Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

Denne analyse blev udviklet for at løse centrale spørgsmål inden for plasmamembranbiologi og for at fastslå, hvor effektivt beskadigede celler kan gense deres plasmamembran. Denne teknik kan bruges til at måle effektiviteten af plasmamembranen genforsegling i en høj kapacitet og til at identificere specifikke proteiner og tilsvarende veje, der mægle plasma membran genforsegling. Begynd med at tilføje 20 milliliter af en 2,5 gange 10 til den femte HeLa celler pr. milliliter vækstmedium suspension i en steril pipette bassin og bruge en 10 milliliter serologisk pipette til grundigt at blande cellerne.

Dernæst skal du bruge en multikanal mikropipette til frø 100 mikroliter af celler pr godt i tre eksemplarer i en 96-godt flad, klar bund, sort polystyren væv kultur behandlet plade. Husk, at en homogen cellefordeling er nøglen til et vellykket eksperiment, da sammenligninger mellem alle forsøgsbetingelser kræver tilsvarende celletal. Efter 24 timer i den befugtede cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2, prewarm pladelæseren til 37 grader Celsius og indstille den optiske konfiguration til monochromator, læse-tilstand til fluorescens, og læse type til kinetisk.

Under bølgelængdeindstillingerne skal du vælge en ni nanometeroptimering og en 15 nanometeremissionsbåndføring. For analyser ved hjælp af propidium iodid indstilles excitation og emissionsbølgelængder til henholdsvis 535 nanometer og 617 nanometer. Vælg 96-brønde til pladeformatet under pladetypen, og vælg en forudindstillet pladekonfiguration, der svarer til en sort væg klar bundplade.

Under læse område, fremhæve brønde, der vil blive analyseret i hele kinetisk analyse. Under YDELSE og optik, forudindstillet blinker per læse til seks og markere feltet for læse fra bunden. Under timing skal du indtaste nul timer 30 minutter og nul sekunder ind i den samlede driftstid for en 30 minutters kinetisk analyse og indtaste nul timer fem minutter og nul sekunder for intervallet.

Bekræft de angivne indstillinger i indstillingsoplysningerne, og klik på OK. Klik derefter på læsning for at starte den kinetiske kørsel. Hvis du vil indstille billedparametrene i indstillingstilstanden, skal du indstille MiniMax for den optiske konfiguration, billedbehandling for læsetilstanden og slutpunktet for læsetypen. Under bølgelængder skal du vælge transmitteret lys og de relevante fluorescensbokse, der svarer til de eksperimentelle excitations- og emissionsbølgelængder.

Indstil pladetypen og læseområdet som lige demonstreret, og indstil antallet af steder inden for en brønd, der skal afbildes, under brøndområdet. Under indstillingerne for billederhvervelse for GFP skal du indstille enheden til at afbilde hele brønden med en eksponeringstid på 20 millisekunder pr. billede. For transmitteret lys, erhverve et enkelt billede af midten af hver brønd med en otte millisekund eksponeringstid.

For propidium iodid, erhverve et enkelt billede i midten af hver brønd med en 20 millisekund eksponeringstid. Bekræft derefter indstillingerne i indstillingsoplysningerne, og klik på OK og læs for at starte billeddannelsen. For at sætte en høj-throughput fluorescens-baserede analyse for reparation eftergivende betingelser, vaske cellerne to gange med 200 mikroliter på 37 grader Celsius M1 medium per brønd og tilsæt 100 mikroliter af friske 37 grader Celsius M1 medium suppleret med 30 micromolarid propium iodid efter kassering den anden vask.

For reparation restriktive betingelser, vaske cellerne én gang med 200 mikroliter af 37 grader Celsius M2 medium suppleret med fem millimolar EGTA per brønd efterfulgt af en vask med 200 mikroliter af M2 medium alene. Efter udsmid af den anden vask tilsættes 100 mikroliter af frisk 37 grader Celsius M2 medium suppleret med 30 mikromolar propidium iodid pr. brønd. Afbild derefter pladen under transmitteret lys, GFP og PI som netop demonstreret.

