Name: 通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶB細胞から形質細胞への分化モデル。多段階培養系を用いてin vivoの分化段階と転写変化を再現し、オープンアクセスのバイオインフォマティクスツールでデータ解析を支援する。免疫学研究に有用なプラットフォームを提供する。

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この作品はフランスのインカ (Institut 国立デュがん) からの助成金によって支えられた研究所 (PLBIO15-256)、ANR (ネクタイ スキップ)、機械がん (ミリ ・ TT)。

ヘルシンキ宣言と生物資源のモンペリエ大学病院センターの契約に基づきガイドラインをプロトコルに従います。
1. 培養正常形質細胞分化のモデルで
注:Pc は、4 つのステップ文化11,12,13を通じて生成されます。
<ol><li>
B 細胞の増幅と分化
	<ol>
<li>記憶 B 細胞の浄化のための健常人末梢血細胞を使用します。</li>
		<li>RPMI 1640 媒体の 24.5 ml 血の 7.5 mL を希釈します。</li>
		<li>部屋の温度密度勾配 (例えば、Ficoll) の 12.5 mL を滅菌 50 mL の円錐管に追加します。優しく 32 ml 希釈血液の密度勾配をオーバーレイします。2 段階の混合を最小限に抑えます。</li>
		<li>ブレーキ 500 x gで 20 分間遠心分離機のオフ。希薄プラズマ/密度勾配インターフェイスから、PBMCs を収集し滅菌 50 mL のチューブにセルを配置し、ハンクの平衡塩溶液と 45 mL に完了します。</li>
		<li>500 × gで 5 分間細胞を遠心します。慎重に上澄みを除去し、ペレットを維持します。</li>
		<li>500 x gで RPMI1640/10% 牛胎児血清 (FCS) の遠心 5 分 45 mL を加えます。慎重に上澄みを除去し、ペレットを維持します。PBS/2% FCS の 30 mL を追加します。</li>
		<li>
CD2 + 抗 CD2 磁気ビーズを使用してセルを削除します。1 つのターゲット細胞の 4 ビーズを追加します。4 ° C で 30 分間加温します。
		<ol>
<li>磁石を用いた細胞分離用非連結の細胞から別のビード区切セルです。非連結の細胞を収集し、抗 CD19 APC、CD27 PE 抗体抗と細胞ペレット 4 ° C (106細胞の抗体の 2 μ L) で 15 分間インキュベートします。</li>
			<li>PBS/10% ヤギ血清で 2 回洗います。</li>
			<li>FSC と SSC のプロットに汚染のイベントを削除します。FSC A 対 SSC、FSC H 対 SSC H プロットの残骸を削除し、選択総末梢血白血球ポピュレーションのシングレットをプロットします。CD19/CD27 と CD19 メモリー B 細胞を選択+CD27+。</li>
			<li>95% の高純度で、セルソーターを用いた MBCs を浄化します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>50 mg/mL ヒト トランスフェリンと 5 ミリグラム/ml ヒトインスリンを添加した IMDM と 10 %fcs を使用してすべての文化手順に従います。</li>
		<li>
プレート 6 ウェル培養皿に MBCs を精製した (1.5 x 105 5 mL/よく MBCs/mL)、IL-2 との 4 日間 (20 U/mL)、IL-10 (50 ng/mL) と IL 15 (10 ng/mL)。
		<ol>
<li>ホスホロチオエート CpG ODN 2006 年ヒスチジン付けられた遺伝子組換えひと可溶性 CD40L を追加 (sCD40L; 50 ng/mL) と反 polyhistidine mAb (5 mg/mL) MBCs 活性化 (図 1)。低い増幅12に同じサイトカイン カクテルだけで sCD40L または ODN による活性化をもたらします。最大数を鉛でここで説明されている活性化シグナルの組み合わせには、B 細胞と PrePBs11,12 (図 1) がアクティブ化されます。</li>
			<li>遺伝子発現プロファイルの浄化 CD38/CD20-- PrePBs、日 4、セルソーター (図 2) を用いたします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
:Hiv 細胞の生成
	<ol>
<li>4 日目でのセルをカウントします。</li>
		<li>2 mL の 105/mL × 2.5 で 12 ウェル培養皿の細胞をプレート/まあ。</li>
		<li>CpG オリゴヌクレオチドと sCD40L の取り外しと新しいサイトカイン カクテル IL-2 を含むと新しい培養液の添加による分化を誘導する (20 U/mL)、IL-6 (50 ng/mL)、IL-10 (50 ng/mL) と IL 15 (10 ng/mL) (図 1)。37 ° C で (日 4 日 7) から 3 日間の培養細胞</li>
		<li>遺伝子発現プロファイルの浄化 CD38+/CD20- PBs、日 7、セルソーター (図 2) を用いたします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
初期のプラズマ細胞の生成
	<ol>
<li>7 日のセルをカウントします。</li>
		<li>2 mL に 5 × 105/mL で 12 ウェル培養皿の細胞をプレート/まあ。</li>
