Name: Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 L-DOPA의 생합성을 이용한 유전적 단백질 결합 방법을 E. coli에서. 이 기술은 화학생물학 연구에서 단백질 수정의 특이성과 효율성을 높여줍니다.

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이 연구는 글로벌 프 런 티어 연구 프로그램 (NRF-2015M3A6A8065833)에 의해 지원 되었다 그리고 기본 과학 연구 프로그램 (2018R1A6A1A03024940)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부에 의해 자금.

1. 플라스 미드 건설
<ol><li>제정 발기인의 통제 Citrobacter freundii 에서 TPL 유전자와는 그의 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 표현 하는 식 플라스 미드 (pBAD-듀얼-TPL-GFP-WT) 생성6-태그의 통제는 araBAD 발기인입니다. PBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG, (E90) 사이트에 대 한 codon의 사이트 지시 된 mutagenesis 프로토콜을 사용 하 여 호박 codon (태그)와 DOPA 교체 합니다. 이 플라스 미드의 건설에 대 한 자세한 내용은 우리의 이전 보고서18에서 설명 했다.</li>
	<li>TRNA/aaRS 표현 플라스 미드 (pEVOL-DHPRS2)18,19 DOPA의 유전자 결합에 대 한 생성 합니다. pEVOL 독립적인 발기인 aaRS 유전자의 두 복사본을 표현 하는 특별 한 플라스 미드 벡터 이며, 플라스 미드의 자세한 정보는 이전 보고서19에서 설명 합니다.</li>
	<li>고 순도 플라스 미드 DNAs를 상업적으로 사용할 수 있는 플라스 미드 준비 키트를 사용 합니다. 필요한 경우에 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 준비한 DNAs의 순도 확인 합니다.</li>
</ol>2. 문화 준비
<ol><li>
Electroporation
	<ol>
<li>이 실험에 대 한 사용 전기 유능한 대장균 DH10β 스트레인. 유능한 세포의 20 µ L를 각 플라스 미드 DNA (pEVOL-DHPRS2와 pBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG)의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 만들기 위해 그들을 피 펫을 사용 하 여 균질 혼합 믹스.</li>
		<li>Electroporation 큐 벳에 혼합물을 전송. 장소 electroporation 약 실에 있는 베트입니다. 회사 베트-챔버 수 있도록 챔버에는 베트를 밀어 문의.</li>
		<li>멧, 25 µ F를 사용 하 여 충격 및 2.5 kV 0.1 cm 큐 벳을 위해.</li>
		<li>1 mL prewarmed 슈퍼 최적의 국물 (SOC)의 2% (w/v) tryptone 포함 된 추가, 0.5% (w/v) 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 및 베트에 20 mM 포도 당을 효 모 문화 관에는 셀을 전송. 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 대 한 그들을 배양 하 여 세포를 구출.</li>
		<li>10-100 µ L 35 µ g/mL 페니와 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 구조 세포의 확산. 16 h 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
초보 문화 준비
	<ol>
<li>단일 변환 된 식민지 파운드 매체 포함 된 항생제의 5 mL에 접종 떨고와 37 ℃에서 12 h에 대 한 식민지를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 표현과 GFP-E90DOPA 생 합성 시스템의 정화
<ol><li>
GFP E90DOPA 생 합성 시스템에 의해 표현
	<ol>
<li>PA-5052 중간20 (50 m m 나2HPO4, 50 m m KH2포4, 25 mM [NH4]24, 2mm MgSO4, 0.1% [w/v] 추적 금속, 0.5% [w/v] 글리세롤, 그래서 100 mL를 선발 문화 (2 mL)를 전송 0.05% [w/v] 포도 당, 및 5% [w/v] 아미노산 [pH 7.25]) 떨고와 30 ° C에 외피 다음 35 µ g/mL 페니, 100 µ g/mL 암 피 실린, 100 mM pyruvate, 10 m m catechol, 25 mM 암모니아, 그리고 300 µ M dithiothreitol (DTT).</li>
		<li>때 0.2% (w/v) L arabinose의 2 개 mL를 추가 550 nm에 도달 0.8에서 광학 밀도 (OD). 떨고와 30 ° C에 12 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>5 분 11000 x g에서 셀 아래로 회전, 상쾌한, 삭제 시키고-80 ° c.에 셀 펠 릿을 동결</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>얼음에 셀 펠 릿을 녹여 및 50 mM NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 10 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>25의 10 분 사용 80% 쥡니다 진폭 펄스에 대 한 얼음에 resuspended 셀 sonicate s 오프 및 35 s.</li>
		<li>15 분 이전에 상쾌한 정화에 대 한 신선한 튜브 4 ° C에서 18000 x g에서 lysate 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 펠 릿을 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ni NTA 친화성 크로마토그래피
	<ol>
<li>상쾌한에 Ni NTA (nitrilotriacetic 산) 수 지 (100 mL 문화에 대 한 수 지 서 스 펜 션의 300 µ L)를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 1 시간에 대 한 서 스 펜 션으로 단백질을 4 ° C에서 Ni NTA 수 지에 바인딩할.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌의 열 정지를 전송 하 고 3 수 지 세척 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 워시 버퍼의 5 mL x 20 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>3 단백질을 elute 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 차입 버퍼의 300 µ L x 250 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>280에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정 nm. 280에서 GFP-E90DOPA에 대 한 소멸 계수 (24,630 M-1c m-1) nm 단백질 소멸 계수 계산기를 (예, https://web.expasy.org/protparam/)와 독립적으로 측정 된 멸종에 의해 산출 되었다 coefficiennt (2630 M-1c m-1) DOPA 대체 방법으로 단백질 농도의 결심을 위한 Bradford 단백질 분석 결과21 을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 순화 GFP-E90DOPA oligomerization
<ol><li>나트륨의 1 µ L H2O (6 m m) periodate 추가 (1.0 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (300 μ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에 300 mm NaCl.</li>
	<li>48 h 25 ° C에서 진행 oligomerization 반응을 수 있습니다.</li>
