Name: Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 학습하세요 형광 은 프로브를 이용한 폴리아크릴아미드 겔 단백질 염색법을 SDS-PAGE와 함께 사용하여 민감도와 특이성을 향상시키는 방법을. 이 기술은 저분자량 단백질 검출에 특히 유용합니다.

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저자는 그의 기술 지원에 대 한 회복 약, 카롤 린스 카 Institutet 패트릭 챈 명나라와이 라우 센터에 감사 하 고 싶습니다. S. X. 스웨덴 연구 위원회 (그랜트 No. 2017-06344)에서 지원에 대 한 감사입니다.

1입니다. 젤의 준비
참고: 데모 SDS 페이지12직후 얼룩에 대 한 젤을 준비 하는 표준 프로토콜을 따릅니다. 간단히, 다음 단계는 샘플의 준비를 설명 하 고 젤 전기 이동 법.
<ol><li>4%-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (1mm, 15 잘) SDS 페이지 수행 2-(N-morpholino)로 가득 미니 젤 탱크를 사용 하 여 ethanesulfonic 산 (MES) 버퍼.</li>
	<li>희석 증류수, 리튬 라우릴 황산 (LDS) 버퍼, 그리고 샘플을 감소 요원의 혼합물으로 샘플.</li>
	<li>재고 (10 µ L), 양의 두 배 첫 번째 레인 정상적인 재고 금액 (5 µ L) 및 (13 희석, 8192 x 2 배에서)의 두 가지 희석 후의 일련 로드.</li>
	<li>30 분 동안 200 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다.</li>
</ol>2입니다. 젤의 고정
<ol><li>실내 온도 (각 30 분), x 2에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 50 rpm에서 궤도 통에 40 %ethanol/10% 초 산의 100 mL 해결책에 젤 전기 이동 법, 후 잠수함</li>
	<li>3 x 10 분 각 깨끗 한 용기에 초순에 젤을 씻어. 세척 단계는 중요 한. 고정 솔루션에서 산 fluorogenic 개발 단계에서 제대로 제거 되지 않습니다, 경우 과도 한 TPE-4TA 산에 의해 활성화 되 고 젤에서 강한 배경 형광.</li>
</ol>3. 준비는 AgNO3솔루션 및 젤의 실버 침
<ol><li>어 그 노3 솔루션 (0.0001%) 임신에 대 한 첫째, 0.01 g 0.1% AgNO3 재고 솔루션을 준비 하는 초순의 10 ml에서 AgNO3 의 분해. 다음, 작업 솔루션 초순 물 100 mL에 0.1% AgNO3 재고 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 참고: AgNO3 솔루션 사용 하기 전에 어둠 속에 저장 합니다.</li>
	<li>실버 밀폐 유리 용기에서 50 rpm에서 궤도 통에 1 시간에 대 한 솔루션을 작업의 100 mL와 함께 젤 임신 그것은 증기 두건, 알루미늄 호 일 빛에서 보호 아래은 수태를 수행 하는 중요 한입니다.</li>
	<li>2 x 60에 대 한 깨끗 한 용기에 초순 (약 100ml)와 젤을 씻어 s.</li>
</ol>4. Fluorogenic 젤의 개발
<ol><li>염료 스톡 솔루션 (0.1 m m)를 준비 하려면 초순 물 50 mL에 TPE 4TA 염료의 3.0 mg을 추가 합니다. 몇 분 동안 솔루션을 sonicate 고 염료를 분해 수 있도록 일부 NaOH 솔루션 (예를 들면 1 개 M)를 추가 합니다.</li>
	<li>염료 분자는 완전히 용 해 되도록 365 nm UV 램프에서 솔루션의 형광을 확인 하십시오. 만 약 또는 nonemissive 솔루션 전체 해체를 나타냅니다. 참고: TPE-4TA 은 염료 합성 다음 프로토콜 최근 보고 시 외. 10 TPE 4TA 솔루션 매우 안정적 이며 달 동안 어둠 속에 보관 하실 수 있습니다.</li>
	<li>Fluorogenic 개발 솔루션 (10 µ M)의 100 mL를 준비 하려면 초순 물 90 mL에 TPE 4TA 재고 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. PH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 확인 하 고 7-9를 사용 하 여 수산화 나트륨 용액 (1 µ M)에 그것을 조정할.</li>
	<li>Fluorogenic 개발 솔루션의 100 mL와 함께 깨끗 하 고 접착성 컨테이너에 젤을 전송 합니다. 젤은 완전히 몰입 솔루션에 다는 것을 확인 하십시오. 컨테이너 봉인. 빛에서 그것을 커버 하 고 하룻밤 실 온에서 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어. 또는, 인큐베이션 단계 수 또한 단축 될 약 ~ 2 h AIE 개발 솔루션 얼룩이 지 고 실내 온도에 그것을 떠날에 대 한 80 ° C로 예 열 하 여.</li>
</ol>5. destaining 및 이미징
<ol><li>깨끗 한 용기에 젤을 전송 하 고 30 분 동안 10% 에탄올 100ml에 destain. 참고: 혼자 물 젤을 씻어 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 destaining에 대 한 10% 에탄올 솔루션을 사용 하 여 시간을 더 효율적입니다. 이 시간에서 30 분으로 destaining 과정을 줄이기 위해 도움이 됩니다.</li>
	<li>5 분 동안 초순에 젤 린스.</li>
	<li>365 nm 채널 또는 302 nm 채널에서 젤 젤 문서 컴퓨터 이미지.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

