Genetics
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संयंत्र विकास और एग्रोबेक्टीरियम-Extremophyte Schrenkiella parvula की मध्यस्थता पुष्प डुबकी परिवर्तन
Summary January 7th, 2019
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एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन एक पुष्प डुबकी विधि का उपयोग सफलतापूर्वक extremophyte मॉडल Schrenkiella parvulaके स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों बनाने के लिए नियोजित किया जा सकता है । हम एक Arabidopsis थालियानाके लिए है कि से संशोधित प्रोटोकॉल मौजूद, विभिंन विकास की आदतों और extremophyte की शारीरिक विशेषताओं पर विचार ।
Transcript
यह विधि, श्रेंकिएला परवुला के लिए एक प्रजनन योग्य परिवर्तन प्रोटोकॉल, पौधों की तुलनात्मक और कार्यात्मक जीनोमिंग के क्षेत्र में सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, विशेष रूप से कठोर वातावरण के लिए पौधे अनुकूलन की जांच करने वाले अध्ययन। यह तकनीक मल्टी आयन नमक तनावों के अनुकूल एक्सट्रीमोफिट पर श्रेनकिएला परवुला में नियमित कार्यों की जांच को सक्षम बनाती है। यह तुलनात्मक अध्ययनों को भी सक्षम बनाता है जो अपने करीबी रिश्तेदार, मां के माता-पिता अरिबिडोसिस थलियाना को भी देखता है।
श्रेंकिएला परवुला की तुलना अरिबिडोसिस थलियाना के साथ करने से जीन विनियमन और कार्य में विचरण में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है जो श्रेंकिएला परवुला के अद्वितीय अनुकूलन को सक्षम करती है। अरबीडोप्सिस थलियाना के लिए परिवर्तन प्रोटोकॉल पहले से ही अच्छी तरह से स्थापित किया गया है । विधि अब ट्रांसजेनिक श्रेंकिएला परवुला पौधों का उपयोग करके तुलनात्मक अध्ययन करने में सक्षम बनाती है।
आम तौर पर शोधकर्ताओं ने इस विधि के लिए नए क्योंकि फूल की आदत और Schrenkiella Parvula पौधों की पत्ती आकृति विज्ञान जो प्रभावी परिवर्तन एक वनस्पति डुबकी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सच ट्रांसफॉर्मेंट के चयन का उपयोग कर मुश्किल संघर्ष करेंगे । शुरू करने के लिए, गीली मिट्टी पर लगभग 20 से 25 एस. पार्वुला बीज स्थानांतरित करने के लिए गीले टूथपिक का उपयोग करें। फिर पांच से सात दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर बीज स्तरित करें।
स्तरीकरण के बाद बीजों को सात से 10 दिनों के लिए ग्रोथ चैंबर में वापस कर दें। एक बार जब सभी रोपण अंकुरित हो जाते हैं, तो चार कोनों में से प्रत्येक में और बर्तनों के केंद्र में केवल एक अंकुर छोड़ दें। विकास कक्ष में आठ से 10 सप्ताह के लिए पौधों को उगाएं जब तक कि वे फूल न जाएं।
परिवर्तन के दिन, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार एस परवुला पौधों का चयन करें। पहले से ही सिलिक्स में विकसित हो रहे किसी भी परागण इनफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए संदंश और छोटी कैंची का उपयोग करें। पौधे तैयार होने के बाद एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ का समाधान तैयार करें।
इसके बाद एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ के घोल में एस परवुला इनफ्लोरेसेंस को 20 सेकंड के लिए डुबोएं। यहां दिखाया गया पौधों का शुरुआती चरण है जिसका उपयोग परिवर्तन के लिए किया जा सकता है, जब तक कि पहले से विकसित सिलिक्स को परिवर्तन से पहले हटा दिया जाता है, तब तक अधिक फूलों वाले पुराने पौधों का उपयोग किया जा सकता है। परिवर्तन के बाद, पौधों को कवर करने के लिए गुंबदों के साथ साफ ट्रे में क्षैतिज रूप से फूल डूबा हुआ पौधे रखें।