	<li>나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 반응 혼합물 분석) (SDS 페이지) 6 단계에 설명 된 대로.</li>
</ol>5. SPOCQ에 의해 Alkyne 프로브 GFP-E90DOPA의 활용
<ol><li>Cy5.5 연결 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 m m) 1 µ L을 추가 (10 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (20 µ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에서 300 mm NaCl.</li>
	<li>나트륨의 1 µ L H2O periodate 추가 (400 µ M) (1.0 equiv. GFP E90DOPA에) 반응 혼합물에.</li>
	<li>1 시간에 25 ° C에서 진행 SPOCQ 반응을 수 있습니다. 빛에 민감한 프로브를 사용 하는 알루미늄 호 일로 반응 배를 커버.</li>
</ol>6입니다. 레이블이 GFP의 정화
<ol><li>50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼를 추가 하 여 SPOCQ 반응 혼합물을 희석 및 300 mM NaCl, 최대 500 µ L.</li>
	<li>원심 필터 스핀 열 희석된 솔루션을 전송 합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 스핀 열 원심 그리고 흐름을 통해 삭제. 어떤 초과 Cy5.5 ADIBO를 제거 하려면이 단계 3를 반복 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스핀 열에서 정화 샘플을 전송.</li>
	<li>또는, 동일한 버퍼에 대 한 투 석으로는 정화 실시 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 순화 된 GFP를 저장</li>
</ol>7. SDS 페이지 분석 및 형광 젤 검색
<ol><li>5 µ L의 단백질 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지 분석 단백질 견본 준비 ( 재료의 표참조)와 2 µ L DTT (1.00 M)의 정화, 또는 원유, 13 µ L 표시 GFP (13.6 µ M 또는 0.38 mg/mL). Oligomeric GFP의 분석, GFP (67.8 µ M 또는 1.9 mg/mL)의 높은 농도 사용 하 여. 10 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 단백질을 변성.</li>
	<li>전기 이동 법 셀 4%-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤 카세트 (구입, premade 젤 카세트)를 배치 하 고 실행 중인 버퍼 추가 ( 재료의 표참조). 단백질 견본 및 분자량 마커를 로드 합니다. 200 V에서 35-40 분 동안 전기 이동 법을 실행 합니다. 참고: 단백질 샘플 사진 표백 형광 프로브의 최소화 하기 위해 어둠 속에서 모든 프로세스를 수행 하 여 빛의 어떤 노출을 피하십시오.</li>
	<li>형광 스캐너를 사용 하 여 형광 이미징에 대 한. 단백질 젤 전기 이동 법에서 랩 하 고 형광 스캐너에 놓습니다. 적절 한 파장 설정을 사용 하 여 젤을 스캔. Cy5.5, 스캐너 소프트웨어에 제공 Cy5 모드를 선택 합니다.</li>
	<li>상업적인 단백질 염색 시 약으로 젤을 얼룩.</li>
</ol>8. MALDI TOF MS 분석 트립 신 소화
<ol><li>순화 된 GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL 또는 80 µ M) (w/v) SDS, 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 0.1%를 포함 하는 버퍼에 및 1 시간에 60 ° C에서 25 mM DTT의 100 µ L를 품 어.</li>
	<li>Iodoacetamide H2O (IAA, 4.0 M)의 1 µ L 추가 (500 equiv. GFP E90DOPA에) 동일한 버퍼에 순화 된 GFP E90DOPA 솔루션 (80 µ M). 빛 으로부터 보호 30 분 동안 25 ° C에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>트립 신 (1: 100 효소-기질 단백질 비율 [w/w])을 추가 하 여 GFP E90DOPA 샘플을 소화 하 고 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>C18 스핀 열 표준 염 메서드를 사용 하 여 소화 펩 티 드 샘플을 정화.</li>
	<li>매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MALDI TOF MS) 매트릭스23으로 알파-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA)를 사용 하 여에 대 한 보고 된 프로토콜에 의해 소화 펩 티 드를 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+hydroxylase%3A+The+initial+step+in+norepinephrine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).</li>
<li>Pinder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+dopamine+derivatives+capable+of+crossing+the+blood-brain+barrier+in+relation+to+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism.</a> Nature. 228 (5269), 358(1970).</li>
<li>Waite, J. H., Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenolic+substance+of+mytilus+edulis%3A+novel+adhesive+containing+L-DOPA+and+hydroxyproline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline.</a> Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).</li>
<li>Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanics+of+mussel+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanics of mussel adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).</li>
<li>Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyarginine-containing+polyphenolic+proteins+in+the+adhesive+plaques+of+the+marine+mussel+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).</li>
<li>Waite, J. H., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoprotein+from+the+adhesive+pads+of+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis.</a> Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).</li>
<li>Nicklisch, S. C., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+The+role+of+redox+in+DOPA-mediated+marine+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion.</a> Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).</li>
