Name: Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Apprenez à évaluer l'intégrité des membranes spermatozoïdes par techniques fluorimétriques incluant marquage simultané, microscopie à fluorescence et cytométrie en flux. Ces méthodes permettent d'améliorer la prédiction du potentiel de fécondation.

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Les auteurs tiennent à remercier la société israélienne « SION » pour l’insémination artificielle et l’élevage (Hafetz Haim, Israël) pour leur aide et coopération et d’assistance avec le réglage de l’instrument et la formation de Mme Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, France).

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives israélien 1994 pour le bien-être animal. Sperme bovin a été fourni par la compagnie israélienne commerciale pour élevage et d’insémination artificielle. Les éjaculats de 11 taureaux ont été évalués dans cette étude.
1. préparation de l’échantillon de sperme
Remarque : La procédure est issue protocole1,3 du laboratoire Roth.
<ol><li>Obtenir environ 1 à 6 mL de sperme de taureau dans un tube de 15 mL à température ambiante.</li>
	<li>À chaque 1 mL de sperme, ajouter 6 mL de tampon NKM préchauffée (à 37 ° C) (110 mM NaCl, KCl, 5 mM 20 mM MOPS [3-N-morphilino sulfonique ; pH 7,4]) et centrifuger à 8 min à 600 g, 1 à 2 fois jusqu'à ce que le liquide surnageant est clair. Remarque : Si la concentration des spermatozoïdes ou le volume initial est très élevé, divisé en deux tubes au premier lavage.</li>
	<li>Immédiatement, retirer et jeter le surnageant clair et laisser environ 1 cm du surnageant au-dessus du culot.</li>
	<li>Soigneusement se pencher les tubes selon un angle de 30° pour augmenter la surface des spermatozoïdes à nager vers le haut et attendez 20 à 30 min pour permettre des spermatozoïdes à nager vers le haut à 37 ° C. Remarque : Turbidité peut être vu.</li>
	<li>Aide d’une micropipette soigneusement, enlever le haut 1 mL du surnageant contenant les spermatozoïdes dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Garder le sperme à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer. Remarque : Une chambre de comptage différente peut être utilisée à la place, mais le décompte est différent.<ol>
<li>Pour éviter tout mouvement de spermatozoïde, diluer 100 µL des spermatozoïdes motiles avec 10 mL d’eau bidistillée (DDW) (dilution 1 : 100) dans un tube de 15 mL et mélanger doucement.</li>
		<li>Charger 10 µL de l’échantillon de chaque côté de l’hémocytomètre et lamelle. Veillez à éviter la formation de bulles à l’intérieur de la chambre car cela peut entraîner une numération des spermatozoïdes inexactes.</li>
		<li>Observer au microscope composé avec un objectif 20 X. Remarque : La grille complète sur un hémocytomètre contient 9 grands carrés, chacun de 1 mm2, et la lamelle repose 0,1 mm au-dessus du sol de la chambre. Ainsi, le volume au-dessus de la zone centrale de comptage est de 0,1 mm3 ou 0.1 µL. La zone centrale de l’hémocytomètre contient 25 places moyennes et chaque carré moyen a 16 carrés plus petits avec des lignes simples.</li>
		<li>Compter le nombre total de cellules 4 places d’angle moyen et la place centrale. Pour une plus grande précision, compter deux chambres (les deux côtés de l’hémocytomètre Neubauer) et la moyenne permet de calculer la concentration cellulaire.</li>
		<li>Calculer le nombre de spermatozoïdes en multipliant le nombre moyen obtenu par 5 (pour obtenir le nombre de cellules par zone de comptage) et par 10 000 (pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL d’échantillon dilué). Alors, multipliez le nombre obtenu par le facteur de dilution (1/100). Remarque : Par exemple, un nombre moyen de spermatozoïdes comptés dans 5 des 25 places moyennes dans la zone centrale de comptage de deux chambres est 150 ([152 + 148] / 2). Ainsi, le nombre moyen de spermatozoïdes par chambre (ou par 0,1 µL) est de 150 x 5 = 750. Multipliez les 750 par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL de l’échantillon dilué (7 500 000) et puis multiplier par 100 (facteur de dilution) afin d’obtenir 75 x 107 cellules / mL d’échantillon de sperme original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. technique #1 : Évaluation simultanée des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de multiples Fluorescent sondes
Remarque : Des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) ont été évaluées comme décrit par Celeghini et al.10, avec quelques modifications. La microscopie épifluorescente servait, combiné avec un appareil photo numérique avec excitation à 450-490 nm et d’émission à 515-565 nm en utilisant un filtre triple.
