Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di rilevare e isolare i corpi apoptotici ad alta purezza. I corpi apoptotici sono un tipo di vescicole extracellulari generate per aiutare l'induzione dell'ematosi. Sono il tipo più grande di famiglia fisica extracellulare che in genere varia da uno a cinque micrometri di diametro.

Sta diventando evidente che i corpi apoptotici possono aiutare i processi cellulari, come la clearance cellulare apoptotica e la comunicazione intracellulare. Pertanto, lo sviluppo di una metodologia accurata per rilevare, quantificare e isolare i corpi apoptotici è fondamentale per la personalizzazione delle loro funzioni e meccanismi. In questa serie di approfondimenti vi mostreremo come rilevare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da campioni apoptotici.

Parte A, l'induzione dell'apoptosi. Per indurre l'apoptosi nelle linee cellulari, come i monociti THB1, iniziare prima raccogliendo le cellule. Contare le cellule e raccogliere circa 10 milioni di cellule o secondo necessità.

Raccomandiamo 10 milioni per l'analisi dei corpi apoptotici. Alloquatare due milioni di cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Rimuovere il coperchio dalla piastra a sei pozzetti e dalle celle UV utilizzando l'UV Stratalinker 1800.

Irradiare le cellule a 150 millijule per centimetro quadrato. Questa irradiazione dovrebbe durare circa 30-60 secondi. Al termine dell'irradiazione, incubare le cellule per due-otto ore, a seconda della linea cellulare.

A questo punto, le cellule dovrebbero mostrare morfologie apoptotiche, come il blemming apoptotico e la formazione di corpi apoptotici. Raccogliere le cellule apoptotiche con una pipetta P1000. Raccogliere circa 1/10 del campione apoptotico per l'intero controllo del campione apoptotico.

Raccogli anche un campione non trattato o vitale. Centrifugare sia l'intero campione apoptotico che il campione non trattato a 3.000 g per sei minuti. Risospendere in PBS e mettere da parte sul ghiaccio.

Per l'isolamento del corpo apoptotico, continuare con il passaggio B o C.B, Isolamento del corpo apoptotico utilizzando FACS. Centrifugare il campione apoptotico rimanente a 3.000 g per sei minuti. Rimuovere il surnatante dal campione di apoptosi rimanente.

Risospendere il campione apoptotico rimanente in una soluzione colorante contenente il nexum 550 e la colorazione topo tre per 10 minuti, a temperatura ambiente, al buio. Dopo la centrifugazione, risospendere in tampone FACS e quindi filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 micron per garantire una separazione efficiente delle cellule. Eseguire una configurazione standard della macchina FACS.

Acquisisci l'intero campione apoptotico e modifica le impostazioni di tensione per assicurarti che tutti gli eventi siano all'interno dei bot FACS e che le popolazioni possano essere facilmente separate. Impostare la strategia di gating come descritto nella sezione successiva sulla strategia di gating per citometria a flusso. Selezionare la popolazione di corpi apoptotici con gate e il numero desiderato di corpi apoptotici per la raccolta.

Eseguire un ordinamento iniziale per confermare le impostazioni di ordinamento e la purezza del corpo apoptotico. Dopo aver eseguito un ordinamento, eseguire un black flush del sistema e rianalizzare il campione ordinato. Se si raggiunge un'elevata purezza, continuare a selezionare il numero desiderato di corpi apoptotici.

Una volta completata la cernita, prelevare una piccola porzione del campione di corpo apoptotico pro sort e rianalizzarla per confermarne la purezza. Parte C, isolamento del corpo apoptotico tramite centrifugazione differenziale. Centrifugare il campione apoptotico rimanente a 300 g per 10 minuti.

Questa fase di centrifugazione separerà le cellule, comprese le cellule apoptotiche, le cellule vitali e le cellule necrotiche da piccole vescicole extracellulari, che rimarranno nel surnatante. In una nuova provetta di falco, raccogliere il surnatante contenente le vescicole extracellulari. Risospendere la fazione arricchita di apoptosi in PBS e mettere da parte sul ghiaccio con i campioni di apoptosi non trattati e interi.

Centrifugare il surnatante raccolto contenente i corpi apoptotici a 3.000 g per 20 minuti. Rimuovere il surnatante contenente le vescicole extracellulari più piccole, facendo attenzione a non rompere il pellet che conterrà i corpi apoptotici. Risospendere i corpi apoptotici in PBS e raccogliere 100 microlitri di ciascuno del campione apoptotico intero non trattato, delle cellule apoptotiche arricchite e dei corpi apoptotici arricchiti e colorare con la soluzione di colorazione nexum cinque e topo tre.