फिर पौधों को एक से दो दिनों तक अंधेरे विकास कक्ष में रखें। पौधों को एक ईमानदार स्थिति में लौटाें और उन्हें विकास कक्ष में स्थानांतरित करें। अगले सप्ताह में, डूबा हुआ फूलों की निगरानी करें।
पहले पुष्प डुबकी के दस दिन बाद, एस परवुला पौधे नए फूलों और सिलिक्स का उत्पादन करते रहेंगे । नए उभरते फूलों को और बदलने के लिए पुष्प डुबकी का दूसरा दौर किया जा सकता है। बीज परिपक्व होने तक पौधों को उगाएं, और 21 सप्ताह के आसपास बीजों की कटाई करें।
एक एयरटाइट कंटेनर में कमरे के तापमान पर दो से तीन सप्ताह के लिए बीज सूखी। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार टी वन सीड्स लगाएं। पौधों को तब तक उगाएं जब तक कि पहले दो से तीन सच्ची पत्तियां विकसित न हो जाए।
शाकनाशी प्रतिरोध के लिए पहला चयन करने के लिए, ग्लूफोसिनेट अमोनियम शाकनाशी को पतला करें और इसे रोपण पर स्प्रे करें। रात भर गुंबदों के साथ रोपण को कवर करें। ट्रे को विकास कक्ष में वापस रखें, और गुंबद को हटा दें।
जब तक अधिकांश रोपण शाकनाशी द्वारा चुने जाते हैं तब तक प्रतीक्षा करें। दूसरा चयन शुरू करने के लिए, उन पौधों की पहचान करें जो बास्टा समाधान के साथ तीन से चार बार छिड़काव करने के बाद जीवित रहते हैं। दो से तीन सप्ताह तक पौधों को उगाने के बाद, प्रत्येक पौधे पर सबसे बड़े परिपक्व पत्ते का चयन करें।
इसके बाद मोम की परत को हटाने के लिए पत्ती की सतह को उंगली से धीरे-धीरे रगड़ें। फिर पत्ते पर पतला बस्ता समाधान की एक बूंद रखें। एक सप्ताह तक मुरझाने के संकेतों के लिए बस्ता समाधान के साथ इलाज की पत्तियों की निगरानी करें।
अंत में आगे के विश्लेषण के लिए BASTA बूंदों से अप्रभावित पत्तियों के साथ पौधों का चयन करें । इस प्रोटोकॉल में, एस परवुला को पुष्प डुबकी विधि का उपयोग करके एग्रोबैक्टीरियम के साथ बदल दिया गया था। एग्रोबैक्टीरियम के साथ संक्रमण के परिणामस्वरूप कुछ फूलों का गर्भपात हुआ।
हालांकि एस. परवुला पौधों ने पहले फूलों की सूई के बाद नए फूलों का उत्पादन जारी रखा, और फिर से बदल दिया जा सकता है। बस्ता स्प्रे और ड्रॉप परीक्षणों का उपयोग करके, सच्चे सकारात्मक ट्रांसफॉर्मेंट की सटीक पहचान की जा सकती है। पीसीआर कन्फर्मेशन का इस्तेमाल कर जांचे गए नमूनों की संख्या को कम किया जा सकता है।
हालांकि यह विधि अरबीडोप्सिस थैलियाना के परिवर्तन के समान है, लेकिन श्रेंकिएला परवला के विकास और आकृति विज्ञान में अंतर को याद रखना महत्वपूर्ण है। इन मतभेदों को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित करना सफल परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है । यह तकनीक शोधकर्ताओं को जीनोमिक विविधताओं के विकास का पता लगाने में मदद कर सकती है जिससे एक्सट्रीमोफिट मॉडल, श्रेनकिएला परवुला में कई नमक तनाव अनुकूलन होते हैं।
इस तकनीक को अराडोप्सिस थलियाना के कार्यों के बारे में जानकारी के साथ संयोजन, एक और संयंत्र जो श्रेनकिला परवला से निकटता से संबंधित है। शोधकर्ता नियमन और कार्यों में भिन्नता का अध्ययन कर सकते हैं कि ये इन दो प्रजातियों के बीच दो अलग संरचनाएं हैं। परिवर्तन प्रक्रिया के दौरान, ऑटोक्लेवे कंटेनरों में सभी एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ समाधान को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है।
दस्ताने, मैक्रो पिपेट टिप्स और पेपर टॉवेल सहित एग्रोबैक्टीरियम के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को स्टरलाइज और सुरक्षित रूप से त्याग दें।
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