Name: לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: למדו פרוטוקול זיהום בחסרי חוליות באמצעות Galleria mellonella לחקר קנדידה מופצת. שיטה זו מאפשרת הערכת וירולנטיות זנים ותפקיד גנים בזיהום בצורה אתית ויעילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה להכיר בסיוע ווושינגטון פמלה אנדרסון לאה בהשגת Galleria mellonella לשימוש במחקר זה.

כל השיטות המתוארות מסתמכים על שימוש של המארחים הגעה, אינם דורשים טיפול בעלי חיים מוסדיים אישור ועדת להשתמש (IACUC).
1. הזחלים Waxworm גלריה (galleria) mellonella
<ol><li>סדר הזחלים סיטונאים וספקים זה לא להציג את הורמונים, אנטיביוטיקה או טיפולים אחרים לזחלים, אשר מסוגלים יצורים חיים כאלה עושים משלוחים.<ol>
<li>הקפד לרכוש כל הזחלים מאותו הספק במהלך הקורס של ניסויים. היה זהיר בעת הזמנת הזחלים בחודשי הקיץ כפי בטמפרטורה גבוהה מ- 30 מעלות צלזיוס להקטין את הכדאיות הזחלים.</li>
		<li>לפקח על הטמפרטורות על פני המסלול המשלוח הצפוי, בהתאם לתוכנית משלוחים או לבחור משלוח מזורז כדי לצמצם את חשיפתם לתנאי הסביבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר הזחלים מגיעים, לבדוק לכל מכולה כדי להבטיח הזחלים קיימא, בריא נוכחים. הזחלים בריא לגמרי מתחת לפני המים מתחת המצעים, זז, ושולט על הגיוון אור צהוב/טאן עם הזחלים כמה כתמים שחורים או כתמי לאורך הגוף הכוללת.</li>
	<li>לאחסן הזחלים שלהם מיכל בחלל מאוורר בטמפרטורת החדר (25 ° C). תלוי במצבו הראשוני של הזחלים, הם עשויים לשמש עד שבועיים.</li>
</ol>2. תרבות לקראת זיהום Galleria mellonella
הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.
<ol><li>להפוך שמרים peptone דקסטרוז פלטות אגר של נוזלים (YPD). להכין 1-פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ו- 70% אתנול פתרונות.</li>
	<li>גדלים זנים אלביקנס ג כדי להיות מוזרק ללון ב- 3 מ"ל של טרי YPD צינורות תרבות רגיל על תוף מסתובב במהירות בינונית ו 30 ° C.</li>
	<li>ספין תאים למטה-2,500 g x עבור 5 דקות ומפרידה שולחן. יוצקים את תגובת שיקוע, נזהר שלא להפריע בגדר התא.<ol>
<li>Resuspend התאים באופן מלא ב- 5 מ של PBS 1 x על-ידי pipetting חוזרות או vortexing. חזור על צנטריפוגה ו resuspension של תאים ב- PBS עוד פעמיים, כדי להבטיח הסרה של כל תרבות המדיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שטיפה סופית, resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ומעבירים אותם אל צינור microcentrifuge.</li>
	<li>לנהל קבוצה של דילולים סדרתי ב- PBS לייצר בטחונות, 1:1, 000, וסדרות דילול כוללות. הערה: דילולים אלטרנטיבית עשוי להיות צורך להגיע ספירת הרצוי.<ol>
<li>שימוש של hemocytometer, לספור תאים של בטחונות או דילול 1:1,000. לרוב, דילול 1:1,000 מספק שהתא המתאים נחשב אלביקנס ג תרבויות.</li>
		<li>חישוב ריכוז מוחלט של תאים בתוך התרבות הראשונית באמצעות המתמטיקה רשת של hemocytometer, מכוון בין 30-300 תאים להיספר ברשת 5 x 5 מרכזי. מונה הניתן תא אוטומטיות עשוי לשמש כחלופה; עם זאת, השימוש צפיפות אופטית כדי לקבוע תא ספירת אינה מומלצת, כמו מורפולוגיה תאים (גודל, צורה, וכו ') יכולים להשפיע באופן משמעותי על רמת הדיוק שלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שימוש הסעיפים תא נמדד, גורם לדילול חדש 2.5x107 תאים למ"ל ב- PBS x 1 צינור microcentrifuge. דילול זה ישמש כבסיס עבור כל חיסון של mellonella ג עם ג אלביקנס. כל זריקה ידרוש 10 µL של inoculum זה עבור מנה זיהומיות של 250,000 אלביקנס ג תאים.</li>