<ol><li>
Préparer les solutions.
	<ol>
<li>Préparer à 0,1 mg/mL solution DAPI en dissolvant 5 mg de DAPI dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 10 µg/mL).</li>
		<li>Préparer 1 mg/mL solution FITC – PSA en dissolvant 1 mg de FITC – PSA dans 1 mL de PBS. Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 100 µg/mL).</li>
		<li>Préparer 1 mg/mL JC-1 solution en dissolvant 1 mg de JC-1 dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec le DMSO à 01:10 (solution de travail ; 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Préparer la solution mère de PI en dissolvant 10 mg de PI dans 400 µL de PBS (soit 2,5 mg/mL). Conserver à + 4 ° C. Diluer stock 1 avec du PBS à 01:20 (solution de travail ; 0,125 mg/mL). Conserver à + 4 ° C comme une solution-mère. ATTENTION : PI est un potentiel mutagène et doit être manipulé avec soin. Le colorant doit être éliminé en toute sécurité et conformément aux réglementations locales applicables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer 133 µL des spermatozoïdes motiles (étape 1.5) dans un nouveau tube de 1,5 mL (25 x 106 spermatozoïdes/mL). Remarque : Si la concentration de l’échantillon est plus élevée, le diluer dans le tampon NKM à obtenir la concentration requise ; Si la concentration de l’échantillon de la natation, l’échantillon est inférieure, centrifuger le surnageant obtenu après avoir nagé vers le haut à 1 000 x g pendant 5 min, prélever 0,5 mL du surnageant et compter les spermatozoïdes à nouveau.</li>
	<li>Ajouter 17 µL de DAPI (solution de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.</li>
	<li>Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Au culot, ajouter 100 µL de tampon NKM.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de FITC – PSA, 2 µL de JC-1 et 3 µL de PI (solutions de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.</li>
	<li>Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.</li>
	<li>Au culot, ajouter 40 µL de tampon de NKM et remettre en suspension par pipetage.</li>
	<li>Transférer 10 µL de l’échantillon à une lame de verre, le frottis et la lamelle couvre-objet.</li>
	<li>
Visualiser immédiatement par microscopie à épifluorescence (utilisation 40 x objectif) avec un triple filtre, équipé d’un appareil photo numérique et de capturer une image séparément pour chaque filtre. Remarque : Il n’y a pas d’importance à l’ordre des filtres visualisé.<ol>
<li>Visualiser sous canal DAPI avec excitation à 358 nm et d’émission à 461 nm.</li>
		<li>Visualiser sous canal FITC de monomères verts avec excitation à 450 – 490 nm et d’émission à 515 – 565 nm.</li>
		<li>Visualiser sous canal PI pour les agrégats rouges avec excitation à 488 nm et d’émission à 590 nm.</li>
		<li>Visualiser sous JC-1 rouges agrégats avec excitation à 559 nm et d’émission de l’ordre de 574 – 627 nm ; JC-1 verts monomères avec excitation à 488 nm et d’émission de l’ordre de 500 – 535 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fusionner les trois images provenant des filtres au format JPG/JPEG, à l’aide de l’option de « fusion » du logiciel de la caméra.</li>
	<li>Ouvrez l’image fusionnée avec l’outil « Paint » et utilisez l’option de la brosse pour marquer les spermatozoïdes comptés.</li>
	<li>
Classer les spermatozoïdes basées sur la fluorescence émise par chaque sonde :
	<ol>
<li>Évaluer en général au moins 200 spermatozoïdes par lame — toutes les cellules apparaissent en bleus (DAPI).</li>
		<li>Évaluer la viabilité en comptant les cellules mortes, qui apparaissent pourpre (PI [rouge] + DAPI [bleu]) et de calculer le pourcentage de cellules mortes (dead cellules/total compté cellules x 100).</li>
		<li>Évaluer le statut d’acrosome en utilisant les patrons de coloration fluorescente (FITC – PSA). Calculer les pourcentages des différents modèles (x 100 des cellules intactes, endommagés ou réagie acrosome cellules/total compté). Remarque : Membrane acrosomique endommagé apparaît comme un capuchon acrosome entièrement tachée, vert ; réaction acrosomique membrane montre résiduelle vert équatoriale ou supérieure de coloration ; cellules contenant une membrane acrosomique intacte n’affichera aucune coloration verte de la région acrosomique.</li>