<li>Silverman, H. G., Roberto, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2100433/">Understanding marine mussel adhesion.</a> Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).</li>
<li>Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+adhesives+and+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired adhesives and coatings.</a> Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+cross-linking+with+genetically+incorporated+3%2C4-dihydroxy-L-phenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.</a> ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+approach+to+transform+low-affinity+peptides+into+protein+probes+with+cotranslationally+expressed+chemical+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker.</a> Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).</li>
<li>Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+non-canonical+amino+acid+design+to+covalently+crosslink+an+antibody-antigen+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex.</a> Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).</li>
<li>Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15366882">Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).</li>
<li>Borrmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+oxidation-controlled+cyclooctyne-1%2C2-quinone+cycloaddition+%28SPOCQ%29+for+fast+and+activatable+protein+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).</li>
<li>Ayyadurai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective%2C+sensitive%2C+and+reversible+biosensor+by+the+genetic+incorporation+of+a+metal-binding+site+into+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).</li>
<li>Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+protein+nanoparticles+containing+iron%28III%29-DOPA+complexes+for+pH-responsive+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).</li>
<li>Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+a+redox-active+amino+acid+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).</li>
<li>Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+L-dihydroxyphenylalanine+%28DOPA%29+biosynthesized+by+a+tyrosine+phenol-lyase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase.</a> Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Gobom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+affinity+sample+preparation.+A+protocol+for+MALDI-MS+peptide+analysis+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics.</a> Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).</li>
<li>Mukai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproductive+Escherichia+coli+cells+with+no+specific+assignment+to+the+UAG+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon.</a> Scientific Reports. 5, 9699(2015).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomically+recoded+organisms+expand+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomically recoded organisms expand biological functions.</a> Science. 342 (6156), 357-360 (2013).</li>
<li>Bryson, D. I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29035361">Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases.</a> Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).</li>
<li>Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+amber+suppressor+tRNAs+for+efficient+bacterial+production+of+proteins+containing+nonnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+strategy+for+selective+phosphoserine+incorporation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).</li>
<li>Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+multiple+unnatural+amino+acids+via+evolution+of+a+quadruplet-decoding+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome.</a> Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+reactions+for+labeling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal reactions for labeling proteins.</a> ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 생 합성 및 직접 설립 DOPA의 설명 되어 있습니다. 이 방법에 사용 되는 세균성 셀 추가 아미노산을 합성 하 고 단백질 합성에 대 한 부자연 스러운 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다. 부자연 스러운 아미노산의 유전자 결합 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 생물의 개발을 위한 핵심 기술 되었습니다. 그러나,이 메서드는 기술적으로 완료 되었습니다 하 고 관 효율을 향상 시키고 생 번역 시스템에 섭 동을 최소화 수정 되 고. 최근에, 방법에 상당한 진보가 codons24,25 부자연 스러운 아미노산 및 엔지니어링 직교 변환 구성 요소26,27,28 재할당 함으로써 달성 되었습니다. ,29</...