Rimanere al buio per 10 minuti a temperatura ambiente prima di eseguire l'analisi della citometria a flusso. Analizza come descritto nella strategia di gating delineata. Parte D, strategia di gating per citometria a flusso.

Per iniziare l'analisi della citometria a flusso, separare le cellule topo tre ad alta necrosi da tutti gli altri eventi confrontando le cellule topo tre e quattro insieme. Dagli eventi di non permeabilizzazione, eseguire il gate successivo. Seleziona gli eventi di non permeabilizzazione e confronta un scatter laterale rispetto a un nexum cinque.

Selezionare due popolazioni, tra cui un intermedio di dispersione laterale in alto, un nexum cinque celle da basse a intermedie. Questa popolazione è P1. Crea anche una seconda popolazione che includa tutti gli altri eventi. Questa popolazione è P2. P1 conterrà cellule vitali e cellule apoptotiche precoci.

P2 conterrà tutti gli eventi apoptotici e i detriti. Selezionare P2 per ulteriori controlli. Da P2, rimuovere tutti i detriti confrontando il topo tre con un nexum cinque.

Seleziona tutti gli eventi intermedi e alti del nexum five. Questa popolazione includerà ora tutti i corpi apoptotici e le cellule apoptotiche. Selezionare questa popolazione.

Per separare i corpi apoptotici dalle cellule apoptotiche, confrontare la dispersione completa con il nexum cinque. Per selezionare i corpi apoptotici, selezionare Dispersione completa bassa. Per selezionare le celle apoptotiche, selezionare gli eventi a dispersione completa da intermedi ad alti.

Quando si esegue l'isolamento del corpo apoptotico mediante FACS, si consiglia di eseguire un'ultima strategia di gating selezionando la frazione del corpo apoptotico e visualizzandola per topo tre contro un nexum cinque. Seleziona tutti gli eventi. Questo viene utilizzato per selezionare la strategia di gating basata sulla fluorescenza piuttosto che sulle proprietà di dispersione completa e di dispersione laterale per aumentare la precisione per lo smistamento.

Per identificare le cellule vitali, tornare alla popolazione P1. Per l'analisi generale delle cellule vitali, selezionare P1 e confrontare la dispersione completa con il nexum cinque. Seleziona tutte le celle a dispersione completa da intermedie ad alte.

Ciò includerà tutte le celle vitali, rimuovendo eventuali detriti rimanenti. In alternativa, per un'analisi dell'apoptosi più approfondita, è possibile separare le cellule vitali e quelle apoptotiche precoci. Per questo, confronta topo tre versi a dispersione completa.

Le cellule vitali saranno topo tre basse, a dispersione completa da intermedia ad alta. Le cellule apoptotiche precoci contengono una colorazione intermedia topo tre. L'intera strategia di gating può quindi essere applicata a tutti i campioni analizzati.

Ad esempio, per i corpi apoptotici isolati dopo FACS. Applicare la strategia di gating a tutti i campioni. La purezza del corpo apoptotica può quindi essere preparata.

Ad esempio, selezionando solo le cinque popolazioni positive del nexum, confrontando la dispersione completa e un nesso cinque. Questo dimostra quindi i corpi apoptotici dopo l'isolamento. Risultati rappresentativi.

L'analisi della citometria a flusso è stata eseguita per confermare l'induzione dell'apoptosi. Questa strategia di gating consente l'identificazione di cellule vitali, cellule apoptotiche precoci, cellule apoptotiche tardive e cellule necrotiche nel campione irradiato con raggi UV. Questa metodologia ha dimostrato l'isolamento dei corpi apoptotici mediante due approcci.

In primo luogo, un approccio basato su FACS, in cui i corpi apoptotici sono stati arricchiti al 99% di purezza e un approccio di centrifugazione differenziale in cui i corpi apoptotici sono stati isolati al 97% di purezza. Ciò è stato confermato dalla citometria a flusso in cui i corpi apoptotici sono stati separati da cellule, comprese le cellule vitali, le cellule apoptotiche e necrotiche. Conclusione. Il nostro approccio può fornire un nuovo strumento per l'apoptosi e la ricerca sui corpi apoptotici.

Contribuendo così ai loro progressi nella personalizzazione di questi meccanismi e aiutando a produrre nuovi sviluppi nel targeting di questi processi.