	<li>לאשר דיוק המינון זיהומיות על ידי ציפוי הנפח הנכון של דילול כוללות עבור 100 יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) על אגר YPD עבור כל תרבות שיש להשתמש בה זיהום.</li>
	<li>תקופת דגירה תא לוחות ספירת מהשלב 2.7 של 48 שעות (h) ב 30 מעלות צלזיוס, לספור את מספר מושבות לכל צלחת. בין 80 ל-120 מושבות מהווה טווח מקובל על רמת הדיוק inoculum.</li>
</ol>3. זיהום של הזחלים Galleria mellonella עם תרבויות קנדידה
הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל אתנול 100% ו- 1 מ"ל של 1 x PBS שני צינורות microcentrifuge נפרדים. אתנול וביו -PBS ישמש כדי לשטוף את המחט הזרקת בין זיהומים.</li>
	<li>מורחים כמות קטנה של waxworm מצעים בשנת ריקה, פטרי סטריליות 100 x 15 מ מ, שיכיל את הזחלים בעקבות חיסון עבור כל זן עצמאי. תוספת של המצעים מגביל את דבקותה של המלח mellonella ג הזחלים השטח פטרי.</li>
	<li>לחטא G 26, מזרק µL 10 על-ידי לקיחת expunging µL 10 של אתנול 70% שלוש פעמים ואחריו שלושה שוטף עם µL 10 ל- 1 x PBS. מערבולת דילול חיסון אלביקנס ג ו תופסות 10 µL של התרבות. ודא כי ישנם אין בועות אוויר בתוך המזרק הזרקת אוויר מקדמת את המוות, תגרום לסיבוך בניתוח במורד הזרם.</li>
	<li>פתח, מיכל הזחלים mellonella ג , בזהירות להתהפך מצעים עם אצבע לחשוף את הזחלים. בחר הזחלים שהם במצב בריאותי טוב כפי שזוהו פעיל תנועה, צבע צהוב/טאן אור ועל חוסר פיגמנטציה שחורה בגוף הזחלים. לרוות כאלה צריך להיות גודל דומה על פני המלא ניסיוני מוגדר.</li>
	<li>לאסוף את הזחלים יחיד והחזק אותו בעדינות בין אינדקס/האצבע והאגודל דומה מחזיק בעיפרון. לגלגל את הזחלים על גבו אז הרגליים פונות מעלה. החזק באורך מלא של הגוף בין האצבעות והאגודל כך הזחלים אינו מסוגל קורל או. לעזוב הזריקה. הערה: אם רצונך בכך, לעקר את האתר של הזרקת באמצעות מקלון צמר גפן ספוג אתנול 100%.</li>
	<li>לסובב את המזרק כך השיקוע של המחט פונה למעלה ולהוסיף לאט לאט את קצה המחט כולל את האורך של השיקוע לתוך הגוף בצומת עם רגל שמאל rearmost. ודא המחט חודר לתוך הגוף לא פשוט לוחצים על הגוף של פנימה הזחלים. ואל תשתמש בכוח לחדור לגוף כמו המחט עלולה לחדור לגמרי הזחלים במהירות. מרימים בעדינות עם המחט יאשר חדירה המתאים. להזריק את inoculum קנדידה µL מלא 10 ולחלץ את המחט.</li>
	<li>חזור על צעד 3.3-3.5 כל הזחלים. כדי למנוע תא להתיישב, מערבולת קנדידה תרבויות עבור חיסון אחרי כל זריקה שלישית. כפקד, להחדיר ערכה של mellonella ג µL 10 ל- 1 X PBS.</li>
	<li>10 בית משותף הזחלים מוזרק מן התרבות קנדידה זהה בכל צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ בעקבות חיסון. דגירה הזחלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה ימים, בדיקת הזחלים כל 24 שעות כדי לעקוב אחר המוות.<ol>
<li>להעריך את התמותה בתחילה על ידי פיגמנטציה החשוך, היווצרות של כתמים שחורים או גופים, וחוסר תנועה. כדי לאשר התמותה, השתמש פינצטה כדי לגלגל בעדינות אדעך הזחלים על הגב שלהם ולעקור בקלילות התחתון של הזחלים עם הפינצטה. אי-היענות כפי שנצפה על ידי חוסר תנועה הגוף או רגל גלוי סאמפלרים כמוות, הזחלים יוסרו הפטרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לתעד את הזחלים התמותה במרוצת הזמן. הזחלים להתחיל pupate לתוך עש ניתן לכלול הניתוח אך יש להסיר אם הם מתחילים הנשירה. יכול להיות צנזורה הזחלים מאבריה מניתוח נקודת הקצה כמו ההבדלים התקפה אלימה בין הזחלים גולם אינם ברורים.</li>
	<li>להעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן סטטיסטי האח-קוקס.</li>
</ol>