DOPA는 catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에 관련 된 아미노산 이다. 이 아미노산 티로신 hydroxylase 및 분자 산소 (O2)1에 의해 티 르에서 합성 됩니다. DOPA 도파민의 선구자 이며, 혈액-뇌 장벽 침투 수, 때문에 그것은2파 킨 슨 병 치료에 사용 되었습니다. DOPA 홍합 접착 단백질 (지도), 젖은 조건3,,45,,67에 홍합의 접착 속성에 대 한 책임은에 발견 된다. Tyr는 처음 DOPA 지도에서 발견 되는 tyrosinases8,9DOPA로 변환 됩니다 위치에 인코딩됩니다. 그것의 재미 있는 생 화 확 적인 특성 때문에 DOPA 다양 한 응용 프로그램에에서 사용 되었습니다. DOPA의 dihydroxyl 그룹은 화학적으로 산화, 경향이 그리고 아미노산 L-dopaquinone, melanins의 선구자로 쉽게 변환 됩니다. 그것의 높은 electrophilicity 때문에 L-dopaquinone와 그 파생 상품 가교 및 thiols 및 아민10,11,,1213와 활용에 대 한 사용 되었습니다. 1, 2-퀴 논 디 엔 cycloaddition 반응에 대 한 기능을 할 수 하 고 스트레인 승진 산화 제어 cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14bioconjugation에 대 한 사용 되었습니다. 또한, dihydroxyl 그룹 Fe3 + 와 Cu2 +같은 금속 이온을 킬레이트 수 고 DOPA를 포함 하는 단백질 약물 전달 및15,16을 감지 하는 금속 이온에 대 한 이용 되었습니다.
DOPA 유전자 단백질에는 직교 aminoacyl-tRNA (금주 모임-tRNA)와 aminoacyl-tRNA 합성 (aaRS) 쌍17 을 사용 하 여 통합 되었으며 사용 단백질 활용 및 가교10,11, 12,13. 이 보고서에서 실험 결과 프로토콜 DOPA biosynthesized 저렴 한 원자재와 bioconjugation 응용 프로그램에서의 유전 결합을 설명 합니다. DOPA biosynthesized TPL을 사용 하 고 catechol, pyruvate, 및 대장균에서 암모니아에서 출발 이다. DOPA biosynthesized DOPA에 대 한 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍으로 표현 하 여 단백질에 직접 통합 됩니다. 또한, 포함 된 DOPA biosynthesized 단백질 site-specifically 형광 프로브와 단백질 올리고 생산 가교 된 활용 된. 이 프로토콜와 단백질 생화학 프로브 또는 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 약물을 켤레 biosynthesize 돌연변이 단백질 DOPA 포함 된 단백질 과학자에 대 한 유용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 플라스미드 구조</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td><td></td><td></td><td>는 원하는 위치에 황색 정지 코돈(TAG)을 선택적으로 포함합니다. Ko, W. 외. Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition에 의한 효율적인 부위 특이적 항체 라벨링. 증권 시세 표시기. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>플라스미드 pEvol-DHPRS2</td><td></td><td></td><td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. 및 Schultz, P. G. E. coli의 부자연스러운 아미노산 돌연변이 유발에 대한 향상된 시스템. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. 티로신 페놀-리아제에 의해 생합성된 l-디하이드록시페닐알라닌(DOPA)의 유전자 통합. 화학. 코뮤니. 54 (24), 3002-3005, DOI: 10.1039/C8CC00281A (2018).</td></tr><tr><td>DH10&베타;</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>발현 호스트</td></tr><tr><td>플라스미드 미니 준비 키트</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>인트론 생명공학</td><td>32034</td><td>500g</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1g</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500g</td></tr><tr><td>2. 배양 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1) Electroporation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 펄서 큐벳</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1cm 전극 갭, 50</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25g</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25g</td></tr><tr><td>한</td><td>천 삼춘</td><td>214230</td><td>500g</td></tr><tr><td>SOC 매체</td><td>시그마</td><td>S1797</td><td>100mL</td></tr><tr><td><강한>3. 