		<li>新鮮な培養液を用いた IL 6 初期の Pc で PB を区別する (50 ng/mL)、IL 15 (10 ng/mL) とインターフェロン α (500 U/mL) 37 ° C で 3 日間遺伝子発現プロファイルの CD20 を浄化する-/CD38+/CD138+初期 Pc で 10 日、セルソーター (図 2) を用いたします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
長命の形質細胞世代
	<ol>
<li>培養条件を変更することによって、長い間住んでいた Pc に初期 Pc を区別します。</li>
		<li>2 mL に 5 × 105/mL で 12 ウェル培養皿の細胞の培養/よくまたは 1 mL/37 ° C で 24 ウェル培養皿で il-6, 間質細胞を使用してエアコン中と 4 月 (200 ng/mL)。</li>
		<li>培地に 5 日間の間質細胞を培養によって間質細胞調節された媒体を取得します。間質細胞培養上清 (0.2 μ m) をフィルターし、フリーズします。</li>
		<li>毎週更新で PC 文化に間質細胞調節されたメディアの 50% を追加します。生成された長寿命の Pc は、ヶ月13維持可能性があります。Pc の長期生存を報告された13としてのみ IL 6 と 4 月の取得でした。</li>
		<li>フローサイトメトリーからメジャー Ig 分泌には、Pc が並べ替えられます。</li>
		<li>106セル/ml 24 時間 Pc を培養、培養上清を収穫します。IgG および IgA 人間酵素免疫測定法 (ELISA) キット11,12,13を使用して測定します。中央の IgG 分泌 10 pg/セル/日 10 〜 17 日 pg/セル/日 60 日目13時からであった。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 PC 分化する B の分子のアトラス
注:我々 はバイオインフォマティクスのツールを抽出し、PC 分化 (GenomicScape)15に関連するアフィメトリクス GEP データから最も顕著な情報を視覚化する便利でオープン アクセスを構築しました。GEP は精製の MBCs、PrePBs、PBs および Epc を含む ArrayExpress データベース (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) から公開: E MTAB 1771、E MEXP 2360 E MEXP 3034 と BMPC E MEXP 236014,15。Genomicscape は、自由に利用できる webtool です。
<ol><li>
PC データセットに B の選択
	<ol>
<li>GenomicScape オープン アクセス bioinformatic ツール (http://www.genomicscape.com) でプラズマ細胞にヒト B 細胞と呼ばれるデータの参照メニューの PC データセット B を選択します。ユニークな遺伝子の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子のリストの可視化は、ホーム ページで利用可能な分析ツールで式共発現レポートツールを使用して利用可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チャイルド分析と主成分分析 (PCA)
	<ol>
<li>選択解析ツール | webSAM SAM ツールをロードします。</li>
		<li>ヒト B 細胞のプラズマ細胞へのデータセットを選択し、比較するサンプルのグループを選択します。</li>
		<li>興味のフィルタ リング オプションを適用する使用可能な別のフィルターを使用します。</li>
		<li>SAM ツールでの遺伝子発現プロファイルを比較するには、フォールドの変更を順列、虚偽の発見率と比較の種類の数を含むフィルターのオプションを変更します。GenomicScape は、分析を計算して、選択したグループの間発現遺伝子を提供します。</li>
		<li>分析ツールメニューで主成分分析を選択して主成分分析を実行します。</li>
		<li>ヒト B 細胞のプラズマ細胞へのデータセットを選択し、対象のグループを選択します。</li>
		<li>興味の遺伝子または遺伝子の差異によるとの一覧を貼り付けます。遺伝子のリストを貼り付け、選択遺伝子/ncRNAs のリストを分析するここをクリックして... Genomicscape 可視化およびダウンロードできる PCA が計算されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
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<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
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<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
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<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
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<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