		<li>Évaluer les ΔΨm en distinguant les spermatozoïdes avec ΔΨm élevé, qui présentent une pièce colorées au rouge et avec ΔΨm faible, les spermatozoïdes qui présentent une coloration vert bien. Compter les rouge et vert midpieces séparément et calculer leur ratio (rouge/vert).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. technique #2 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes avec les Kits prêts à l’emploi et de la cytométrie en flux
Remarque : Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique, intégrité acrosomique et potentiels de membrane membrane mitochondriale a été réalisée avec les kits de cytométrie en flux de prêts à l’emploi contenant des fluorochromes lyophilisées dans chaque puits. La procédure s’est déroulée selon les fabricants avec quelques modifications.
<ol><li>
Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique
	<ol>
<li>Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de viabilité et de la concentration (PI et SYbr14), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).</li>
		<li>Ajouter 199 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.</li>
		<li>Ajouter 1 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (57 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec le couvercle noir.</li>
		<li>Incuber pendant 10 min à 37 ° C, abri de la lumière.</li>
		<li>Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec la « viabilité » de réglage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potentiel de membrane mitochondrial
	<ol>
<li>Prendre le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de l’activité mitochondriale (JC-1), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).</li>
		<li>Ajouter 10 µL d’éthanol absolu / puits et Pipeter pour remettre en suspension de la poudre présente dans le puits.</li>
		<li>Ajouter 190 µL de PBS / puits et homogénéiser par pipetage.</li>
		<li>Ajouter 0.75 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (50 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec le couvercle noir.</li>
		<li>Incuber 30 min à 37 ° C, abri de la lumière.</li>
		<li>Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec l’activité d’établissement de ʽmitochondrial'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intégrité de la membrane acrosomique Remarque : FITC – PSA coloration (voir Technique #1) permet l’évaluation des 3 catégories de l’acrosome (acrosome intact, acrosome réagie et acrosome endommagé). Utilisant le cytomètre en flux et la viabilité & la trousse d’intégrité acrosome (PI et FITC – ANP), les spermatozoïdes sont séparés dans ces 3 catégories.<ol>
<li>Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit intégrité viabilité & acrosome, transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).</li>
		<li>Ajouter 200 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.</li>
		<li>Ajouter 0,7 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (40 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec le couvercle noir.</li>
		<li>Incuber pendant 45 min à 37 ° C, abri de la lumière.</li>
		<li>Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec le paramètre ʽInCyte'.</li>
		<li>Analyser l’histogramme résultant en bloquant les trois zones de marqueur selon l’intensité de la fluorescence, soit négligeables, faible fluorescence des cellules avec acrosome intact, sans coloration (R1), faible fluorescence cellules avec résiduel teinté partie de l’acrosome (R2) et cellules hautement fluorescentes avec acrosome perturbé (R3). Remarque : Utilisez la section « analyse des fichiers acquis à l’aide d’autres modules » dans le guide utilisateur de l’instrument afin de créer les trois régions (R1, R2, R3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. technique #3 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de sondes fluorescentes et cytométrie en flux
Remarque : Utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique).
