Name: Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Découvrez une méthode simple et reproductible pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris en utilisant Escherichia coli exprimant l'EGFP. Cette technique rapide permet d'étudier la fonction immunitaire innée et le vieillissement immunitaire.

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La Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 31800046) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Liaoning (no 20170540262) prise en charge de ce travail. Ce travail a été accompli dans les laboratoires du centre de recherche scientifique à l’Université deuxième hôpital de Dalian Medical. Les auteurs aimeraient remercier Xiao-Lin Sang pour son aide avec la cytométrie en flux, ainsi Bo Qu et Dong-Chuan Yang pour leur aide dans la production de la vidéo.

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvées par le Comité emploi de Dalian Medical University et animalier. Seize mois (avec un poids de 30-35 g) et huit semaines (20-25 g) SPF (spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes) C57BL/6 des souris mâles ont été obtenues du centre animaux SPF de l’université médicale de Dalian. Toutes les souris étaient gardés dans la stabulation avec accès à la nourriture et l’eau ad libitum. La température a été maintenue entre 20 et 24 ° C, l’humidité était de 40 % - 70 %, et l’éclairage était 12 h lumière/12 h d’obscurité. Les animaux ont été admis à s’acclimater à l’environnement pendant au moins 7 jours avant l’expérience.
1. construction du pET-SUMO-EGFP plasmide et induction de l’expression EGFP
<ol><li>Synthétiser le fragment de gène EGFP (une séquence de bp 717 synthétisé par un service de synthèse de gène personnalisé, voir Table des matières et 1 de fichier supplémentaire pour la séquence) et amplifier le fragment avec l’apprêt avant ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') et amorce de marche arrière (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), à l’aide de polymérase de Taq DNA de haute fidélité.</li>
	<li>Pour garantir que les produits de réaction en chaîne (PCR) polymérase adénine porte-à-faux unique de 3' pour le clonage de TA à l’étape suivante, utilisez une extension de 30 min à 72 ° C après le dernier cycle (voir 1 de fichier supplémentaire pour des conditions d’amplification). Vérifier le produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.</li>
	<li>Cloner le produit de la PCR dans le vecteur animal-SUMO (voir Table des matières) à l’aide de la TA clonage méthode5 avec T4 DNA ligase. Incubez la réaction à la température ambiante (20-25 ° C) pendant 30 min. Le vecteur est linéarisé entre nucléotides 653 et 654 avec un 1 bp 5′ T-surplomb sur chaque brin.</li>
	<li>Transformer le produit de ligation dans la souche BL21(DE) de e. coli chimiquement compétente comme suit : ajouter 5 µL (100 ng) du produit PCR à 100 µL de cellules capables de BL21(DE) par un choc thermique à 42 ° C pendant 90 s ; garder le mélange sur la glace pendant 3 min et ensuite, ajouter 400 µL de milieu de bouillon (LB) de lysogénie préalablement chauffé à 37 ° C, secouant pendant 1 h à 37 ° C et 120 tr/min.</li>
	<li>Ensemencer 100 µL des bactéries sur la surface d’une plaque en LB-kanamycine (100 µg/mL) avec le lactose inducteur (0,5 mmol/L), ce qui donne de la souche d’expression EGFP. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Remarque : Si l’EGFP est exprimée avec succès, certaines colonies s’observe comme feu de vert brillant dans l’obscurité.<ol>
<li>Vous pouvez sélectionner des colonies pour vérifier le fragment inséré de EGFP par séquençage de l’ADN. Les amorces pour le séquençage de l’ADN sont : vers l’avant, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; inverse, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensemencer une colonie positive dans 5 mL de milieu LB avec 100 kanamycine µg/mL. Incuber dans un 37 ° C, agitation incubateur à 120 tr/min pendant 2 h et ensuite, ajouter le lactose inducteur à une concentration finale de 0,5 mmol/L et continuez à secouer pendant 6 h, induisant expression EGFP. Empiriquement, en agitant pendant 6 h, la densité optique à 600 nm (DO600) peut atteindre 0,7 ou supérieur.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de milieu de culture bactérien sur une lame, recouvrir d’une lamelle et examiner l’expression de EGFP sous un microscope à fluorescence inversé. Les bactéries exprimant EGFP peuvent être stockés dans le milieu entre 2 et 8 ° C pendant plusieurs semaines.</li>