생합성 시스템에 의한 GFP-E90DOPA의 발현 및 정제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.1 생합성 시스템에 의한 GFP-E90DOPA의 발현</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100g</td></tr><tr><td>Pyrocatechol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1387</td><td>25g</td></tr><tr><td>황산암모늄, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0943</td><td>500 지</td></tr><tr><td>피루브산, 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13875</td><td>100g</td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성, 무수, 99%</td><td>삼천</td><td>S0891</td><td>1kg</td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성, 99%</td><td>삼천</td><td>P1127</td><td>1kg</td></tr><tr><td>황산마그네슘, 무수, 99%</td><td>삼천</td><td>M0146</td><td>1kg</td></tr><tr><td>D(+)-포도당, 무수, 99%</td><td>삼천</td><td>D0092</td><td>500g</td></tr><tr><td>글리세롤, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0269</td><td>1kg</td></tr><tr><td>미량 금속 믹스 a5 with co</td><td>Sigma</td><td>92949</td><td>25mL</td></tr><tr><td>L-프롤린, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1257</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-페닐알라닌, 98.5%</td> <td>SAMCHUN</td><td>P1982</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>JUNSEI</td><td>49550-0310</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-아르기닌, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1149</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-글루타민, 98%</td><td>JUNSEI</td><td>27340-0310</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-아스파라긴 일수화물, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1198</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>JUNSEI</td><td>73190-0410</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-히스티딘 염산염 일수화물, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0604</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-트레오닌, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T2938</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-류신</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td> 글리신 <td>25g</td></tr><tr>, <td>삼천</td><td>G0286</td><td>99%</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td> 25g, <td>삼천</td><td>G0233</td> L-알라닌 <td>25g</td></tr><tr><td>,</td> <td>삼천</td><td>A1543</td><td>25g</td></tr><tr><td>L-이소류신, 99%</td><td>삼천</td><td>I1049</td> L-발린 <td>25g</td></tr><tr><td>, 삼천 99%</td> <td>V0088</td> L<td></td>-<td></td></tr><tr><td>세린</td><td>삼천 25g</td><td>S2447</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>25g 삼춘</td><td>A1205</td> L<td></td></tr><tr><td>-라이신 모노하이드로클로라이드 25g, 99%</td><td>삼춘</td><td>L0592</td><td>25g</td></tr><tr><td><강>3.2 세포 용해</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미다졸, 99%</td><td>삼춘</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성, 98%</td><td>삼춘</td><td>S0919</td><td>1kg</td></tr><tr><td>염화나트륨, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1kg</td></tr><tr><td>초음파 프로세서 - 150마이크로리터 - 150</td>밀리리터 <td>SONIC & 재료</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>3.3 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 수지</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25mL</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 컬럼</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/pack, 1mL 용량</td></tr><tr><td>4. 