<ol><li>Kauffman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+multicenter+surveillance+study+of+funguria+in+hospitalized+patients.+The+National+Institute+for+Allergy+and+Infectious+Diseases+%28NIAID%29+Mycoses+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group.</a> Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).</li>
<li>Horn, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+candidemia+in+2019+patients%3A+data+from+the+prospective+antifungal+therapy+alliance+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry.</a> Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+invasive+candidiasis%3A+a+persistent+public+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem.</a> Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).</li>
<li>Segal, E., Frenkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+in+Vivo+Models+of+Candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Experimental in Vivo Models of Candidiasis.</a> J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).</li>
<li>Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).</li>
<li>Heymann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+siderophore+iron+transporter+of+Candida+albicans+%28Sit1p%2FArn1p%29+mediates+uptake+of+ferrichrome-type+siderophores+and+is+required+for+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).</li>
<li>Priest, S. J., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Virulence-Related+Phenotypes+in+Candida+Species+of+the+CUG+Clade%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade.</a> Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).</li>
<li>Savage, D. C., Dubos, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+indigenous+yeast+in+the+murine+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Localization of indigenous yeast in the murine stomach.</a> J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).</li>
<li>Ewbank, J. J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+model+host+and+tool+for+antimicrobial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).</li>
<li>Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+virulence+of+Candida+albicans+transcription+factor+mutants+using+Galleria+mellonella+and+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 367(2015).</li>
<li>Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Galleria+mellonella+as+a+model+organism+to+study+Legionella+pneumophila+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50964(2013).</li>
<li>Jacobsen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+virulence+of+Candida%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida.</a> Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).</li>
<li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li>
<li>Hirakawa, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+intra-species+variation+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans.</a> Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).</li>
<li>Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+accompanies+gene+family+expansion+of+MED2+homologs+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans.</a> PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).</li>
<li>Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluconazole+Pharmacokinetics+in+Galleria+mellonella+Larvae+and+Performance+Evaluation+of+a+Bioassay+Compared+to+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Hemolymph+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).</li>
<li>Mesa-Arango, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-mammalian+host+Galleria+mellonella+can+be+used+to+study+the+virulence+of+the+fungal+pathogen+Candida+tropicalis+and+the+efficacy+of+antifungal+drugs+during+infection+by+this+pathogenic+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Mycol%22%5BJournal%5D)">The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast.</a> Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+using+Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis.</a> Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).</li>
<li>Kavanagh, K., Fallon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+larvae+as+models+for+studying+fungal+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence.</a> Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).</li>
<li>Legrand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygosity+at+the+MTL+locus+in+clinical+strains+of+Candida+albicans%3A+karyotypic+rearrangements+and+tetraploid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation.</a> Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).</li>
<li>Lockhart, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Candida+albicans%2C+white-opaque+switchers+are+homozygous+for+mating+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type.</a> Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).</li>
<li>Miller, M. G., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White-opaque+switching+in+Candida+albicans+is+controlled+by+mating-type+locus+homeodomain+proteins+and+allows+efficient+mating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating.</a> Cell. 110 (3), 293-302 (2002).</li>
<li>Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygosity+of+genes+on+the+sex+chromosome+regulates+Candida+albicans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence.</a> Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).</li>
<li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRE5+gene+null+mutant+strains+of+Candida+albicans+are+avirulent+and+have+altered+cell+wall+composition+and+hypha+formation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties.</a> Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).</li>
<li>Hall, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mnn2+mannosyltransferase+family+modulates+mannoprotein+fibril+length%2C+immune+recognition+and+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276(2013).</li>
<li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li>
<li>Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+in+Galleria+mellonella+hemocytes%3A+identification+of+proteins+homologous+to+the+NADPH+oxidase+complex+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).</li>
<li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Sequence+of+Galleria+mellonella+%28Greater+Wax+Moth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth).</a> Genome Announcements. 6 (2), (2018).</li>
<li>Krappmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lightning+up+the+worm%3A+How+to+probe+fungal+virulence+in+an+alternative+mini-host+by+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence.</a> Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).</li>
<li>Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+Candida+auris%3A+%27new+kid+on+the+block%27+in+hospital-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections.</a> Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).</li>
<li>Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+a+Gaussia+princeps+Luciferase+reporter+system+in+Candida+albicans+for+in+vivo+detection+in+the+Galleria+mellonella+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model.</a> Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המודל waxworm mellonella ג עומד ככלי יעיל עבור ניתוח לשחזור וברכבות של התקפה אלימה אלביקנס ג . פרוטוקול מפורט זה נשענת על משלוח עקבי של מנה זיהומיות מוגדר לאותו אתר ברחבי אוסף של הזחלים. מינון זיהומיות יש השפעה עמוקה על התמותה mellonella ג ואילו השימוש הזחלים שלהם ההגעה הראשונית בין 10 ימים בעקבות קבלת הפיק תוצאות דומות. אובדן של albicansMTL ג אלל תוצאות התקפה אלימה ירידה עקבית עם הקודם ניסויים בעכברים למרות שיבוש אלל α MTLלא תשנה את הזחלים מוות.
<p class=...