<ol><li>Préparer 1 x annexine tampon de liaison V de 20 x solution mère (dilué 500 µL de tampon de liaison V 20 x solution-mère dont 9,5 mL d’eau distillée stérile d’annexine).</li>
	<li>Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer tel que décrit dans la section 1.7.</li>
	<li>Lavez 106 spermatozoïdes dans 1 mL de 1 x annexine V fixation tampon et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant complètement.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 100 µL de 1 x annexine tampon de liaison V.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de l’annexin V conjugué à l’ITCF.</li>
	<li>Bien mélanger et laisser incuber pendant 15 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Laver les spermatozoïdes en ajoutant 1 mL de 1 x annexin V fixation tampon par 106 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant complètement.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 500 µL de 1 x annexin V fixation tampon par 106 cellules total.</li>
	<li>Ajouter 1 µg/mL PI immédiatement avant l’analyse avec un cytomètre en flux.</li>
	<li>Exécuter l’exemple à travers le cytomètre situé sur ʽInCyte'.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêt.

Fertilisation de sperme potentielle dépend de multiples facteurs reflétant sa qualité. Une forte concentration de spermatozoïdes et une forte proportion des spermatozoïdes très progressivement pourraient considérer sperme de haute qualité. Néanmoins, une telle évaluation ne prend pas en compte autres paramètres cellulaires et fonctionnelles. L’utilisation de « table » microcapillaire cytomètre de flux peut être facilement adaptée à l’évaluation des différentes structures de sperme à l’aide de sondes fluorescentes, comme ...

L’intégrité et la fonctionnalité des membranes des spermatozoïdes sont quelques-uns des facteurs indiquant la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle. La membrane plasmique agit comme une barrière entre les compartiments intracellulaires et extracellulaires, préservant ainsi l' équilibre osmotique cellulaire1. Tout stress qui provoque des dommages à l’intégrité de la membrane plasmique pourrait nuire à l’homéostasie, réduire la capacité de viabilité et de la fertilisation et augmenter la mort cellulaire. Par exemple, cryoconservation réduit la viabilité de sperme la dommages à sa membrane plasmique, par suite de changements de température et de stress osmotique2. Nous avons déjà indiqué que l’exposant de sperme de taureau à de faibles concentrations de contaminants d’origine alimentaire tels que l’atrazine de pesticides, son principal métabolite diaminochlorotriazine ou l’aflatoxine mycotoxine B1, réduit sperme viabilité1,3 . Cela a été déterminé par marquage de l’ADN double-brin au DAPI en combinaison avec PI, qui se lie à l’ADN des cellules avec une membrane plasmique endommagée.
Réaction de l’acrosome (AR) implique la fusion de la membrane de l’acrosome externe et la membrane plasmique sus-jacente, aboutissant à la libération d’enzymes acrosomique4,5. Voici les événements essentiels pour pellucide pénétration et plus loin la fusion du spermatozoïde avec l' ovocyte6. En conséquence, l’évaluation de l’intégrité membranaire acrosomique constitue un paramètre utile pour évaluer la qualité du sperme et la fertilité masculine7,8,9. Plusieurs techniques de fluorescence sont appropriés pour la vérification de l’intégrité de l’acrosome, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Dans nos études précédentes, en utilisant les patrons de PSA FITC coloration1,3, nous fournit des définitions précises de (i) acrosome intact, (ii) endommagé la membrane de l’acrosome et (iii) a réagi acrosome. Dans le présent rapport, nous évaluer l’état d’acrosome cytométrie dédiés au sperme et comparer les résultats à ceux utilisant la microscopie à fluorescence.