정제된 GFP-E90DOPA의 올리고머화&nbsp; </강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소듐주기산염, 99.8&</td><td>아크로스</td><td>419610050</td><td>5 g</td></tr><tr><td>5. Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne&ndash에 의한 Alkyne 프로브와 GFP-E90DOPA의 접합; 1,2-퀴논 사이클로첨가(SPOCQ)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>퓨처켐</td><td>FC-6119</td><td>1mg</td></tr><tr><td>6. 라벨링된 GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5mL 원심 필터</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pack, 500ul 용량</td></tr><tr><td>7의 정제. SDS-PAGE 분석 및 형광 겔 스캐닝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 완충액, 4X</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES 러닝 버퍼</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE 겔</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 well</td></tr><tr><td>Coomassie 브릴리언트 블루 R-250</td><td>와코</td><td>031-17922</td><td>25g</td></tr><tr><td>G:BOX 케미 형광등 & 화학발광 이미징 시스템</td><td>Syngene</td><td></td><td>G BOX Chemi XT4</td></tr><tr><td>8. 트립신 분해에 의한 MALDI-TOF MS 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8.1 트립신 분해에 의한 분해된 펩타이드 시료의 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500g</td></tr><tr><td>염산, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500mL</td></tr><tr><td>도데실설페이트 나트륨염, 85%</td><td>SAMCHUN</td><td>D1070</td><td>250 g</td></tr><tr><td>요오드아세트아미드</td><td>시그마</td><td>I6125</td><td>5 g</td></tr><tr><td>트립신 프로테아제, MS 등급</td><td>Thermofisher</td><td>90057</td><td>5 x 20 &마이크로; g/pack</td></tr><tr><td>C-18 스핀 컬럼</td><td>Thermofisher</td><td>89870</td><td>25/pack, 200 &micro; L 용량</td></tr><tr><td>8.2 MALDI-TOF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirile, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0125</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma</td><td>C2020</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1666</td><td>100 g</td></tr><tr><td>MTP 384 타겟 플레이트 그라운드 스틸 BC 타겟</td><td>Bruker</td><td>8280784</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF 질량 분석기</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에는 아미노산 이다. 그것의 특정 생 화 확 적인 특성 때문에 아미노산 생화학 응용 프로그램에서 여러 사용 하고있다. 이 보고서 biosynthesized DOPA의 유전자 결합에 대 한 프로토콜 및 단백질 활용의 응용에 설명합니다. DOPA는 티로신 페 놀-lyase (TPL) catechol, pyruvate, 암모니아에서 의해 biosynthesized 이며 아미노산 진화 aminoacyl-tRNA와 aminoacyl-tRNA 합성 쌍을 사용 하 여 유전 결합 방법으로 단백질에 직접 통합 됩니다. 이 직접 설립 시스템 DOPA에 대 한 이전 유전 법인 시스템 보다 더 나은 단백질 수확량과 다른 천연 아미노산의 작은 합동 DOPA을 효율적으로 통합. DOPA 포함 된 단백질 단백질 활용 효율적이 고 사이트 이며 다양 한 응용 프로그램에 대 한 그것의 유용성을 보여줍니다. 이 프로토콜 단백질 과학자를 DOPA 원하는 사이트와 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 그들의 활용을 포함 하는 돌연변이 단백질의 효율적 생 합성에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다.