</ol>2. isolement des macrophages péritonéaux et culture primaire de souris
<ol><li>Ajouter 3,5 g de thioglycolate dans 100 mL d’eau distillée et stériliser le mélange à la stérilité avant utilisation. Pomper le milieu thioglycolate dans la seringue stérile 1 mL dans la hotte pour l’injection péritonéale de la souris. Une souris par seringue permet d’éviter l’infection. L’utilisation de thioglycolate peut augmenter le nombre de macrophages. Les macrophages péritonéaux résidents peuvent être isolés sans thioglycolate mais avec bas conduit à macrophage.</li>
	<li>Anesthésier la souris à l’aide d’une méthode approuvée par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux locaux. Injecter 1 mL de milieu de thioglycolate de 3,5 % dans la cavité péritonéale de la souris avec la seringue de 1 mL, à l’aide d’une aiguille de 23 G. Remarque : En induisant l’anesthésie, l’injection péritonéale peut être effectuée facilement et réduit le risque de blessures aux organes internes causées par injection.</li>
	<li>Maintenir la souris avec de l’eau et l’alimentation ad libitum pendant 3 jours. Surveiller la prise de poids et de la nourriture des corps de l’animal tous les jours. Si la perte de poids est supérieure à 10 % dans les 3 jours, exclure l’animal de l’expérience.</li>
	<li>Après 3 jours, euthanasier la souris par dislocation cervicale après induisant rapidement anesthésie par sévoflurane dans une boîte fermée. Vous pouvez également utiliser une méthode qui a été approuvée par le comité local de soin et l’utilisation d’animaux à euthanasier la souris.</li>
	<li>Placez la souris dans un plat (avec un diamètre de 10 cm) avec 75 % d’éthanol à stériliser et transférer rapidement dans la hotte. Placez la souris sur une assiette et la broche de la patte avant à l’Office de fixer la position de la souris.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 5 mL, attachée à un 20 G aiguille, en plaçant le biseau de l’aiguille vers le haut à un angle de 30° à 40°, injecter physiologique 5 mL de froid (4-10 ° C) tamponnée au phosphate (PBS) au bas de l’abdomen dans la cavité péritonéale de la souris, en évitant toute perforation de l’intestin. Si l’intestin (ou tout autre organe) est percé, la souris et ses cellules n’est plus utilisable pour des expériences, comme cela peut activer les cellules qui ne sont pas adaptés pour la culture de cellules primaires.</li>
	<li>Effectuer un massage doux sur les deux côtés de l’abdomen de la souris. Ensuite, aspirer le liquide lentement et doucement. Diluer le liquide péritonéal dans un tube à centrifuger 50 mL. Répéter ces étapes 2 x ou 3 x.</li>
	<li>Centrifuger les cellules suspendues pendant 10 min à 400 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 à 8 ° C). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans un milieu RPMI 1640 avec 10 % sérum fœtal (SVF). Compter les cellules non vides. Empiriquement, la densité cellulaire est approximativement égale à 5 x 106 cellules/mL quand les cellules sont remises en suspension dans 10 mL de milieu.</li>
	<li>Ajouter 5 x 106 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pour le dosage de cytométrie en flux et 5 x 105 cellules / puits dans une plaque de 24 puits pour un microscope à fluorescence. La culture des cellules à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % du jour au lendemain. Le milieu de culture peut être actualisé après 3 h pour éliminer les cellules non adhérentes, car la plupart d'entre eux sont des lymphocytes. Les cellules adhérentes sont principalement les macrophages, et elles peuvent adhèrent parfaitement à la plastique de tissu-culture-traitée.</li>