著者がある何も開示するには

人間で PC は稀な細胞分化段階を完全に生物学的特性を妨げる解剖学的場所で行われています。体外 B 活性化分子とサイトカインのさまざまな組み合わせは、その後で発生した連続細胞分化を再現するために適用される多段階培養システムを用いた PC 分化モデルを開発した、異なる臓器・組織 vivo11,12,13。
Pc の差別化モデルに他の効率的な体外 B は、報告された18,19だった。ル Gallou によって開発されたモデルらは、CD19 から始まって 2 段階培養方法論と PC 分化 T 細胞依存 B を探検+/CD27-ナイーブ B 細胞。コッコらは総 B 細胞19<...

B 細胞の形質細胞 (Pc) への分化は、体液性免疫に欠かせない感染症1に対してホストを保護します。PC 分化する B 抗体の分泌に合わせて転写能力と代謝に大きな変化に関連付けられます。B を PC の分化を制御する転写因子が広く研究されているし、明らかに排他的なネットワーク B および PC 特異的転写因子 (TFs)2。B 細胞の PAX5、BCL6 および BACH2 TFs が B 細胞アイデンティティ2,3の保護者です。IRF4、 PRDM1エンコード BLIMP1 およびXBP1 PC TF の誘導が B 細胞遺伝子を消すし、調整された抗体分泌細胞転写プログラム3,4,5を誘発します。これら協調的な転写変更は膜結合型フォームから免疫グロブリン重鎖2,3,の分泌された形態への切り替えと Ig 遺伝子転写活性化に関連付けられています。4. PC 分化する B が小胞体に関与する遺伝子の誘導とリンクされ、ゴルジ装置関数の合成を収容し PC で重要な役割を再生する知られている小胞体ストレス応答 (UPR) アクティベーションを併用免疫グロブリンは、6、7を分泌します。TF XBP1 は、この細胞の適応8,9,10の主要な役割を果たしています。
B 細胞と Pc は、体液性免疫の主要選手です。生物学を理解する生産と通常のプラズマ細胞の生存効率的な免疫応答を確保し、自己免疫疾患や免疫不全を防止する必要がある治療上の介在の重要ですコントロールを処理します。PC は、完全生物学的特性、特に人間を妨げる解剖位置で行われる初期の分化段階で希少な細胞です。多段階培養システムを使用して、PC の差別化モデルに体外 B を報告した.このモデルを再現した連続細胞分化と成熟 vivo11,12,13.別の臓器に発生します。最初のステップでメモリー B 細胞は最初に 4 日間の CD40 リガンド、オリゴデオキシヌクレオチドおよびサイトカインの組み合わせによってアクティブ化され、preplasmablasts (PrePBs) に分化します。2 番目のステップでは、preplasmablasts plasmablasts (PBs) に分化する CD40L とオリゴデオキシヌクレオチド刺激の取り外しとサイトカインの組み合わせを変更することによって引き起こされます。3 番目のステップでは、plasmablasts は、初期 Pc にサイトカイン組み合わせ11,12を変更することによって区別するために引き起こされます。4 番目のステップは、培養骨髄間質細胞のエアコンの中でこれらの初期の Pc によって完全に成熟した Pc を取得する導入されたか、成長因子13を選択しました。これらの成熟した Pc 数ヶ月体外を生き残るため、免疫グロブリン (図 1) を大量に分泌します。興味深いことに、私たちの in vitro モデルを繰り返す、協調的な転写変更と検出された生体内で11,12,13,14 をすることができます PC の段階に別の B の表現型 ,15。Pc は、希少な細胞と in vitro 分化モデル PC 分化ヒト B を勉強することができます。