이 형광은 얼룩에 특허 출원을 제기 했다.

여기는 소설 형광은 얼룩 polyacrylamide 젤에 단백질을 위한 방법. 이 전략은 기존의 얼룩 및 형광 얼룩 통합합니다. 얼룩 악용 다른 실버로 단백질은 이온의 선택적 바인딩 얼룩 하지만 매우 중요 한 fluorogenic 실버를 사용 하 여 TPE 4TA 빛은 바인딩된 단백질을 조사. 하면 전통에 필요에 따라 감소 시각화 단계의 더 이상 요구 하지 않고 매우 민감한 감지 이후 fluorogenic 프로브 TPE 4TA nanomolar 범위11에서 상당히 낮은 농도에 이온을 느낄 수 있다, 실버 얼룩입니다. 이 실행 실행 가능한 변형을 최소화 됩니다. 한편, 포름알데히드와 글, 펩 티 드 식별 MS 분석에 자주 방해를 포함 하 여 가혹한 화학 물질의 사용을 방지 한다. 또한, TPE 4TA AIE 액티브 하 고 자체 냉각 문제 무료, 염료 분자의 수에 대 한 응답에 단백질 밴드에 밀도가 ...

많은 얼룩 방법 단백질 젤 전기 이동 법에 따라, 예를 들면 Coomassie 화려한 블루, 실버 얼룩, 형광, 색도계 염료를 사용 하 여 시각화 하는 데 사용 되었거나 방사성 라벨1,2, 3 , 4. 실버 얼룩 간주 됩니다 간단 하 고 저렴 한 시 약을 필요로 하는 단백질 검출에 대 한 가장 중요 한 기술 중 하나. 그것은 두 개의 주요 가족으로 분류 될 수 있다: 실버 질산염 및 암모니아은 얼룩 얼룩5,6. 알칼리 성 암모니아 실버 메서드 실버 diamine 복잡 한 암모니아와 수산화 나트륨 생산 이며 산 성 포 름 알 데히드 솔루션을 사용 하 여 개발 하는 동안 금속은 감소. 얼룩 기본적인 단백질에 대 한 효율적으로 수용 하지만 산 성 및 중성 단백질에 대 한 손상 된 성능을 보여줍니다 그리고, 또한, 클래식 글리신 및 황소자리 전기 이동 시스템. 비교, 실버 질산염 얼룩 악용 단백질은 이온의 높은 바이오 선호도, 주로 sulfhydryl carboxyl 측면 체인에서 그룹 그리고 산 성 단백질을 보다 효율적으로 얼룩 하는 경향이7. 실버 이온 바인딩, 후 (일반적으로 만든 포름알데히드와 나트륨 thiosulphate를 포함 하는 금속 탄산 솔루션) 개발 솔루션은 이온 금속은 곡물 브라운-어두운 색상 시각화를 구축을 줄이기 위해 적용 되는 단백질 밴드입니다.
비록은 얼룩의 다양성 및 높은 감도 대 한 잘 알려진 1970 년대8의 개발 이후, 방법으로 까다로운 자주 간주 됩니다. 실버 얼룩 방법을 단계 시간 제한 있고 낮은 재현성을 보여줍니다. 실버 얼룩의 색상은 일반적으로 하지 균일 하 고 제어 하기 어렵다, 감소 단계에 따라 이후 실버 얼룩 양적 방법 이며, 따라서, 젤 비교 연구 및 단백질 정량화9에 대 한 권장 하지 않습니다. 감도에 최적화 하는 방법 또한 더 유니폼10얼룩을 제공할 수 있는 알데하이드 활용 수 있습니다. 그러나,이 때문에 알데하이드에 의해 단백질의 가교 추가 다운스트림 분석 비용입니다. 빠른 프로토콜은 주로 조합 또는 재현성 및 얼룩5의 균일성을 타협 하는 시간을 줄이기 위해 단계를 단축. 그 결과, 수많은 실버 얼룩 얼룩; 특정 요구 사항에 맞게 최적화 된 각 단백질 젤 내에서 이체 있다 예를 들어 단순, 감도, 또는 펩 티 드 복구 속도 다운스트림 분석에 대 한. 이러한 특성 또한 서로에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 한 프로토콜에서 모든 요구를 만족 시키기 어려울 수 있습니다.
이 작품에서 새로운 형광은 단백질 검출 polyacrylamide 젤에 방법 얼룩을 소개 합니다. 이 방법에서는, 우리 실버 침 단백질11시각화 하은 이온, TPE-4TA (그림 1)에 대 한 fluorogenic 프로브를 사용 합니다. TPE 4TA 집계 유도 방출 (AIE) 원칙에 의해 설계 되었습니다. 그것은 비-브 수성 해결책에서 녹을 때 하지만 높은 브은 이온의 존재. 전통적인 실버 얼룩에 비 개발 단계를 개발 하는 fluorogenic, 바꿔서 형광은 메서드 감소 배경으로 총 단백질의 강력한 얼룩 수 있습니다.