Mens pladen bliver afbildet, skal du placere en 96 godt rund bund polypropylen mikroplate på is og konfigurere pladen som netop påvist for den foregående plade. For reparation eftergivende betingelser, tilsættes 100 mikroliter af iskold M1 medium suppleret med 60 micromolar propidium iodid per brønd efterfulgt af tilsætning af 100 mikroliter iskold M1 med eller uden 4X listeriolysin O per brønd. For reparation restriktive betingelser, tilsættes 100 mikroliter af iskold M2 medium suppleret med 60 micromolar propidium iodid per brønd efterfulgt af tilsætning af 100 mikroliter iskold M2 med eller uden 4X listeriolysin O per brønd.

Det er bydende nødvendigt at forberede listeriolysin O ved den relevante eksperimentelle koncentration på is ca. fem minutter før påbegyndes af den kinetiske analyse, når plade et er på is og plade to er under udarbejdelse. Når den første plade er færdig billeddannelse, straks overføre pladen på et ark aluminiumsfolie på is. Efter fem minutter overføres 100 mikroliter fra hver brønd af den anden plade til den passende tilsvarende brønd i den første afkølede plade, der indsættes pipeterne under opløsningens menisk i hver brønd, før du skubber lydstyrken ud uden at blande for korrekt fordeling af toksinet.

Lad toksinet binde sig til værtscellerne i et minut, og overfør straks den første plade til pladelæseren for den postkinetiske analyse ved hjælp af spektrofluorometertilstanden. Ved afslutningen af den kinetiske analyse, straks erhverve en post-kinetisk billeddannelse af pladebilledet som påvist for præ-kinetisk billeddannelse. Hvis du vil bestemme celletallet baseret på den nukleare fluorescens, i mikropladecelleoptællingssoftwaren under indstillinger, skal du vælge reanalyse og i billedanalyseindstillingerne vælge diskret objektanalyse ved hjælp af 541 som en bølgelængde til at finde objekter.

I indstillingen Find objekter skal du bruge metoden draw on images finding, select nuclei, og klik på Anvend, klik derefter på OK og læs for at starte celletællingsalgoritmen. GFP-udtrykket forstyrrer ikke propidiumididintensitetsmålinger ved tilstedeværelse eller fravær af listeriolysin O-behandling. Ekspressionen af propidiumidid kan bløde gennem GFP fluorescens som det fremgår af en stigning i GFP fluorescensintensiteten i HeLA H2B-GFP-celler i den postkinetiske billeddiagnostic sammenlignet med den prækinetiske analyse.

Det er dog vigtigt, at denne crossover ikke påvirker celletællingen, da segmenteringsprocessen, der er involveret i optællingen af kernerne, ikke påvirkes af en stigning i GFP-fluorescens. I mangel af listeriolysin O forbliver plasmamembranens integritet konstant i tilstedeværelse eller fravær af ekstracellulær calcium, mens listeriolysin O-behandling ved tilstedeværelse af calcium suppleret medium resulterer i en støt stigning i propidiumididfluorescensintensiteten. I mangel af ekstracellulært calcium er der imidlertid en betydeligt kraftigere stigning i propidiumididfluorescens, hvilket afspejler fraværet af membranforsegling.

Alternativt kan en carbocyanin nukleinsyre bindende farvestof med fluorescens i langt rød erstattes af propidium iodid for at minimere den spektrale overlapning med GFP. Desuden udviser den større excitationskoefficient for det langt røde farvestof et højere signal til støjforhold og en bedre opløsning mellem reparations- og reparationsbegrænsende forhold. Under forsøg på denne procedure anbefales det at mærke alle rørene en dag forud for forsøget, da dette vil forberede dig på alle reagenspræparatet på eksperimentets dag.

Efter denne procedure, andre metoder som billede cytometri kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål, såsom gør en pore danner toksin beskadige alle celler ensartet eller er nogle celler mere modtagelige end andre. Efter sin udvikling, denne teknik har banet vejen for forskere inden for smitsomme sygdomme og plasma membran reparation at undersøge virkningerne af pore størrelse på reparation effektivitet af forskellige celletyper.