קנדידה המינים נפוצים commensals אדם המסוגלים מתעוררים כמו פתוגנים אופורטוניסטים ב immunocompromised קשות ומטופלים dysbiotic. למרות קנדידה מינים רבים יכולים לגרום למחלות, ג אלביקנס הוא הגורם הנפוץ ביותר של קנדידה המופץ1,2. מחלה מערכתית נובעת אלביקנס ג גישה לזרם הדם דרך גם חדירה ישירה של מחסומי מארח קודם לכן מגבילים או מבוא-אתרי כירורגי ולפרצות אחרות של גוף3. קנדידה מינים לנצל מגוון של תהליכים פתוגניים לגרום למחלה מערכתית בתוך המארח כולל filamentation, ביופילמים, התחמקות תא החיסון ואת הבריחה של ברזל ניקוי4. גישות במבחנה לחקור מנגנונים פתוגניים בודדים, אך מודלים חייתיים לספק את האפשרות הטובה ביותר לחקור את מכלול של המחלה התוצאה5,6. מחקרים קודמים מפורטות מקרים רבים של המבטיח במבחנה חקירות של התקפה אלימה נכשל להתרבות ויוו7,8. לפיכך, מודלים בעלי חיים נדרשים עדיין להעריך התקפה אלימה ויוו. רוב הדגמים המחלה להסתמך על עכברים לשמש פונדקאית עבור זיהומים האדם למרות חוסר אלביקנס ג ליישב באופן טבעי מערכות מאתר כמו commensal9. הגעה מודלים של קנדידה המופץ כוללים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, הפרי לטוס דרוזופילה melanogaster, את waxworm mellonella גלריה (galleria), למרות חששות לגבי ההבדלים הבסיסיים ב. אנדרופינים, חום הגוף המארח והנתיבים של חשיפה יש הקשו שלהם הסכמה רחבה10,11.
לאחרונה, המודל זיהום mellonella ג waxworm אומץ כדי דגם פתוגניות של מגוון רחב של חיידקים ופטריות פתוגנים12,13,14. היתרונות של מודל זה כוללים שלה בעלות נמוכה יחסית, עלתה התפוקה, להקל על השימוש, להפחית חששות אתיים לגבי בעלי חיים בחסד לעומת מודלים מאתר. לחוקרים, זה מיתרגם יכולת מוגברת כדי לבדוק מרובות משתנים מרווחי ביטחון חזקה יותר, מהירה יותר ניסויים, מעקף של פרוטוקולים בעלי חיים. Mellonella ג שימש כפלטפורמה להעריך במהירות אלביקנס ג התקפה אלימה בעקבות ההפרעות של גנים הדרושים עבור biofilm היווצרות filamentation, ג'ין רגולציה על פני מבודד קלינית11,15 ,16. מחקרים שנעשו לאחרונה שילבו החקירה של פטריות יעילות שימוש mellonella ג כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של פעילות סמים והתנגדות תחת ויוו הגדרות, שהן מאתגרת אחרת, זמן רב 17,18. ובכל זאת, מחקרים של התקפה אלימה אלביקנס ג ב mellonella ג יש כבר מורכב על ידי רמות גבוהות הדיווחים של וריאציה בתוך ניסויים ופרוטוקולים לא עקביים בין קבוצות המחקר המייצרים פנוטיפים התקפה אלימה שונות בין עכברים, waxworms11,13,19,20,21. פה, אנו מכינים mellonella ג פרוטוקול לתקנן אלביקנס ג זיהומים, עלייה הפארמצבטית בניסויים התקפה אלימה, ומדגימים עקביות עם מחקרים שתואר לעיל של התקפה אלימה ב מאתר מודלים.
מחקרים קודמים הראו כי אלביקנס ג ההזדווגות, כמו סוג לוקוס (MTL) בכרומוזום 5 מסדיר תא זהות, הזדווגות כשירות הדומה האפייה ו פטריות אחרות Ascomycete22. הרוב המכריע של אלביקנס ג מבודד משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים- MTL מיקומה, קידוד אחד מכל סוג של MTL ו- MTLα אללים (MTL/α), והם סטרילי כתוצאה מכך15, 23 , 24. אובדן אחד אללים MTL דרך אובדן של heterozygosity (LOH) או מוטציה מוביל homozygous MTL או שמקודדים α MTLיכולות לעבור מתג פנוטיפי מהמדינה 'לבן' סטרילי ההזדווגות המוסמכת המדינה 'אטום'25. העבודות הקודמות הדגישה כי אובדן הטרוזיגוטיות MTL גם מקטין התקפה אלימה במודלים מאתר של זיהום סיסטמי על פני רקעים זן שונה26. כאן, אנו מפרטים לדוגמא קנדידה המופץ באמצעות ערכה ניסוי דומה גנטית כדי לתאר את התרומה הטרוזיגוטיות MTL לאלימות ולגרימת ב mellonella ג mellonella ג . אנחנו מראים MTL תצורה השפיעו אלביקנס ג פתוגניות, איפה MTLα זנים היו פחות ארסית ביחס MTL/αוהן MTL תאים, בדומה לממצאי בתוך זיהום מאתר דגם26.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Snackworms.com</td><td></td><td>קנו פי שניים תולעים מהצפוי לשימוש</td></tr><tr><td>ב-10 uL, דגם 1701 N SYR מחט מלט, 26 גרם, מזרק מסוג 2</td> צלחת פטרי <td>המילטון</td><td>80000</td><td></td></tr>, <tr><td>100X15 מ"מ, 500 חבילות</td><td></td><td>צינור פישר</td> FB0875712 <td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"ל, 500 חבילות</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (דרגת ביוטכנולוגיה), 500 מ"ל</td><td>VWR</td><td>97062-818</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט, &ge; 99.5% טהור, 500 מ"ל</td><td>Millipore Sigma</td><td>EM-EX0276-1S</td><td></td></tr><tr><td>חיטוי ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לדוגמא galleria mellonella waxworm זיהום קנדידה המופץ

