찰 된다 3A 및 3B [단계 4]), AnxA2 지질 영화 상호 작용할 수 없습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg"> 그림 1 : 실험 워크플로의 그래픽 모델. 이 워크플로 보여줍니다 친수성 센서 표면 (1 단계), 소포 흡수 기 퓨전/파열 SLB 형성 (2 단계), 및 캘리포니아2 +-종속 흡착 (3 단계) 및 AnxA2의 탈 착 EGTA 종속 (4 단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg"> 그림 2 : 모범적인 녹음. 이러한 패널 표시 (A) 7 상 음 공명 주파수의 시간에 따른 모니터링 및 (B)는 분산 측정 중 석 영 센서의 교대. 리의 응용 프로그램 소비 기준 (1 단계) 증가 하는 반면 주파수 기준선의 급속 한 드롭을 하면 됩니다. 기준의 안정화 bilayer (2 단계)의 형성을 나타냅니다. AnxA2 (200 nM) 흡착 (존재 캘리포니아2 +) 포함 하는 POP 지질 bilayer에 분산, 지질 영화 불안정 하지 나타내는 (3 단계)를 크게 변경 하지 않고 대량 추가. 캘리포니아2 + chelation EGTA와 시 주파수 기준선의 복구 (단계 4) 단백질의 총 탈 착을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg"> 그림 3 : 는 AnxA2에 바인딩되지 않기 SLBs 아빠의 부재에서 보여주는 부정적인 제어 실험. 이러한 패널 리와 SLB 형성 (단계 1 및 2)의 추가 보여줍니다. AnxA2의 추가 후 변경 (A) 주파수 또는 (B) 소비는 명백한 (단계 존재 캘리포니아2 +3, 200 nM) 또는 EGTA (4 단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>구성</td>
			<td>ΔΔF/Hz SLBs의 형성 후</td>
			<td>ΔΔD * 10-6 SLB의 형성 후</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/팝 (80: 20)</td>
			<td>26.3 ± 0.2</td>
			<td>0.26 ± 0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/PI (4, 5) P2 (95: 5)</td>
			<td>26.5 ± 0.5</td>
			<td>0.31 ± 0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/팝/철 (60: 20: 20)</td>
			<td>29.2 ± 0.2</td>
			<td>0.45 ± 0.09</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (60: 17: 3시 20분)</td>
			<td>29.6 ± 0.6</td>
			<td>0.43 ± 0.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (37: 20: 20: 3시 20분)</td>
			<td>29.4 ± 0.4</td>
			<td>0.39 ± 0.14</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 지질 구성과 형성 데이터는 SLB의 7 .