</ol>3. dosage de phagocytose macrophage à l’aide de la microscopie à fluorescence
<ol><li>Observer des cellules au microscope lumineux-zone pour évaluer la viabilité des cellules et la densité cellulaire.</li>
	<li>Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Ajouter 100 µL de milieu de culture frais et 10 µL de la suspension bactérienne (environ 2 x 107 cellules) dans chaque puits comme décrit dans le tableau 1. Incuber pendant 1 heure dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.</li>
	<li>Laver délicatement 3 x x-5 avec 500 µL de PBS froid / puits pour laver les bactéries noninternalized.</li>
	<li>Incuber les cellules avec 4 % de formaldéhyde dans du PBS à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les cellules fixes 3 x avec du PBS (500 µL/puits).</li>
	<li>Ajouter 200 µL de la fluorescence de la phalloïdine 633 teindre conjugué solution de travail (voir Table des matières) pour colorer l’actine-F. Conserver dans un endroit sombre et humide (60-80 %) à température ambiante pendant 60 min. rincer les cellules 3 x avec du PBS (500 µL/puits) pour enlever tout excès phalloïdine. Par coloration de l’actine-F, le cytoplasme peuvent être esquissées et aider à distinguer les bactéries intériorisées.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de solution de travail DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) (1 µg/mL) pour souiller le noyau de la cellule et incuber pendant 5 min dans un endroit sombre et humide à température ambiante. Rincez 1 x avec du PBS (500 µL/puits) et 1 x avec le même volume d’eau distillée. Ensuite, les cellules sera prêts pour l’observation sous un microscope à fluorescence inversé.</li>
</ol>4. dosage de phagocytose macrophage utilisant l’écoulement cytometry
<ol><li>Pour minimiser les erreurs expérimentales et faire une interprétation correcte des résultats, définir les groupes et contrôler les tubes pour l’expérience telles qu’énumérées dans le tableau 2.<ol>
<li>Pour le groupe témoin, qui sera mis sur la glace (groupe de 4 dans le tableau 2), retirer le support de la plaque de 6 puits et lavez-le 1 x avec du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans le tube et placez-le sur la glace pendant 1 h.</li>
		<li>Pour les autres groupes, enlevez le milieu de culture. Ajouter 1 mL de milieu frais dans chaque puits. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans les puits selon le paramètre de groupe, tel que décrit dans le tableau 2. Ensuite, placez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour étancher la fluorescence de la noninternalized e. coli, ajouter 200 µL de solution d’eau de 0,8 % cristal violet (CV) dans le puits et se balancent sous peu, évitant ainsi un résultat faussement positif par la liaison exprimant EGFP e. coli à la surface de la macrophages mais pas intériorisé. Laver les cellules 3 x avec PBS pour enlever n’importe quel CV résiduelle.</li>
	<li>Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de PBS pour remettre en suspension les cellules. Ajouter 5 µL d’anticorps F4/80-PE-conjugué (un antigène de surface exprimé sur les macrophages de souris) dans les tubes ou isotype IgG2a-PE d’usage, selon le paramètre de groupe. Vortex brièvement et incuber les échantillons sur la glace pendant 5-10 min à l’obscurité.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS dans chaque tube et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant. Remettre en suspension les granules cellulaires avec 200 à 300 µL de PBS pour analyse en cytométrie en flux. Exécutez chaque tube et acquisition de données au moins 10 000 événements de cellules F4/80+ .</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUMO-EGFP, la protéine de f...

Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules1.
Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer par rapport à que dans le jeune corps2,3. Ici, nous allons démontrer une méthode pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux d’young (huit semaines) et les personnes âgées (16 mois) souris aide exprimant EGFP e. coli, qui est pratique, rapide et rentable.
