Name: Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Leer hoe u het metabole profiel van primaire leukemiecellen beoordeelt met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en real-time fluxanalyse. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zouden graag bedanken de Tsjechische pediatrisch hematologie centra. Dit werk werd ondersteund door de subsidie van Ministerie van volksgezondheid (NV15-28848A), door het ministerie van gezondheid van het universitaire ziekenhuis Motol, Tsjechische Republiek, Praag, Tsjechische Republiek 00064203 en door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport Binengrenzen ik nr. LO1604.

Alle monsters werden verkregen met de informed consent van de ouders of de voogd van de kinderen en de goedkeuring van de ethische commissie van de Karelsuniversiteit in Praag, Tsjechische Republiek, de studie geen. NV15-28848A.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>500 mL PBS voor te bereiden door het oplossen van 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM nb2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, in ddH2O. aanpassen, de pH aan 7.4 met HCl. Sterilize in autoclaaf.</li>
	<li>100 mL RPMI voedingsbodem voor te bereiden: RPMI-1640 medium met L-Alanyl-Glutamine aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL).</li>
	<li>Bereiden van 50 mL 0,1 M NaHCO3 in gedestilleerd water. Breng de pH op 8.1, filter steriliseren (0.22 μm) en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: Voor twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen, bereiden 250 μL van 0,1 M NaHCO3 pH 8.1.</li>
	<li>Bereiden 1 mL 2 M D-glucose in gedestilleerd water. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>100 μl van 1 mM Oligomycin A in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>Bereiden 250 μL van 1 M 2-deoxy-D-glucose (2-DG) in minimale DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's medium). Warm tot 37 ° C en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C). Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>Bereiden 100 μl van 1 mM FCCP (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) in DMSO. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>100 μl van 1 mM rotenon in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>100 μl van 1 mg/mL Antimycin A in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
	<li>Vlak voor het gebruik, door 10 mL glycolyse stress testmedium te bereiden. Minimale DMEM warm tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C).</li>
	<li>Voorafgaand aan het gebruik, door 10 mL van cel Mito stress testmedium met BSA te bereiden. Minimale DMEM te vullen met 2 mM L-glutamine, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvaat en 0,1% BSA (bovien serumalbumine). Warm tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C).</li>
	<li>Voorafgaand aan het gebruik, door 10 mL van cel Mito stress testmedium zonder BSA te bereiden. Minimale DMEM aan te vullen met 2 mM L-glutamine, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7.4) en 1 mM pyruvaat. Warm cel Mito stress testmedium zonder BSA tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C). Opmerking: BSA wordt toegevoegd aan het testmedium cel Mito stress omdat de cellen beter te op FCCP reageren wanneer het medium wordt aangevuld met BSA (verschillende omstandigheden werden getest). Cel Mito stress testmedium zonder BSA wordt gebruikt voor het laden van de havens, zoals de fabrikant raadt niet met behulp van BSA in het medium.</li>
</ol>2. isolatie van mononucleaire cellen uit het beenmerg
Opmerking: in het ideale geval meting van metabolische toestand van primaire leukemie cellen beginnen onmiddellijk na het beenmerg collectie en cel isolatie. Toch kunnen relevante gegevens ook worden verkregen uit cellen geïsoleerd na vervoer vanaf andere hematologie centra in de Tsjechische Republiek. Voer alle substappen in een steriele weefselkweek kap.
<ol><li>Opwarmen van PBS en het medium dichtheid verloop tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun het beenmerg monster van leukemie patiënt met PBS, in een verhouding van 1:1. Zorg ervoor dat het monster ten minste 80% van de ontploffingen van de leukemische bevat.</li>
