Biology
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ゼブラフィッシュ稚魚を用いた消化管通過時間の高スループット測定
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Summary October 23rd, 2018
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このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。
Transcript
この方法は、遺伝子発現の変化や環境上の課題が腸機能をどのように変化させるかなど、胃腸生物学に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、それがより少ない時間を要し、腸の通過を測定する従来の方法よりも実行しやすいということです。アッセイの日には、幼虫は蛍光標識を含む食品を与えられ、その食べ物を食べると、そのラベルは腸内に蓄積します。
餌を与えた後、彼らは食べられない食べ物から分離され、各幼虫はマルチウェルプレートの井戸に移されます。井戸は円錐形の底を持っているので、便が無効になると井戸の中心に落ちる。今覚えておいてください、マルチウェルプレートには、空隙物質の量を測定するプレート分光光度計を使用して同時に監視できる多くの幼虫があります。
そして、時間の経過とともにより多くの値が無効になるにつれて、信号はこれに応じて増加します。このように、我々は、腸通過を測定するための高スループット方法を有する。受精後4日目には、各ペトリ皿の水の上に粉末の幼虫魚の食べ物を2ミリグラム振りかけ、幼虫に餌を与えます。
幼虫に餌を与える4時間を許可します。給餌後、すべての幼虫を新鮮な胚培地を含む大きなすすい皿に移します。50ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、残った食べ物をできるだけ穏やかに掃除し、幼虫を捕獲しないように注意してください。
幼虫を新鮮な胚培地の50ミリリットルを含む新しいペトリ皿に移す。さらに2日間、給餌、すすい、移し換えのプロセスを繰り返します。受精後6日目に、10センチの時計ガラスに200ミリグラムの乾燥食品を加えて蛍光食品の準備を始めます。
蛍光標識300マイクロリットルと100マイクロリットルの脱イオン水を加え、簡単に混ぜます。得られたペーストを時計ガラスの薄い層に広げ、室温、暗闇の中、少なくとも8時間乾燥させます。この後、乾燥した混合物を時計ガラスから削り取ります。
粉につぶし、暗闇の中で、室温で保存します。受精後7日目に、各ペトリ皿の水の上に2ミリグラムを振りかけ、蛍光食品を幼虫に供給します。幼虫に2時間の餌を与えさせる。
一方、各試験化合物を胚培地に溶解し、最終容積が少なくとも2.5ミリリットルの目標用量の2倍となる濃度に溶解して濃縮投与液を調製する。給餌期間の終わりに、転送ピペットを使用して大きなすすい皿に移動します。以前に説明したすべての幼虫を、より厳格な真空ですすいます。
残った蛍光食品を、96ウェルプレートに誤って移す可能性を減らすために、最終リンスの間にできるだけ多くの蛍光食品を取り除くことを重要です。各幼虫がすすがされた後、ピペットを使用して、リンス皿から100マイクロリットルの胚培地と一緒にそれを引き出した。幼虫と100マイクロリットルの培地全体を96ウェルポリスチレン、円錐底、マルチウェルプレートの井戸に分配します。
すべての幼虫が移送されたら、調製した添加液の100マイクロリットルを適切な井戸に加えます。すべての投剤溶液を添加した後、プレートをプレート分光光度計にロードします。プレートを振らずに、プレートの下から5回連続して測定します。
各ウェルからの最も低い読み取り値は、データ分析中に初期蛍光として指定されます。約28°Cでプレートをインキュベートします。測定プロセスを繰り返し、最初の2時間の20分ごとに蛍光を読み取り、読み取り間のインキュベートを行います。
3時間目と4時間目の3時間目の蛍光を30分ごとに測定し、5時間から8時間の時間単位で測定します。幼虫を一晩摂氏28度でインキュベートする。翌日、24時間の後の蛍光を読み込みます。
このプロトコルは、プレートベースの分光光度測定を使用して、蛍光顕微鏡のハイスループット置換としてGIトランジットを評価します。これら2つの方法を比較した代表的な結果は、24時間の投与後に同じ処理魚を分析することによって生成される。ここで見られるように、結果は、顕微鏡検査が保持された蛍光信号を測定し、分光光度測定が送信された信号を測定するので、負の斜面と、非常に相関している。
異なるメカニズムを有する化合物の分析は、車両処理制御と比較すると、アトロピンおよびアミトリプチリンは遅いGIトランジットを行うことを明らかにする。一方、テガセロッドとメトクロプラミドは、通過時間を加速させると見られる。哺乳類の反応に基づいて通過時間を加速すると予想されていたエリスロマイシンは、代わりにシマウマの魚の輸送時間に影響を与えないと見られる。
さらなる分析は、アトロピンがシマウマの魚の幼虫で、依存してGIトランジットを遅くすることを示しています。試験された最も低い用量は、042マイクロモル、有意な効果を有さなかった。2つの高用量は、それぞれ重大な影響を持っていると見られる間.
この方法は、薬物または薬剤候補からの毒性GI効果の検出、過敏性腸症候群などの疾患モデリング、そのような疾患に対する新規治療法の発見、ならびにプロキネティック化合物の発見を含む多くの用途を有する。
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