L’utilisation d’une souche exprimant EGFP e. coli est un des avantages de ce test, car ces bactéries sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte, même après que les macrophages sont fixés par la paraformaldéhyde à 4 % (p/v). En outre, en utilisant l' exprimant EGFP e. coli, les chercheurs n’ont pas besoin de coloration plus loin après la phagocytose, qui fait gagner du temps. En outre, les macrophages sont immunoresponsive pour l’antigène de surface d’e. coli , ce e. coli davantage adapté pour le dosage de la phagocytose que d’utiliser les champignons exprimant EGFP ou perles marqué à la fluorescéine.
Avec exprimant EGFP e. coli, un dosage de phagocytose peut être facilement réalisé en 2 h et mesuré par les deux microscopie écoulement cytometry et fluorescence, selon le but du chercheur. Étant donné que cette méthode permet de mesurer directement la capacité phagocytaire, les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.
Cette méthode a également été validée dans une lignée de cellules RAW264.7 et des cellules mononucléaires de sang périphérique humain4. Le texte ci-dessous fournit les instructions détaillées pour la réalisation de cet essai et met en évidence les étapes critiques que les chercheurs peuvent modifier pour répondre aux besoins de leurs expériences.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences-Biotine</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-souris CD16/32 Anticorps Biolegend</td><td></td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Système d’expression de la protéine</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Service de synthèse de gènes personnalisé</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE Anticorps anti-souris pour FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp ; Microscope inversé</td><td>Leica</td> <td>Microsystems-PE</td><td></td></tr> <tr><td>Rat IgG2a, &kappa ;-contrôle des isotypes</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 633 solution de travail conjuguée à colorant de fluorescence</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycolate medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant amélioré fluorescence verte exprimant protéines escherichia coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.

Le vecteur de pET-SUMO utilise un modificateur d’ubiquitin-comme petit pour permettre l’expression des protéines natives dans le e. coli. Fusion de SUMO peut considérablement améliorer la solubilité EGFP, lui permettant d’être détecté facilement. Si l’expression EGFP est induite avec succès en lactose, vous peuvent observer des colonies vertes dans l’obscurité (Figure 1 a). Les points verts, qui représentent l' exprimant EGFP e. coli, peuven...

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Ce protocole a démontré une méthode simple et producible pour évaluer la capacité de phagocytose des macrophages utilisant Escherichia coli EGFP-exprimant. Bonjour, je m’appelle Jun-Yu du Deuxième Hôpital de l’Université Médicale de Dalian. Aujourd’hui, nous allons vous montrer un facile et visualiser la façon d’évaluer la phagocytose macrophage qui peut être facilement fait en moins de deux heures.Cette méthode a été employée couramment dans l’étude de la fonction immunisée innée. On croit que la fonction immunitaire innée est restée intacte chez les personnes âgées. Aujourd’hui, nous allons donc isoler les macrophages péritonéaux des souris âgées et jeunes et voir la capacité phagocytique de ces deux groupes.Eh bien, commençons. Tout d’abord, synthétiser le fragment du gène EGFP et cloner le fragment à l’aide de polymése d’ADN Taq haute fidélité. Ensuite, ligate le produit PCR dans le vecteur pET SUMO.Troisièmement, transformer les produits de ligature en souche E.coli et induire l’expression EGFP avec du lactose. Ces E.coli exprimant l’EGFP ont servi de marqueur pour l’essai de phagocytose. Ensuite, un macrophages péritoine de souris ont été isolés et cultivés.Puis, e.coli exprimant l’EGFP ont été inventés avec les macrophages pendant une heure à 37 degrés centigrees. Après l’étape d’assaisage, les macrophages étaient prêts pour l’évaluation par microscope de fluorescence et cytomètre d’écoulement. Synthétiser le fragment du gène EGFP et amplifier le fragment à l’aide d’amorces avant et arrière à l’aide d’une polymése d’ADN Taq haute fidélité.Pour s’assurer que les produits PCR avaient un seul surplomb d’adénine à trois extrémités pour le clonage TA dans l’étape suivante, une extension de 30 minutes à 72 degrés centigrees après le dernier cycle est recommandée. Vérifiez le produit PCR par électrophorèse gel agarose. Si le fragment a été amplifié correctement, une bande de 717 bp peut être observée sur le gel.Clonez le produit PCR dans le vecteur pET SUMO en utilisant la méthode de clonage TA avec ligase d’ADN T4. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter cinq microlitres de produit PCR dans 100 microlitres de cellules compétentes BL21.La chaleur choque les cellules à 42 degrés centigrees pendant 90 secondes, puis garder le mélange sur la glace pendant trois minutes. Ajouter 400 microlitres de LB moyen, préchauffé à 37 degrés centigrans. Secousses d’une heure à 37 degrés centigrans et 120 rpm.Inoculer les bactéries à la surface de la plaque LB avec 100 microgrammes par kanamycine millilitre pour filtrer l’E.coli transformé par vecteur. Incuber la plaque dans le four à 37 degrés centigrans pendant la nuit. Le lendemain, inoculer une colonie positive en cinq millilitres de médias LB avec 100 microgrammes par kanamycine millilitre.Incuber dans l’incubateur de secousses de 37 degrés à 120 rpm pendant deux heures. Ajouter ensuite le lactose inducteur à une concentration finale de 0,5 millimole par litre et continuer à secouer six heures, induisant l’expression EGFP. Empiriquement, en secouant six heures, l’OD600 peut atteindre 0,7 ou plus.Enfin, à l’aide d’un microscope à fluorescence pour vérifier l’étendue de l’expression EGFP. Ajouter 10 microlitres du milieu de culture bactérienne à une diapositive. Couvrir ensuite d’un bordereau de couverture.Examiner l’expression de l’EGFP au microscope à fluorescence. Ajouter 3,5 grammes de thioglycollate dans 100 millilitres d’eau distillée. Stériliser en autoclave avant utilisation.Aspirer le milieu de thioglycollate dans la seringue stérile d’un millilitre dans le capot. Une souris par seringue pour éviter l’infection. Injectez un millilitre de milieu de thioglycollate de 3,5 % dans la cavité péritonéale de la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 23 et maintenez la souris avec de l’eau et de l’ad libitum alimentaire pendant trois jours.Après trois jours, euthanasier la souris par dislocation cervicale après avoir rapidement induire l’anesthésie par sevoflurane dans une boîte fermée. Ensuite, mettez la souris dans un plat avec 75% d’éthanol pour stériler et transférer dans le capot rapidement. Placez la souris sur la plaque et épinglez la patte avant sur le plateau pour fixer la position de la souris.À l’aide d’une seringue de cinq millilitres avec une aiguille de calibre 20, injecter cinq millilitres de PBS froid au bas-ventre dans la cavité péritonéale de la souris, en évitant de percer l’intestin. Effectuez un massage doux sur les deux côtés de l’abdomen de la souris. Puis aspirer le liquide abdominal doucement et lentement.Distribuez le liquide péritonéal dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Répétez ces étapes deux ou trois fois. Centrifuger les cellules suspendues pendant 10 minutes à 400 g en quatre à huit centigrades.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans rpmi 1640 moyen avec 10% sérum bovin fœtal. Ajoutez cinq millions de cellules dans chaque puits de la plaque de six puits pour l’analyse de cytométrie d’écoulement et 500 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits pour le microscope à fluorescence. Culture des cellules à 37 degrés centigrans dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit.Le milieu de culture peut être rafraîchi après trois heures pour enlever les cellules nonherent parce que la plupart d’entre eux étaient des lymphocytes. Observez les cellules sous un microscope à champ lumineux pour évaluer la viabilité cellulaire et la densité cellulaire. L’image montrée ici était dans l’état normal de la cellule primaire.Habituellement, la densité cellulaire de macrophage n’était pas élevée, parce que la partie principale des cellules péritonéales était lymphocytes. Retirer le milieu de culture de la plaque de 24 puits. Ajouter 100 microlitres de culture fraîche moyenne et 10 microlitres de milieu bactérien.Puis incuber la plaque à 37 degrés centigrans dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant une heure. Lavez doucement avec 500 microlitres de PBS froid par puits trois à cinq fois pour éliminer les bactéries non intériorisées. Incuber les cellules avec 4% de formaldéhyde dans PBS à température ambiante pendant 30 minutes.Lavez les cellules avec PBS trois fois. Ajouter la phalloidine 633 conjuguée solution de travail pour tacher F-actin. Conserver dans un endroit sombre et humide à température ambiante pendant 60 minutes.Ajouter la solution de travail DAPI pour tacher la cellule nucléaire et incuber pendant cinq minutes dans un endroit sombre à température ambiante. Rincer une fois avec PBS et une fois avec le même volume dans de l’eau distillée. L’E.coli exprimant l’EGFP affiché en vert a servi de marqueur de phagocytose.Pour minimiser les erreurs expérimentales et faire une interprétation correcte des résultats, définissez des groupes et des tubes de commande pour l’expérience telle qu’elle est énumérée dans le tableau 2. Pour le groupe témoin qui sera placé sur la glace, retirez le milieu de la plaque de six puits et lavez-le avec du PBS une fois. Ajouter ensuite 70 millimole par litre d’EDTA froid d’un millilitre dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie d’écoulement.Ajouter 50 microlitres de suspension bactérienne dans le tube et le placer sur la glace pendant une heure. Pour les autres groupes, retirer le milieu de culture, ajouter un milieu frais millilitre dans chaque puits. Ajouter 50 microlitres de suspension bactérienne dans les puits selon le réglage du groupe tel que décrit dans le tableau deux.Ensuite, placez la plaque de six puits dans l’incubateur de 37 degrés centigrees 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Pour étancher la fluorescence d’E.coli non intériorisé, ajoutez 200 microlitres de solution d’eau violette cristalline de 0,8 % dans le puits et balancez-vous sous peu. Cette étape visait à éviter un résultat faussement positif par la liaison EGFP E.coli à la surface des macrophages mais non intériorisée.Lavez les cellules avec PBS trois fois pour enlever toute violette cristalline résiduelle. Ajouter ensuite 70 millimole par litre d’EDTA froid d’un millilitre dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie d’écoulement. Centrifugeuse les tubes 2000 rpm cinq minutes et jeter le supernatant.Ajouter 100 microlitres de PBS pour résuser les cellules. Ajouter cinq microlitres d’anticorps conjugués F4 ATP dans les tubes ou l’isotype selon le réglage du groupe. Vortex brièvement et incuber les échantillons sur la glace pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité.Ajouter un millilitre de PBS dans chaque tube et centrifugeuse 2000 rpm cinq minutes. Jeter le surnatant. Resuspendez les granulés cellulaires avec 200 à 300 microlitres de PBS pour l’analyse de cytométrie de flux.Exécutez chaque tube et obtenez des données pour au moins 10 000 événements de cellules F4/80 positives. Voici les images de fluorescence des macrophages péritonéaux des groupes jeunes et âgés. La fluorescence rouge représente la F-actine.Le vert représente E.coli exprimant l’EGFP, et le bleu représente le noyau taché par DAPI. Ces images suggèrent que les macrophages de la jeune souris avaient une capacité phagocytique plus forte que ceux de la souris âgée. Les cellules F4/80-positives et EGFP-positives ont indiqué la capacité phagocytique des macrophages.Ces résultats sont conformes à la tendance des résultats du microscope à fluorescence. Eh bien, vous voyez, bien que le nombre de cellules immunitaires innées peut préservé chez la souris âgée, la capacité phagocytique a diminué de façon significative par rapport à la jeune souris. De nombreuses méthodes ont été utilisées pour évaluer la phagocytose macrophage.Ici, nous démontrons une méthode améliorée qui est pratique, rapide et économiquement faisable. Avec E.coli exprimant l’EGFP, un essai de phagocytose peut être facilement exécuté et mesuré par le cytomètre d’écoulement et le microscope fluorescent selon les préfère du chercheur. Aussi cette méthode mesure directement la capacité phagocytique.Les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.

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Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

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