Les mitochondries sont des organites multifonctionnels impliqué dans, entre autres choses, ATP synthèse, production d’espèces oxygénées radicalaires, signalisation calcique et l’apoptose. Des dysfonctionnements physiologiques, y compris la stérilité masculine et féminine, sont associés à l’altération de la fonction mitochondriale11. Mitochondries du sperme sont disposées dans la pièce et jouent un rôle crucial dans la motilité de sperme12. Il est bien reconnu que haut potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) est associé à la motilité normale et fertilisation haute capacité13. En revanche, ΔΨm faible est associé à un niveau élevé d’espèces réactives de l’oxygène et réduit le taux de fécondation14. Néanmoins, divers composés environnementaux, par exemple de perturbateurs endocriniens, peuvent provoquer le stress cellulaire et conduisent à une augmentation transitoire de la ΔΨm, hyperpolarisation1,3, augmentation de la production de radicaux libres et, éventuellement, 15de l’apoptose. La sonde fluorescente 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1) permet d’examiner par exemple, les effets des toxines d’origine alimentaire sur sperme ΔΨm1,3.
Spermiograms standards, en fonction des paramètres physiologiques et morphologiques, ne sont pas assez bons pour prédire la qualité de sperme. Des méthodes plus précises sont nécessaires pour assurer la qualité du sperme. Ici, nous fournissent deux méthodes possibles pour déterminer la qualité du sperme fondée sur des évaluations des membranes des spermatozoïdes : coloration quadruple simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques et la microscopie de fluorescence, décrit dans nos études1,3 et cytométrie en flux de sperme-dédiée avancée, utilisées récemment dans notre laboratoire et déjà utilisé par d’autres16,17,18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [Acide 3-N-morphilino propanesulfonique]</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Neubauer Allemagne</td><td></td><td>hémocytomètre</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>sonde fluorescente</td></tr><tr><td>PI (iodure de propidium)</td> <td>Sigma</td><td>P4170</td><td>sonde fluorescente</td></tr><tr><td>FITC-PSA (fluorescéine isothiocyanate conjuguée Pisum sativum agglutinine )</td><td>Sigma</td><td>L0770</td><td>sonde</td></tr> <tr><td>fluorescenteJC-1 (5,5',6,6'-tétra-chloro-1,1',3,3'-tétraéthylbenzimidazolyle iodure de carbocyanine)</td><td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td><td>ENZ52304</td><td>sonde fluorescente</td></tr><tr><td>Annexine V conjuguée à FITC</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td><td>sonde fluorescente</td></tr><tr><td>Annexine V tampon de liaison 20x solution mère</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td></td><td>microscope à fluorescence inversée</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td></td><td>logiciel</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td></td><td>appareil photo numérique</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L’Aigle, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, Californie, États-Unis ; distribué par IMV Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software Solution tamponnée pour la cytométrie</td><td>IMV Technologies, L’Aigle, France</td><td>023862</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité et de concentration</td><td>IMV Technologies, L’Aigle, France</td><td>024708</td><td>kit d’évaluation</td></tr> de la viabilité <tr><td>Kit d’activité mitochondriale</td><td>IMV Technologies, L’Aigle, France</td><td>024864</td><td>kit d’activité mitochondriale </td></tr><tr><td></td><td>IMV Technologies, L’Aigle, France 025293 kit pour l’évaluation</td><td></td> de <td>l’intégrité de l’acrosome</td></tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Bovine sperm</td> <td>« SION », société israélienne pour l’insémination artificielle et le drageing, Hafetz-Haim, Israël</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorimétrique techniques pour l’évaluation des membranes des spermatozoïdes

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Spermiograms standards décrivant la qualité du sperme sont principalement basées sur les paramètres physiologiques et visuels, tels que le volume de l’éjaculat et concentration, mobilité et motilité progressive et la morphologie des spermatozoïdes et la viabilité. Cependant, aucun de ces évaluations est assez bon pour prédire la qualité de sperme. Étant donné que le maintien de la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle dépend de l’intégrité membranaire et intracellulaire fonctionnalité, évaluation de ces paramètres pourrait permettre une meilleure prédiction de la compétence de la fécondation de sperme. Nous décrivons ici trois méthodes possibles pour évaluer la qualité du sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées avec des analyses fluorescence microscopie ou écoulement cytometry. Analyses a évalué l’intégrité de la membrane plasmique avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’iodure de propidium (PI), intégrité de la membrane acrosomique utilisant conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine agglutinine de Pisum sativum (FITC-PSA) et intégrité de la membrane mitochondriale à l’aide de 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1). Combinaisons de ces méthodes sont également présentées. Par exemple, utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique). Nous croyons que ces méthodes, qui reposent sur l’examen des membranes de spermatozoïde, sont très utiles pour l’évaluation de la qualité du sperme.