TPL에서 DOPA biosynthesized의 직접 통합 식 시스템은 그림 1에 표시 됩니다. 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍에 대 한 유전자를 플라스 미드에 배치 됩니다 위치 90에서 호박 codon를 포함 하는 GFP 유전자 (GFP-E90TAG) GFP 형광에 의해 DOPA의 평가에 다른 플라스 미드에 위치 하 고. TPL 유전자는 GFP 유전자를 포함 하는 동일한 식 플라스 미드에 배치 하 고 constitutively DOPA 생 합성의 수익률을 극대화 하기 위해 표현. 이 식 시스템을 사용 하 여, DOPA 생 합성에 대 한 최적의 조건은 상영 했다. 이 실험 포함 된 25mm 암모니아 및 100 mM pyruvate, catechol (0-10 m m)의 다양 한 농도와 사용 되는 성장 매체. Catechol 집중 했다 암모니아 그리고 pyruvate 농도 이상 25 m m와 100 m m, 동안 DO...

여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.

Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

이 방법은 단백질 변형, 결합 및 생합성 시스템과 같은 화학 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생합성 시스템을 사용하여 Tyr 단백질을 도입함으로써 L-DOPA를 특이적이고 효율적으로 인용할 수 있다는 점입니다. 발현 플라스미드를 구축한 후, 이 절차를 위해 전기천공 가능 E.coli DH10 beta strain 세포를 준비하십시오.각 플라스미드 DNA 1 µL를 컴피턴트 셀 20 µL에 첨가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 이 혼합물을 0.1 cm 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.시료가 채워진 큐벳을 전기천공 챔버에 넣고, 큐벳과 챔버가 단단히 접촉되었는지 확인합니다. 25 microfarad 및 2.4 kilovolts 조건에서 큐벳에 전기 충격을 줍니다. 그 후, 미리 데워둔 SOC 배지 1 milliliter를 첨가합니다.세포를 배양 튜브로 옮깁니다. 세포를 회복시키기 위해 37 °C에서 1시간 동안 흔들어 배양합니다. 회복된 세포 10~100 µL를 35 µg/mL chloramphenicol과 100 µg/mL ampicillin이 포함된 lysogeny broth agar 플레이트에 도말합니다.37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 그 후, 항생제가 포함된 5 mL의 LB 배지에 형질전환된 단일 콜로니를 접종하여 스타터 배양액을 준비합니다. 37 °C에서 12시간 동안 흔들어 배양합니다.클로람페니콜, 암피실린, 피루브산, 카테콜, 암모니아 및 디티오트레이톨이 포함된 PA-5052 배지 100 milliliters에 스타터 배양액 2 milliliters를 접종합니다. 30 degrees celsius에서 진탕 배양합니다. 550 nanometers에서의 광학 밀도가 0.8에 도달하면 20% L-arabinose 1 milliliter를 첨가합니다.시료를 30 °C에서 12시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 후, 세포를 11000 ×g에서 5분간 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 세포를 용해할 때까지 세포 펠릿을 -80 °C에서 냉동 보관합니다.준비가 되면, 얼음 위에서 세포 펠릿을 해동합니다. 해동된 세포를 monosodium phosphate, imidazole, sodium chloride가 포함된 용해 버퍼 10 milliliters에 재현탁합니다. 80% 초음파 처리 진폭으로 25초 작동 및 35초 정지 펄스를 사용하여, 재

genetic-incorporation-biosynthesized-l-dihydroxyphenylalanine-dopa

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

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Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

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여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

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백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

고전적 부위-지시된 돌연변이유발의 한계를 극복하기 위해, 특이적 변형을 갖는 프롤린 유사체를 몇몇 형광 단백질에 혼입시켰다. 우리는 수소를 불소로 대체하거나 프롤린 잔기의 이중 결합에 의한 단일 ( "분자 수술")이 접힘 및 빛과의 상호 작용을 포함한 근본적인 단백질 특성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

배우세요 L-DOPA의 생합성을 이용한 유전적 단백질 결합 방법을 E. coli에서. 이 기술은 화학생물학 연구에서 단백질 수정의 특이성과 효율성을 높여줍니다.

Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

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