여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

이 방법은 지질 막을 가진 단백질의 방향을 공부하는 것을 도울 수 있습니다. 우리의 경우, 부정적으로 충전 된 인지질에 부속의 칼슘 의존적 결합을 분석하는 데 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 라벨이 없고 민감하며 정량적이며 상호 작용을 실시간으로 관찰할 수 있다는 것입니다.따라서 실제 결과의 직접 분석을 허용합니다. 이 기술은 또한 더 복잡한 소분자 어셈블리 또는 세포의 상호 작용과 같은 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 명확한 5밀리머 지질 솔루션을 사용합니다.10 밀리리터 유리 튜브에 원하는 어금니 비율로 용존 지질을 결합합니다. 질소의 건조한 스트림을 사용하여 유기 용매를 증발시다. 용매의 잔류 흔적을 제거하기 위해 3 시간 동안 높은 진공 lyophilization 시스템에 지질 혼합물을 둡니다.이제 지방 막을 1 밀리리터의 체산화 로 다시 일시 중단합니다. 수조에서 섭씨 60도에서 지질 현탁액을 30분간 배양하여 5분마다 활발하게 소용돌이를 입습니다. 이 온도는 혼합물에서 가장 높은 용융 지질의 위상 전이 온도보다 섭씨 약 10도입니다.한편, 전이 온도보다 50나노미터 직경의 모공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인을 장착한 압출기는 30분 동안 예열한다. 다일라멜라 소포 서스펜션을 예열된 압출기에 적재합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 혼합물을 31번 부드럽게 전달하여 작은 유니라멜라 소포 또는 SUV를 형성합니다.온도가 전이 온도 보다 높게 유지됩니다. SUV 서스펜션을 2밀리리터 플라스틱 반응 용기로 옮기고 구연산 버퍼를 추가하여 최종 볼륨을 2밀리리터에 가져옵니다. 폴리테트라플루오로틸렌 홀더에 삽입된 4개의 센서를 2% SDS 솔루션에 30분 이상 배양합니다.그런 다음 SDS를 완전히 제거하고 건조 아르곤 또는 질소의 스트림을 사용하여 시도하기 위해 초순수물로 광범위하게 세척하십시오. 플라즈마 세척 시스템을 사용하여 오염 물질을 완전히 제거하십시오. 이를 위해 플라즈마 세정실에 건조 센서를 삽입하고 챔버를 대피시키고 산소로 세 번 세척합니다.그런 다음 플라즈마 클리너를 켭니다. 진공, 높은 무선 주파수 전력 및 10분의 공정 시간을 사용합니다. 청소 가 끝난 후 기계를 끄고 센서를 꺼낸다.핀셋을 사용하여 플라즈마 청소 센서를 4개의 유량 챔버에 조심스럽게 도킹합니다. 누출을 일으킬 수 있는 챔버와 튜브의 압력이나 비틀림을 피하십시오. 열린 흐름 모드에서 구연산 버퍼로 시스템을 10분 동안 플러시합니다.프로그램을 시작합니다. 주파수 및 소멸 기준선이 안정될 때까지 소프트웨어를 사용하여 첫 번째 기본 톤과 배음의 주파수 및 소멸의 변경 사항을 기록하십시오. 기준선이 안정되면 체연성 버퍼에 SUV 서스펜션을 적용합니다.반응 용기를 사용하여 죽은 부피의 1.5 밀리리터를 제거한 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 주파수 소멸 시프트를 10분 더 기록합니다. SLB가 안정되면 40분 동안 열린 유동 모드에서 필요한 칼슘 농도에서 실행 버퍼로 시스템을 평형화합니다.칼슘을 함유한 러닝 버퍼에 단백질을 넣습니다. 평형 정상 상태에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질의 적용을 수행합니다. 이제, 오픈 유동 모드에서 실행 버퍼에 5 밀리모어 EGTA와 칼슘 이온을 킬로하여 결합 된 단백질을 해리.연속 오픈 유동 모드에서 50밀리리터의 이중 증류수로 마이크로밸런스 시스템을 재생합니다. 물 용기에서 튜브를 제거하고 시스템이 건조하게 하십시오. 정결정 센서를 조심스럽게 제거하고 폴리테트라플루오로틸렌 홀더를 사용하여 2% SDS 용액으로 세척합니다.센서가 배치된 유동 모듈 내부의 가시 부품을 건조시합니다. 여기에 도시된 주파수 곡선 및 소멸 시프트의 기록입니다. 리포솜을 첨가하면 주파수의 눈에 띄는 하락은 완충소포가 단단하지 않지만 점성성이 있기 때문에 흡수를 나타내며, 방출이 증가합니다.그 후, 합착 소포파열. 소포 내부의 완충제의 수반되는 방출은 안정된 고원에 도달할 때까지 흡착 질량을 감소시다. 지질에 대한 부속서 A2의 결합은 명확한 주파수 변화에 의해 보이는 질량을 추가하지만, 소멸의 유일한 작은 변화에 의해 표시된 바와 같이 이중 층 구조를 방해하지 않는다.칼슘 이온이 킬라팅 에이전트에 의해 제거되면, EGTA, 부속서 A2는 지질 필름에서 해리. 주파수및 소멸 기록은 부속서 A2 결합을 나타내는 이중층으로만 보이는 수준으로 이동하며 칼슘 이온에 완전히 의존하며 지질 필름은 그대로 유지됩니다. 대표적인 음성 제어 실험이 여기에 표시됩니다.인산염이 없을 때, 칼슘 이온이 있는 경우, 부속서 A2를 첨가한 후에는 주파수 나 소멸의 변화가 뚜렷하지 않다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 이중 레이어 형성을 보장하는 것이 중요합니다. 리포솜을 즉시 사용하면 작은 소포가 표면 장력이 적어 불안정한 기준선으로 이어질 수 있는 더 큰 소포로 융합됩니다.이 절차에 이어, 막 단백질 상호 작용에 대한 양자적 설명은 협동 대 비협조적 결합과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행될 수 있다.

dissipative-microgravimetry-to-study-binding-dynamics-phospholipid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

이 비디오는 단백질과 지질 이중층의 결합을 조사하기 위한 소산 미세중량 측정 기술을 보여줍니다. 작은 단층 소포(unilamellar vesicles)가 추가되어 마이크로 저울의 석영 센서 표면을 코팅합니다. 표적 인지질 결합 단백질의 이중층에 대한 칼슘 이온 의존적 결합을 활용하여 센서의 진동 빈도 변화와 진동의 소실을 모니터링하여 단백질-지질 이중층 결합의 특성을 결정합니다.

단백질-지질 이중층 상호작용을 연구하기 위한 소산 미세중량 측정 기법

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

석영 크리스탈 마이크로 저울은 생물 의학 및 환경 감지, 코팅 및 폴리머 과학의 조사와 관련된 미크론 또는 서브미크론 범위의 필름에 대한 정확한 질량 및 점탄성 특성을 제공할 수 있습니다. 샘플 두께는 센서와 접촉하는 재료로부터 정보를 얻을 수 있는 영향을 미칩니다.

단백질 흡착 및 폴리머 역학의 석영 결정 미세 균형 측정시 시료 준비

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

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생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

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