	<li>Bepaal het percentage van de ontploffing door cytometry van de stroom met behulp van specifieke CD pennen voor immunophenotype-karakterisatie van celtypes. Na dichtheid verlopende scheiding, detecteren nucleïnezuur positieve gebeurtenissen met een nucleaire kleurstof teneinde de totale telling van de cel.</li>
	<li>Vervolgens bepalen leukemie cellen met behulp van specifieke CD pennen voor elk type van leukemie: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3 CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) en AML (CD45, CD33 en specifieke myeloïde markers)24. Verdeel het aantal leukemie cellen positief voor specifieke CD pennen door alle nucleaire cellen om te bepalen van het percentage van leukemie blast cellen. Opmerking: Het beenmerg moet worden verzameld in de buizen met anticoagulantia.</li>
	<li>Zorgvuldig laag 6 mL verdunde beenmerg monster meer dan 6 mL van het medium dichtheid kleurovergang in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 35 min bij 4 ° C in een swingende-emmer rotor zonder de rem. Opmerking: Groter volume van het monster kan worden verdeeld in meer aliquots of conische tube van 50 mL kan worden gebruikt met de grotere hoeveelheid kleurovergang medium dichtheid.</li>
	<li>Met behulp van een pipet van Pasteur, zorgvuldig overbrengen in de interfase laag die uit mononucleaire cellen (Figuur 1 bestaat) een nieuwe conische tube van 50 mL met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een swingende-emmer rotor. Opmerking: Breng alle mononucleaire cel lagen in een conische buis van één 50 mL met 5 mL PBS.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL steriele PBS. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Opmerking: Het aantal leukemie cellen in één mL beenmerg opgezogen verschilt sterk tussen patiënten25.</li>
</ol>3. 's nachts teelt van mononucleaire cellen
Opmerking: Alle substappen in een steriele weefselkweek kap uitvoeren.
<ol><li>Twee T75 flacons met 20 mL RPMI voor te bereiden. Voeg aan elke maatkolf, 30 x 106 geïsoleerde mononucleaire cellen. Incubeer de cellen met de kolf opkomen voor 16-24 h bij 5% CO2 en 37 ° C.</li>
</ol>4. voorbereiding van de cel lijm beklede platen
<ol><li>Jas twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen. Opmerking: Voer de coating in een steriele weefselkweek kap.</li>
	<li>Toevoegen van 2.2 μL van cel lijm (dichtheid: 2.54 mg/ml) tot 250 μL van 0,1 M NaHCO3, pH 8.1 en Pipetteer onmiddellijk 12,5 μL van de oplossing in elk putje. Opmerking: Zelfklevende stamoplossingen van de cel kan verschillen in hun dichtheid, het volume toegevoegd aan NaHCO3 dienovereenkomstig aanpassen.</li>
	<li>Laat de platen zitten in de kap voor ongeveer 20 min, vervolgens de cel lijm gecombineerd en elkaar goed tweemaal met 200 μL van steriel water wassen. Laat het zitten in de kap met het deksel open totdat putten droog zijn.</li>
	<li>De platen meteen gebruiken of opslaan van maximaal 1 week bij 4 ° C met de velg verpakt in paraffine film om condensatie te voorkomen. Ervoor zorgen dat de platen zijn opgewarmd tot kamertemperatuur (voor ongeveer 20 min) in de kap voor het zaaien van de cellen.</li>
</ol>5. hydratatie van Sensor Cartridge
Opmerking: Hydraat twee 8-well extracellulaire flux analyzer cartridges.
<ol><li>Scheid de hulpprogramma-plaat- en de sensor cartridge. Plaats de sensor cartridge ondersteboven op de lab-Bank.</li>
	<li>Vul elk goed van de utility plaat met 200 μl kalibrant. Vul elke gracht rond de buitenkant van de putjes met 400 μL van kalibrant.</li>
	<li>Retourneer de cartridges van de sensor naar de hulpprogramma-plaat waarin nu de kalibrant.</li>
	<li>Plaats de cartridge-vergadering in een bevochtigde, niet-CO2, 37 ° C incubator's nachts.</li>
	<li>Zet op de extracellulaire flux analyzer en laat deze warm tot 37 ° C's nachts.</li>
</ol>6. zaaien van de cellen in cel lijm beklede platen
Opmerking: Gebruik voor stresstest glycolyse, glycolyse stress testmedium. Voor cel Mito stresstest, gebruikt u cel Mito stress testmedium met BSA.
<ol><li>De cellen van het zaad voor de glycolyse stress-test en de stresstest cel Mito in afzonderlijke platen. Voor elke test, door cellen te gebruiken uit een kolf met overnachting cultuur.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1 mL van het juiste medium, en ze tellen.</li>