또한, 형광은 얼룩 널리 SYPRO 루비 얼룩과 비교 하 고 전통적인은 얼룩 하지 달성 단백질 정량화에 대 한 좋은 동적 선형 범위를 보였다. 젤 자외선 램프로 일반적으로 사용 되 젤 문서 시스템에 몇 군데 수 있습니다 (여기 파장: 302/365 nm 채널; 방출: 490 ~ 530 nm) 많은 생물학 실험실에서.

<table><tbody><tr><td> LDS 시료 버퍼(4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>시약</td></tr><tr><td> 4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15웰</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>프리캐스트 겔</td></tr><tr><td>시료 환원제(10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>시약</td></tr><tr><td>MES SDS 러닝 버퍼(20X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>시약</td></tr><tr><td>미니 젤 탱크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>장비</td></tr><tr><td>300W 전원 공급 장치(230VAC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td>장비</td></tr><tr><td>염색되지 않은 단백질 사다리</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>샘플</td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>시약</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bragg and co.</td><td>42520J</td><td>시약</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>시약</td></tr><tr><td>Milli-Q 합성 A10</td><td></td> Merk-18.2 <td></td><td>M&Omega를 제공합니다. cm 워터</td></tr><tr><td>젤 문서화 시스템(c600 모델)</td><td>Azure biosystems-Equipment</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

실버 얼룩은 널리 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 다음 polyacrylamide 젤에 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 색도계 기술. 클래식은 얼룩 얼룩, 불 쌍 한 단백질 복구, 낮은 재현성, 정량화, 및 질량 분석 (MS)와 호환성을 제한 된 좁은 선형 동적 범위 높은 백그라운드와 같은 특정 단점이 있다. 지금, TPE-4TA, fluorogenic+ Ag 프로브를 사용 하 여 우리 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 시각화 방법 얼룩이 지기 형광 실버를 개발 했다. 이 새로운 얼룩 전통적인 실버 얼룩에 성가신 실버 감소 단계를 피할 수 있습니다. 또한, 형광은 얼룩 좋은 재현성, 감도, 및 선형 부 량 단백질 검출, 유용 하 고 실용적인 단백질 젤 얼룩을 만드는 방법을 보여 줍니다.