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

המינים קנדידה commensals פטרייתי הנפוץ של בני האדם colonizing את העור משטחים הרירית, מערכת העיכול. בתנאים מסוימים, קנדידה יכולה והדבר נישות הטבעי שלהם וכתוצאה מכך מתישה זיהומים הרירית כמו טוב כמו סכנת חיים זיהומים מערכתית, המהווים מוקד מרכזי של החקירה בשל שיעורי התמותה גבוהים המשויך שלהם. מודלים חייתיים של זיהום המופץ קיימות עבור הלומדים התקדמות המחלה, לנתח את המאפיינים של קנדידה פתוגניות. אלה, המודל זיהום waxworm mellonella גלריה (galleria) מספק כלי ניסיוני חסכונית עבור תפוקה גבוהה חקירות של התקפה אלימה מערכתית. רבים אחרים בקטריאליים ו האיקריוטים מדבקים ביעילות נחקרו ב mellonella ג להבין פתוגניות, שהופך אותו מערכת מודל נפוצה ומקובלת. ובכל זאת, וריאציה של השיטה שבה נעשה שימוש כדי להדביק את mellonella ג יכול לשנות תוצאות פנוטיפי ומסבכים פרשנות של התוצאות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות את היתרונות והחסרונות של המודל waxworm ללמוד פתוגנזה קנדידה מערכתית ואף פירוט גישה לשיפור הפארמצבטית. התוצאות שלנו להאיר את הטווח של קינטיקה התמותה ב mellonella ג , לתאר את המשתנים אשר יכול לווסת קינטיקה אלה. בסופו של דבר, שיטה זו ניצבת גישה אתית, מהירה וחסכונית ללמוד התקפה אלימה במודל של קנדידה המופץ.