	<li>4 x 10,6 van levende cellen aan het eindvolume van 400 μL (gebruik geschikte voedingsbodem) toevoegen.</li>
	<li>Typeplaatje 50 μl van de celsuspensie in putten B-G. Zorgen voor 500.000 cellen worden overgeënt in een put. Opmerking: Het is cruciaal om het zonebeheer van precies 500.000 cellen per putje als geen andere normalisatie wordt uitgevoerd. Op die manier kunnen de resultaten van verschillende patiënten worden vergeleken. Het optimale aantal replicatieonderzoeken is zes, zoals hier is beschreven. Met behulp van minder replicatieonderzoeken wordt niet aanbevolen aangezien primaire cellen kan soms ten onrechte gedragen.</li>
	<li>Voeg 180 μL van de geschikte voedingsbodem in putten A en H (deze putten zal dienen als een achtergrondcorrectie).</li>
	<li>Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met rem ingesteld op 1.</li>
	<li>Voeg 130 μL van geschikte voedingsbodem toe aan putjes B-G in twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen langzaam en zorgvuldig. Visueel bevestigen dat de cellen zijn stabiel gehandeld naar de onderkant van de putten door bekijken onder de Microscoop.</li>
	<li>Plaats de plaat in een bevochtigde, niet-CO2, 37 ° C incubator voor 30 min.</li>
</ol>7. veilig laden van de Sensor-Cartridge
<ol><li>Voorbereiden voor de glycolyse stress-test, 250 μL elk van 100 mM glucose, 20 μM Oligomycin A en 1 M 2-DG, allemaal in de glycolyse stress testmedium.</li>
	<li>Voor de cel Mito stress-test, bereiden 250 μL elk van 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP en een mengsel van 10 μM rotenon en 10 μg/ml Antimycin A, allemaal in de cel Mito stress testmedium zonder BSA. Opmerking: Injecteren van twee concentraties van FCCP in één bepaling wordt aanbevolen omdat er niet genoeg patiënten materiaal bij de titratie met FCCP. Niettemin, moeten de concentraties worden bepaald door de onderzoeker.</li>
	<li>De stoffen in de passende injector-poorten van de cartridge als volgt (tabel 1) laden:</li>
</ol>8. het opzetten van het programma
<ol><li>Voor de glycolyse stress-test, ingesteld zoals beschreven in tabel 2.</li>
	<li>Voor de cel Mito stress-test, instellen het programma zoals beschreven in tabel 3.</li>
	<li>Start het programma. De plaat kalibrant wordt vervangen door de assay plaat (indien gevraagd).</li>
</ol>9. evaluatie en interpretatie van de resultaten
<ol><li>Aftrekken in de glycolyse stress testresultaten, de laagste waarde van de ECAR na 2-DG injectie van alle andere ECAR waarden. Opmerking: Deze laagste waarde vertegenwoordigt de niet-glycolytic verzuring. Meestal is de laagste waarde van de 4th -meting.</li>
	<li>Bereken basale verzuring, glycolyse, maximale glycolyse en Glycolytic reserve parameters van glycolytic functie (figuur 2A). Na de laagste ECAR-waarde af te trekken, basale verzuring te berekenen als een gemiddelde van ECAR uit de eerste drie meetpunten (weglaten de eerste ECAR waarde indien deze aanzienlijk van de andere twee verschilt), berekenen glycolyse als een gemiddelde van ECAR drie metingen wijst na injectie van glucose en berekenen van maximale glycolyse als een gemiddelde van ECAR drie metingen na Oligomycin een injectie punten. Berekenen Glycolytic reserve als maximale glycolyse minus glycolyse. Opmerking: Als alternatief voor de berekening van de maximale glycolyse, gebruiken de hoogste ECAR waarde van de drie punten gemeten.</li>
	<li>Aftrekken in de cel Mito stress testresultaten, de laagste waarde van de OCR na rotenon/Antimycin A injectie van alle andere OCR-waarden.</li>
	<li>Bereken basale ademhaling, de productie van ATP, maximale ademhaling en reservecapaciteit parameters van mitochondriale functie (figuur 2B). Na de laagste OCR-waarde af te trekken, basale ademhaling als een gemiddelde voor OCR uit de eerste drie meetpunten te berekenen. Opmerking: Maximale ademhaling is de hoogste waarde van de OCR na FCCP injectie.</li>
	<li>Aftrekken voor ATP productie berekening, het gemiddelde van de drie OCR-meetpunten na Oligomycin A injectie uit basale ademhaling. Bereken reservecapaciteit als de maximale ademhaling minus de basale ademhaling. Opmerking: Berekenen altijd de maximale ademhaling van de hoogste waarde van de OCR, ongeacht de concentratie van de FCCP gebruikt.</li>
</ol>