형광은 얼룩에 의해 얼룩이 단백질 밴드 365 nm UV 램프에서 강렬한 녹색 형광을 전시 한다. 모든 14 단백질 밴드 (10-200 kDa), 위에서 아래로, 명확 하 게 보이는, SYPRO 루비 염료 (그림 2)10에 의해 스테인드 14 레드 색 들과 잘 했다.
정량적 단백질 검출에 관한는 젤은 젤 이미징 시스템 자동화 된 절차를 사용 하 여 몇 군데 하 고 이미지 분석 된 상용 소프트웨어를 사용 하 여 비교. 이 형광은 방법 얼룩 나타납니다 높은 해상도. 일부 단백질 밴드에 대 한 형광은 얼룩의 감도 형광 SYPRO 루비 얼룩의 그것 보다 약간 더 나은 이기도합니다. 특히, 형광은 얼룩의 성능은 나타내는 새로운 메서드는 저 분자 무게 단백질의 탐지를 위해 특히 ...

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

이것은 형광실버 프로브를 사용하여 기존의 은 염색을 형광 실버 스테인딩으로 변환하는 새로운 젤 염색 방법입니다. 이 방법은 알데히드없이 간단하고 간단한 프로토콜을 사용하는 동안 기존의 실버 질산염 염색 및 SYPRO 루비 염색에 비해 향상된 성능을 보여 주었다. 절차를 시연하는 것은 알렉스 웡, 내 실험실에서 연구 조수가 될 것입니다.이 절차를 시작하려면 증류수, LDS 버퍼 및 시료 감소제를 포함하는 용액으로 단백질 샘플을 희석시킵니다. MES 버퍼로 채워진 미니 젤 탱크를 설정하여 4-12 %의 비스 트리스 단백질 젤로 SDS-PAGE를 수행합니다. 준비된 단백질 샘플로 우물을 적재한 다음 30분 동안 200볼트의 일정한 전압으로 젤을 실행합니다.전기 포근 후, 궤도 셰이커에 에탄올과 아세트산을 포함하는 100 밀리리터 용액에 젤을 잠급하고 50 rpm에서 흔들면서 실온에서 각각 30 분 동안 두 번 배양합니다. 다음으로, 깨끗한 용기에 초순수물로 젤을 3번 씻고 10분간 세척합니다. 먼저, 0.01 그램의 은 질산염을 초순수 10밀리리터에 녹여 0.1%의 농도로 스톡 용액을 100밀리리터의 초순수용수에 첨가하여 은질산염 작업 용액을 만듭니다.연기 후드에 밀봉 유리 챔버에서 실버 질산염 작업 용액의 100 밀리리터에 젤을 잠급. 알루미늄 호일을 사용하여 함침 중에 빛으로부터 젤을 보호하고 궤도 셰이커에서 50 rpm에서 흔들면서 1 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 깨끗한 용기에 초순수물로 젤을 두 번 씻고, 각 세척은 약 100밀리리터의 물을 사용하고 60초 간 지속됩니다.초순수수를 사용하여 은색 함침 단계 후 젤을 청소하여 배경 염색을 최소화하는 것이 중요합니다. 먼저 TPE-4TA 염료 3밀리그램에 50밀리리터의 초순수를 넣습니다. 용액을 3분 동안 초음파처리하고 각 초음파 처리 세션 사이에 1-어금니 나트륨 수산화용액 5마이크로리터를 추가하여 염료를 최대 3배까지 용해시합니다.그런 다음 365나노미터 UV 램프 아래에서 용액의 형광을 확인하여 염료가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 약한 또는 비면제 솔루션만이 완전한 용해를 나타냅니다. 불소 개발 솔루션을 준비하려면 TPE-4TA 스톡 솔루션 10밀리리터를 90밀리리터의 초순수에 추가합니다.pH 미터를 사용하여 솔루션의 pH를 확인합니다. pH가 범위를 벗어난 경우 희석된 수산화 나트륨 용액 또는 아세트산을 사용하여 7에서 9 사이의 pH에 용액을 조정합니다. 다음으로 젤을 불소 발전 용액의 100 밀리리터로 깨끗하고 밀봉 가능한 용기에 전달하고 젤이 완전히 침지되도록 합니다.