צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

שיטה זו, פרוטוקול טרנספורמציה לשחזור עבור Parvula Schrenkiella, יכול לעזור לענות על שאלות בתחום הגנום השוואתי ותפקודי של צמחים, במיוחד מחקרים החוקרים התאמות צמחים לסביבות קשות. טכניקה זו מאפשרת חקירות של תפקודים שגרתיים ב Parvula Schrenkiella על extremophyte מותאם לחצים מלח רב יון. הוא גם מאפשר מחקרים השוואתיים אשר גם מסתכל קרוב משפחה שלה, ההורה האם Aribidopsis Thaliana.

השוואת שרנקיאלה פרבולה לארבידופסיס תאליאנה יכולה לספק תובנות על שונות בוויסות גנים ותפקוד המאפשרים התאמה ייחודית של פרבולה שרנקילה. פרוטוקול השינוי של ערבידופסיס תאליאנה כבר היה מבוסס היטב. השיטה מאפשרת כיום מחקרים השוואתיים באמצעות צמחי שרנקיאלה פרבולה מהודרים.

בדרך כלל חוקרים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הרגל הפריחה ומורפולוגיה עלה של צמחים Schrenkiella Parvula אשר עושים טרנספורמציה יעילה באמצעות מטבל פלורה, כמו גם את הבחירה של טרנספורמנטים אמיתיים קשה. כדי להתחיל, להשתמש קיסם רטוב להעביר על 20 כדי 25 זרעי S.Parvula על אדמה רטובה. ואז לשכבות את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים.

לאחר ריבוד, להחזיר את הזרעים לתא הצמיחה במשך שבעה עד 10 ימים. לאחר שכל השתילים נבטו, השאירו רק שתיל אחד בכל אחת מארבע הפינות ובמרכז הסירים. לגדל את הצמחים במשך שמונה עד 10 שבועות בתא הצמיחה עד שהם פורחים.

ביום השינוי, בחר צמחי S.Parvula בהתאם לפרוטוקול הטקסט. השתמש מדפים ומספריים קטנים כדי להסיר את כל תפרחות מאביק כי הם כבר מתפתחים לתוך סיליק. לאחר שהצמחים מוכנים, הכינו פתרון חדירה לאגרובקטריום.

לאחר מכן, לטבול את תפרחת S.Parvula בתספורת חדירת אגרובקטריום במשך 20 שניות. מוצג כאן הוא השלב המוקדם ביותר של הצמחים שניתן להשתמש בהם עבור טרנספורמציה, כל עוד סיליקות שפותחו כבר מוסרים לפני השינוי, צמחים ישנים עם פרחים נוספים ניתן להשתמש. לאחר השינוי, מניחים צמחים טבולים פרחים אופקית במגשים נקיים עם כיפות כדי לכסות את הצמחים.

ואז למקם את הצמחים בחדר צמיחה חשוך במשך יום עד יומיים. מחזירים את הצמחים למצב זקוף ומעבירים אותם לחדר הצמיחה. בשבוע שלאחר מכן, לפקח על תפרחות טבולות.

עשרה ימים לאחר המטבל הפרחוני הראשון, צמחי S.Parvula ימשיכו לייצר תפרחות וסיליקות חדשות. סיבוב שני של מטבל פרחוני יכול להתבצע כדי להפוך עוד יותר את תפרחות המתעוררים החדשים. לגדל את הצמחים עד זרעים להתבגר, לקצור את הזרעים סביב 21 שבועות.

יבש את הזרעים במשך שבועיים עד שלושה שבועות בטמפרטורת החדר במיכל אטום מלא התייבשות. לשתול את T אחד זרעים על פי פרוטוקול הטקסט. לגדל את הצמחים עד שני עד שלושה עלים אמיתיים הראשונים לפתח.

כדי לבצע את הבחירה הראשונה עבור עמידות קוטל עשבים, לדלל קוטל עשבים אמוניום glufosinate לרסס אותו על השתילים. כסו את השתילים עם הכיפות במשך הלילה. תחזיר את המגשים לחדר הגידול, ותסיר את הכיפה.

המתן עד שרוב השתילים ייבחרו על ידי קוטל עשבים. כדי להתחיל את הבחירה השנייה, לזהות את הצמחים ששרדו לאחר ריסוס שלוש עד ארבע פעמים עם פתרון BASTA. לאחר גידול הצמחים במשך שבועיים עד שלושה שבועות נוספים, בחר את העלה הבוגר הגדול ביותר על כל צמח.

הבא לשפשף את פני השטח של העלה בעדינות עם אצבע כדי להסיר את שכבת השעווה. ואז למקם טיפה של פתרון BASTA מדולל על העלה. לפקח על העלים שטופלו עם פתרון BASTA לסימנים של נבול עד שבוע.

לבסוף בחר את הצמחים עם עלים מושפעים על ידי טיפות BASTA לניתוח נוסף. בפרוטוקול זה, S.Parvula השתנה עם אגרובקטריום בשיטת טבילה פרחונית. זיהום עם אגרובקטריום הביא הפלה של כמה פרחים.

עם זאת הצמחים S.Parvula המשיכו לייצר פרחים חדשים לאחר טבילת הפרח הראשונה, והוא יכול להשתנות שוב. באמצעות בדיקות תרסיס ושחרור של BASTA, ניתן לזהות במדויק טרנספורמנטים חיוביים אמיתיים. ניתן להפחית את מספר הדגימות שנבדקו באמצעות אישור PCR.

בעוד שיטה זו דומה לשינוי של Arabidopsis Thaliana, חשוב לזכור את ההבדלים בצמיחה ומורפולוגיה של שרנקיאלה Parvula. שינוי הפרוטוקול כדי לשקף הבדלים אלה הוא קריטי לשינוי מוצלח. טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את האבולוציה של וריאציות גנומיות המוביל התאמות מתח מלח מרובים במודל extremophyte, שרנקיאלה Parvula.

שילוב טכניקה זו עם המידע על הפונקציות של Aradopsis Thaliana, צמח נוסף הקשורים קשר הדוק שרנקיאלה Parvula. חוקרים יכולים לחקור את הווריאציות ברגולציה ובפונקציות כי אלה שני מבנים נפרדים בין שני מינים אלה. במהלך תהליך הטרנספורמציה, חשוב להכיל את כל פתרון חדירת האגרובקטריום במיכלים autoclaveable.

יש לעקר ולהשליך בבטחה את כל החומרים שבאו במגע עם אגרובקטריום הכולל כפפות, טיפים לפיפיט מאקרו ומגבות נייר.