<ol><li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Cancer%3A+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li>
<li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Reprogramming%3A+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li>
<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li>
<li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+addiction%3A+a+new+therapeutic+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Metabolism%3A+Cancer%27s+Achilles%27+Heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li>
<li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807(2015).</li>
<li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li>
<li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li>
<li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+%28FAO%29+controls+endothelial+cell+%28EC%29+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li>
<li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286(2015).</li>
<li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li>
<li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP%2FADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li>
<li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li>
<li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li>
<li>Lee, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+%28AMPK%29+activator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li>
<li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-451+Regulates+LKB1%2FAMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li>
<li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent%2C+CPI-613%2C+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li>
<li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2%2FEFhd1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li>
<li>Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li>
<li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow%3A+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hierboven beschreven protocol voorziet in het meten van de metabole activiteit beoordeeld door OCR en ECAR waarden in de primaire leukemische ontploffing afgeleid van patiënten met acute lymfatische leukemie (ALL) of acute myeloïde leukemie (AML). Het voordeel van de meting met behulp van een extracellulaire flux analyzer is dat hierdoor de detectie van metabole profiel in de real time in de levende cellen. In wezen, elke stap in het meegeleverde protocol kan worden aangepast afhankelijk van het celtype een plan om t...

De metabole profiel is een van de belangrijkste kenmerken van cellen en veranderde Bioenergetica zijn nu beschouwd als één van de kenmerken van de kanker1,2,3. Bovendien, wijzigingen in de metabole setup kunnen worden gebruikt in de behandeling van kanker door zich te richten signaaltransductie trajecten of enzymatische machines van kanker cellen,4,,5,6. Kennen van de metabole aanleg van kankercellen is dus een voordeel en kan helpen bij het verbeteren van de huidige therapie.
Er zijn een overvloed van reeds gevestigde methoden die van de metabole activiteit van cellen in cultuur beoordelen kunnen. Met betrekking tot de glycolyse, glucose-opname kan worden gemeten door de radioactieve labeling, met 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) of extracellulaire lactaat niveaus gemeten enzymatisch7,8. Vetzuur oxidatie tarief is een andere metabole parameter gemeten door ionenpaar gelabelde palmitaat9,10. Zuurstof verbruik tarief is een methode die veel gebruikte voor het bepalen van de mitochondriale activiteit in cellen11,12, samen met de mitochondriale membraan potentiële evaluatie13,14, ATP/ADP (adenosine 5 '-trifosfaat/5 '-adenosinedifosfaat) ratio meting15 of totaal intracellulaire ATP meting16. Signalering van trajecten bekend te reguleren metabole processen kan worden bepaald door eiwitten ondermeer en kan verbetering van het inzicht van metabole metingen17,18,19.
Echter, al deze methoden meten slechts één of, in het beste geval, een paar metabole parameters in een proeven gelijktijdig. Nog belangrijker is, kan gelijktijdige meting van de zuurstof verbruik tarief (OCR) en de extracellulaire verzuring tarief (ECAR) worden bereikt door de extracellulaire flux-analyse door, bijvoorbeeld, Seahorse XFp Analyzer. OCR is een indicator van de mitochondriale ademhaling en ECAR is vooral het gevolg van glycolyse (we niet voorbijgaan aan CO2 productie mogelijk verheffen ECAR van cellen met hoge oxidatieve fosforylatie activiteit)20. Tot nu toe zijn verschillende celtypes bestudeerd met behulp van deze analysers21,22,23.
Hier beschrijven we het protocol voor de analyse van de extracellulaire flux van primaire ontploffingen (leukemie-cellen afgeleid van de onrijpe hematopoietische fase) van leukemie-patiënten. Tot de beste van onze kennis nog een specifiek protocol voor primaire ontploffing niet beschikbaar.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Biosera</td><td>FB-1001/100</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimyoticum (100x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-1G</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A van Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>103193-100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine oplossing, 200 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES oplossing, 1 M, pH 7,0-7,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Dichtheidsgradientmedium</td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; Cell-Tak Cel- en Weefselkleefmiddel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse Analyzer XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7802A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp Celcultuur Miniplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de metabole profiel van primaire leukemie cellen