용기를 밀봉하고 빛으로부터 보호하기 위해 덮습니다. 50 rpm과 실온에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 컨테이너를 흔들어 보십시오. 젤을 깨끗한 용기에 옮기고 100 밀리리터에 30분간 스테인틴을 전달합니다.그런 다음 젤을 초순수 수분으로 5분간 헹구는 것입니다. 젤은 벤치탑 트랜실루미나이터에 시각화되거나 365나노미터 채널 또는 302나노미터 채널의 젤 문서화 기계상에서 이미지화될 수 있다. 이 연구에서는, 새로운 형광 실버 염색 방법은 폴리 아크릴아미드 젤에 단백질을 얼룩지게 하는 데 사용됩니다.형광 실버 얼룩에 의해 염색 된 단백질 밴드는 365 나노 미터 UV 램프 아래에 강렬한 녹색을 나타낸다. 모든 14 단백질 밴드는 명확하게 볼 수 있으며 SYPRO 루비 염료에 의해 염색 된 붉은 색 밴드와 잘 상관 관계가 있습니다. 이 형광 실버 염색 방법은 고해상도를 갖는 것으로 보입니다.일부 단백질 밴드의 경우 형광 실버 얼룩의 감도는 형광 SYPRO 루비 얼룩보다 약간 더 좋습니다. 특히 이러한 얼룩의 성능은 10~40킬로달톤 사이의 단백질 대역에 대해 개선되며, 이는 새로운 방법이 저분자량의 단백질 검출에 특히 유용하다는 것을 나타낸다. 알 수 있듯이, 데이터는 또한 형광 실버 얼룩이 단백질 정량화의 상대적으로 넓은 범위를 통해 모든 14 단백질에 대한 좋은 균일 한 선형성을 제공한다는 것을 시사한다.실버 질산염 얼룩이 높은 수준의 배경 신호와 왜곡된 피크를 주었지만, 형광 은 얼룩은 14가지 단백질 전체에 걸쳐 SYPRO 루비 얼룩에 필적하는 좋은 대비와 균일한 강도 분포로 밴드를 감지했습니다. 세척 단계는 은 함침 이나 불소 발달을 방해에서 잔류 고정 솔루션을 제한으로 중요 하다. 실버 질산염을 사용하는 경우 피부 접촉을 피하십시오.유출을 즉시 청소하십시오. 보호복과 장갑을 착용하고 화학 폐기물로 폐기하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

전기 방법으로 분리에 따라, 젤의 단백질은 몇 얼룩 방법에 의해 감지하실 수 있습니다. 쿠매시 블루, 실버 스테 이닝, SYPRO 오렌지, SYPRO 루비와 단백질 얼룩이 비디오 시연하고 있습니다.

젤의 단백질 염색법

단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 - D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을...

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

이 비디오에서는 형광 프로브를 사용하여 총 단백질을 시각화하기 위한 폴리아크릴아미드 겔의 은 염색 방법을 보여줍니다.

형광 은 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 총 단백질을 시각화하는 기술

이 비디오에서는 황산화 글리코사미노글리칸 올리고당 단편의 알시안 블루 및 실버 결합 염색 절차를 보여줍니다. 이 결합된 염색 기술은 폴리아크릴아미드 겔에서 서로 다른 길이의 글리코사미노글리칸 중합체 띠를 크게 증폭시킵니다.

은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

학습하세요 형광 은 프로브를 이용한 폴리아크릴아미드 겔 단백질 염색법을 SDS-PAGE와 함께 사용하여 민감도와 특이성을 향상시키는 방법을. 이 기술은 저분자량 단백질 검출에 특히 유용합니다.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

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