Figure 1 montre fluorimétrique simultanée évaluation des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) à l’aide de PI, DAPI, FITC-PSA et JC-1. Évaluation des membranes des spermatozoïdes à l’aide de coloration simultanée avec quatre sondes fluorescentes permet, par exemple, évaluer la proportion de spermatozoïdes dans chaque catégorie — vivre vs morts ; élevé par rapport à faible ΔΨm ; intact vs. endommagé acrosom...

Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.

Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

L’objectif de ces procédures est d’évaluer l’intégrité des membranes de sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées à une microscopie de fluorescence ou à une analyse de cytométrie du débit. Ces techniques pourraient aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reproduction telles que la prédiction du potentiel de fécondation et la qualité de l’échantillon de sperme. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent une évaluation précise de plusieurs membranes spermatozoïdes qui sont connues pour s’associer au potentiel de fécondation du sperme.Les implications de ces techniques s’étendent au diagnostic de la qualité d’éjaculat car elle permet l’évaluation plus précise du plasma de sperme et de l’intégrité de membrane acrosome aussi bien que le potentiel mitochondrique de membrane. Pour commencer cette procédure, obtenir environ un à six millilitres de sperme de taureau dans un tube de 15 millilitres à température ambiante. Ajouter six millilitres de tampon NKM préchauffés à 37 degrés Celsius à chacun un millilitre de sperme.Centrifugeuse à 600 fois g pendant huit minutes. Répétez la centrifugation une ou deux fois jusqu’à ce que le supernatant soit clair. Après cela, jetez immédiatement la majeure partie du surnatant, laissant environ un centimètre de supernatant au-dessus de la pastille.Penchez soigneusement les tubes à un angle de 30 degrés dans l’incubateur et attendez 20 à 30 minutes pour permettre au spermatozoa de nager vers le haut. À l’aide d’une micropipette, retirer soigneusement le millilitre restant de supernatant qui contient maintenant le spermatozoa motile et le transférer dans un tube frais de 1,5 millilitre. Gardez le sperme à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.Tout d’abord, préparez toutes les solutions de stock nécessaires telles qu’décrites dans le protocole textuel. Ensuite, transférez 133 microlitres du spermatozoa motile à une concentration de 25 millions de spermatozoïdes par millilitre à un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 17 microlitres de la solution de travail DAPI et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Centrifugeuse à 1000 fois g pendant 5 minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 100 microlitres de tampon NKM à la pastille. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de FITC-PSA, deux microlitres de JC-1 et trois microlitres de PI. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Centrifugeuse à 1000 fois g pendant 5 minutes. Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans 40 microlitres de tampon NKM. Transférer ensuite 10 microlitres de l’échantillon sur une lame de verre.Enduitez l’échantillon et ajoutez un coverslip. Après cela, commencez immédiatement à visualiser l’échantillon par microscopie d’épifluorescence avec un objectif 40X et un triple filtre tel que décrit dans le protocole de texte, à l’aide d’un appareil photo numérique pour capturer une image distincte pour chaque filtre. Utilisez l’option de fusion dans le logiciel de la caméra pour fusionner les trois images reçues des filtres, en sauvant le nouveau fichier au format JPEG.Ouvrez l’image fusionnée avec l’outil de peinture et utilisez l’option brosse pour marquer le spermatozoa compté. Ensuite, classer le spermatozoa en fonction de la fluorescence émise par chaque sonde, en s’assurant d’évaluer au moins 200 spermatozoa par diapositive. Toutes les cellules doivent apparaître bleues à partir du DAPI.Comptez les cellules mortes, qui semblent violettes, pour évaluer la viabilité. Ensuite, utilisez les modèles de coloration par fluorescence pour évaluer l’état