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

De metabole eis van kankercellen kan negatieve invloed hebben op overleving en doeltreffendheid van de behandeling. Tegenwoordig, wordt farmaceutische targeting van metabolische routes getest in vele soorten tumoren. Karakterisering van kanker cel metabole setup is dus onvermijdelijk om te richten het juiste traject ter verbetering van de algehele uitkomst van patiënten. Helaas, in de meeste vormen van kanker, de kwaadaardige cellen zijn vrij moeilijk is te verkrijgen in hogere aantallen en de biopsie van weefsel is vereist. Leukemie is een uitzondering, waar een voldoende aantal leukemische cellen kan worden geïsoleerd uit het beenmerg. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en latere analyse van hun metabolische staat die gebruik maakt van extracellulaire flux analyzer. Leukemische cellen zijn geïsoleerd door het verloop van de dichtheid, die heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. De volgende stap van de teelt helpt hen om te regenereren, dus de metabole gemeten is staat de cellen in optimale omstandigheden. Dit protocol staat consistente, goed gestandaardiseerde resultaten, die kunnen worden gebruikt voor de gepersonaliseerde therapie te bereiken.

Figuur 3 toont de bochten na de glycolyse stresstest en cel Mito stresstest metingen van leukemische ontploffing van de BCP-ALL (B-cel voorloper acute lymfatische leukemie) en AML (acute myeloïde leukemie) patiënten. De berekening van de metabole parameters van deze metingen wordt ook aangegeven. 500.000 cellen per well zijn overgeënt en alle metingen werden gedaan in hexaplicates.
In de glycolyse s...

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en analyse van hun metabolische staat. Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen zou kunnen bijdragen tot het beter karakteriseren de vraag van primaire cellen en omhoog zou kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde geneeskunde.

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot metabole route setup in leukemie cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt meting van het metabolisme van primaire leukemie cellen in real time in levende cellen. Begin met het verdunnen van een beenmergmonster verkregen van een leukemiepatiënt in PBS met een verhouding van één op één.Voorzichtig, laag zes milliliter van het verdunde beenmerg monster meer dan zes milliliter van vers bereide dichtheid gradiënt medium in een 15 milliliter conische buis en scheiden de cellen door dichtheid gradiënt centrifugatie. Gebruik een Pasteur pipet om de interfacelaag van mononucleaire cellen zorgvuldig over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter conische buis met vijf milliliter PBS voor een centrifugatiewas. Vervolgens, resuspend de mononucleaire cel pellet in twee milliliter steriele PBS voor het tellen.Verdun de cellen tot een drie keer 10 tot de zeven cellen per milliliter concentratie. En voeg een milliliter cellen toe aan elk van de twee T75-kolven met 20 milliliter RPMI-medium voor een incubatie van 16 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Voeg ondertussen

assessment-of-the-metabolic-profile-of-primary-leukemia-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Het huidige rapport vat een protocol samen dat kan worden gebruikt om de invloed van de beenmerg-micro-omgevingsniche op leukemiecellen te modelleren, met nadruk op de verrijking van de meest chemoresistente subpopulatie.

Modeling Chemotherapie Resistant Leukemie<em&gt; In Vitro</em

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type witte bloedcellen. Hier worden de isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed door middel van dichtheidsgradiëntscheiding en de differentiatie van menselijke promyelocytische (HL60) cellen langs de granulocytische route beschreven; om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor anti-lymfoom middelen te testen.

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare methode die gebruik maakt van omgekeerde fase hoge-prestatievloeistofchromatografie (RP-HPLC) om het purine metabolisme te meten op cellen van chronische lymfatische leukemie (CLL) die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt.

-HPLC gebaseerde test voor Monitor extracellulaire Nucleotide / Nucleoside Metabolism in Human Chronische Lymfatische Leukemie Cellen

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Dit protocol beschrijft een procedure voor het induceren van differentiatie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen afkomstig van het beenmerg en perifere bloed mononucleaire cellen. De assay gebruikt een halfvaste kweekmedium ter ondersteuning van erythroïde en myeloïde lijnbinding en bevat gestandaardiseerde metrics voor reproduceerbare kolonieclassificatie voor preklinische geneesmiddelkarakterisering.

Colony-Forming Unit assay aangepast voor door patiënten afgeleide beenmerg- en perifere bloedmononucleaire cellen

Leer hoe u het metabole profiel van primaire leukemiecellen beoordeelt met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en real-time fluxanalyse. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandelingen.

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

Meer video's verkennen