. הנה, נדגים שיטה ישימה עבור השימוש mellonella ג waxworms לחקור מודל קנדידה המופץ של זיהום באמצעות אלביקנס ג. האחסון המתאים, תחזוקה מבחר של הזחלים זיהום הינם המכריעים של מבטח הפארמצבטית בתמותה mellonella ג (איור 1א'). הזחלים בריא הפעילים, יש צבע צהוב/טן קל, חוסר שחור כתמים על הגוף אמור לשמש עבור מערכת אלה הם בדרך כלל קיימא עבור זיהום עד שבועיים לאחר ההגעה. כדי למזער את ההשפעות שעשויות להיות מבלבלים לפיזיולוגיה m...

Mellonella גלריה (galleria) משמש מודל הגעה עבור המופץ קנדידה. כאן, אנחנו מפרטים את הזיהום פרוטוקול ולספק נתונים התומכים לאפקטיביות של הדגם.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קנדידה על ארסיות המתח ועל התרומות של גנים ספציפיים לתהליכים אלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא נמנעת מחששות לגבי שימוש בבעלי חיים, היא חזקה, מהירה, זולה, ומספקת מספר גבוה של בעלי חיים לכל ניסוי. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו צפויים להיאבק קצת כי הם יתקשו להעריך את הכדאיות תולעת לפני תחילת הניסוי או שאולי יש להם כמה בעיות עם הזרקה לא עקבית של התולעים.הזמינו זחלים מסיטונאים וספקים שלא מציגים הורמונים, אנטיביוטיקה או טיפולים אחרים לזחלים ומצליחים לשלוח ולספק דגימות חיות. כאשר הזחלים מגיעים, לבדוק כל מיכל כדי לאשר את הבריאות ואת הכדאיות של הזחלים. זחלים בריאים יהיו שקועים לחלוטין מתחת למצעים, נעים, ובעלים צבע צהוב, שזוף בהיר עם כמה זחלים המכילים סימנים שחורים או שינויי צבע לאורך הגוף.הזחלים יכולים להיות מאוחסנים במיכלים שלהם בחלל מאוורר בטמפרטורת הסביבה עד שבועיים. כדי להכין את תאי השמרים לזיהום מלונלה גלריה, לגדל את זנים C.albicans להיות מוזרק לילה בשלושה מיליליטר של מרק שמרים טריים פפטונה-דקסטרוז לכל זן בצינורות תרבות סטנדרטית על תוף מסתובב במהירות בינונית ו 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את השמרים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של PBS טריים אחוז צנטריפוגה.לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר ב

the-galleria-mellonella-waxworm-infection-model-for-disseminated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מפתח טכניקות כדי לשמש...

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה...

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

in vivo אינטראקציות מרחביות-זמניות של פתוגן והגנות חיסוניות ברמת הרירית אינן ניתנות להדמיה בקלות במארחים קיימים של בעלי חוליות. השיטה המוצגת כאן מתארת פלטפורמה רב-תכליתית לחקר קנדידה רירית בבעלי חוליות חיים תוך שימוש בכיס השחייה של דג הזברה הצעיר כאתר זיהום.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

אנו מבססים מודל עכברי של זיהום הקשור לצנתר C.albicans (CRI), שבו נוצר ביופילם על הצנתר, והאינטראקציה בין C.albicans למארח מתואמת היטב עם CRI הקליני. מודל זה מסייע לסנן טיפולים עבור CRI הקשור לביופילם של C.albicans , ומניח בסיס לשינוי קליני.

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

מחקר זה מציג מסגרת מתוקננת לאופטימיזציה של מודלים של זיהום G. mellonella לשימוש בהערכה אנטי-מיקרוביאלית פרה-קלינית. יישום מודל G. mellonella כחלק מצנרת פיתוח אנטי-מיקרוביאלית פרה-קלינית עשוי להפחית את מספר התרכובות הלא יעילות המתקדמות לניסויים קליניים.

Galleria mellonella כמודל סינון אנטי-מיקרוביאלי

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

למדו פרוטוקול זיהום בחסרי חוליות באמצעות Galleria mellonella לחקר קנדידה מופצת. שיטה זו מאפשרת הערכת וירולנטיות זנים ותפקיד גנים בזיהום בצורה אתית ויעילה.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

גלה סרטונים נוספים