acrosome. Enfin, évaluez le potentiel de la membrane mitochondrique en distinguant le spermatozoa avec un potentiel de membrane mitochondriale élevé qui présentent un milieu teinté de rouge du spermatozoa avec un faible potentiel memitochondrial qui présentent un milieu teinté de vert.Comptez séparément les midpieces rouges et verts et calculez leur ratio. Pour commencer l’évaluation de l’intégrité de la membrane plasmatique, prenez le nombre désiré de puits de la trousse de viabilité et de concentration. Transférez les puits à la base de travail et couvrez-les d’un couvercle flexible pour les protéger de la lumière.Ajouter 199 microlitres de solution tamponnée pour la cytométrie à chaque puits. Ajoutez ensuite un microlitre de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéisez par pipetting. Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après cela, exécutez l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le réglage de viabilité. Pour commencer à évaluer le potentiel de la membrane mitochondrique, sortez le nombre désiré de puits de la trousse d’activité mitochondriale. Transférez-les à la base de travail.Ajouter 10 microlitres d’éthanol absolu à chaque puits et utiliser une pipette pour réutiliser la poudre présente dans le puits. Ajouter 190 microlitres de PBS par puits et homogénéiser par pipetting. Ajouter 0,75 microlitres de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéiser par pipetting.Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, exécuter l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le réglage de l’activité mitochondrique. Pour commencer à évaluer l’intégrité de la membrane acrosomale, sortez le nombre désiré de puits de la viabilité et de la trousse d’intégrité acrosome.Transférez les puits à la base de travail et couvrez-les d’un couvercle flexible pour les protéger de la lumière. Ajouter 200 microlitres de solution tamponnée pour la cytométrie à chaque puits. Ajoutez ensuite 0,7 microlitre de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéisez par pipetting.Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Après cela, exécutez l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le paramètre d’aperçu. Dans cette étude, la qualité du sperme est évaluée à l’aide de différentes techniques, dont l’une a évalué les membranes de sperme à l’aide de sondes fluorométriques.Il est possible d’évaluer les différences dans la qualité de l’échantillon de sperme en termes d’intégrité membranaire. Par exemple, l’éjaculat du taureau numéro sept avait un pourcentage relativement faible de cellules mortes, une faible proportion de spermatozoïdes avec acrosome pseudo-réagi, et un potentiel memitochondrial plus élevé par rapport à l’éjaculat du taureau numéro un. Les échantillons sont ensuite évalués en fonction de leur viabilité et de leur activité mitochondriale.Les histogrammes pour ces exemples représentatifs représentent le spermatozoa nongated et les débris et le spermatozoa fermé. Ces histogrammes représentent également les cellules viables et mortes et la distribution du spermatozoa à la membrane mitochondriale polarisée et dépollisée. L’intégrité de l’acrosome est ensuite évaluée à l’moyen d’un kit prêt à l’emploi et lue avec cytométrie d’écoulement, divisant la zone en trois zones marqueurs qui représentent des cellules fluorées faibles négligeables avec des cellules intactes acrosomes non tachées et à faible fluoration avec une partie tachée résiduelle de l’acrosome, et des cellules fortement fluorées avec acrosome perturbé.Tout en essayant ces procédures, il est important de s’assurer de bien préparer l’échantillon de sperme initial. Ces techniques peuvent fournir un aperçu de l’évaluation de la qualité du sperme et peuvent être appliquées à divers organismes tels que les bovins, les volailles et les humains. La comparaison entre les deux techniques, la quadruple coloration et la cytométrie d’écoulement n’a indiqué aucune différence significative pour la viabilité, le potentiel mitochondrique de membrane, et l’intégrité acrosome révélant que les deux techniques ont produit des résultats assortis.

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