<table><tbody><tr><td>抗CD2磁気ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>抗CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>抗CD20-PB</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>抗CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>抗CD38-PE</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒスチジン</td><td>R&D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>シグマ</td><td></td><td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>human Transferin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>メルク</td><td>イントロンA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>RecombinanヒトCD40L-hi</td><td>R&D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト APRIL</td><td>R&D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-10</td><td>R&D Systems</td><td>217-IL-</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2 タンパク質</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ202-IL-</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-6</td>ペ<td>プロテック</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

通常記憶 b 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

形質細胞 (Pc) 抗体の大量分泌し、活性化されている B 細胞から発生します。Pc は骨髄や粘膜に位置する希少な細胞、体液性免疫を確保します。それらの低周波と場所のため Pc の研究が困難な人間に。我々 は PC に B を報告選択した生体内で発生した連続細胞分化を再現することができるサイトカインや活性化の分子の組み合わせを用いた in vitro 分化モデル。この in vitro モデル、メモリー B 細胞 (MBCs) が前の plasmablasts (prePBs) plasmablasts に (PBs)、早く Pc を区別するために、最終的に、長命に Pc、表現型を閉じる健常者.の対応するまた、オープン アクセス バイオインフォマティクス PC 分化に関連する GEP データから最も顕著な情報を分析するためのツールを建てた。PC 分化し現在の研究ではヒトの B を勉強するこれらのリソースを使用することができます、PC 分化ヒト B 中に後成の要因の遺伝子発現制御を検討しました。

生体外で通常 PC 分化の全体的な手順は、図 1で表されます。ここで提示されたプロトコルを使用して、ex vivo ひと試料で得られなかった細胞の十分な量を生成可能性があります。PC の分化に関与する転写因子の複雑なネットワークの役割を行ったキー PC 分化の転写ネットワークを規定しているメカニズムのあまり知られていないままです。細胞の分化は、エピジェネティックな変動によって大抵運転されます。私たちの in vitro モデルと PC GEP アトラスに B を使用すると、正常の形質細胞分化におけるエピジェネティック因子の発現変動を調べた。
通常のプラズマ細胞分化におけるエピジェネティック因子の発現 我々 は次の家族に属するものを後成の要因として定義されている: DNA メチル基転移酵素 (DNMT)、メチル CpG 結合ドメイン (MBD) 蛋白質、ヒ...

In vitro における B 細胞を形質細胞分化モデルに報告多段階培養システムを使用して。

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

形質細胞は、特にヒトにおいて完全な生物学的特性評価を損なう解剖学的位置で行われている30の分化段階を有する稀な細胞である。インビトロB2の血漿細胞分化モデルは、生体内の異なる器官で起こる逐次細胞の分化と成熟を再現しています。このin vitroモデルは、協調転写変化と、生体内で検出できる異なるB2形質細胞段階の表現型を再現する。また、プラズマ細胞の分化に関連する探査データから最も顕著な情報を分析するためのオープンアクセスバイオインフォマティクスツールを構築しました。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるユーグ・ド・ブサックです。まず、健常なボランティアから末梢血細胞を得て、メモリB細胞を精製する。7.5ミリリットルの血液をRPMI 1640培地24.5ミリリットルで希釈する。次に、無菌の50ミリリットルの円錐管に12.5ミリリットルの室温密度勾配を加えます。濃度勾配を32ミリリットルの希釈血液で優しく重ね、2つの相の混合を最小限に抑えます。ブレーキをオフにして500倍の重力で20分間遠心分離機。希釈された血漿および密度勾配界面から末梢血単核細胞を収集する。細胞を無菌50ミリリットルチューブに移し、ハンクのバランス塩溶液で最大45ミリリットルのチューブを充填します。5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。その後、RPMI 1640培地の45ミリリットルを加え、10%FCSを添加する。5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。PBSの30ミリリットルを追加, で補います 2%FCS.1つのターゲットセルに4つのビーズを加えることでCD陽性細胞を除去するために、抗CD磁気ビーズを使用してください。摂氏4度で30分間インキュベートします。細胞分離アプリケーションに磁石を使用して、ビーズ結合細胞を非結合セルから分離します。非結合細胞を収集し、抗CD19 APCおよび抗CD27 PE抗体を摂氏4度で15分間インキュベートします。10%ヤギの血清を含むPBSで細胞を2回洗浄します。次いで、細胞選別機を用いて、メモリB細胞を純度95%まで精製する。この後、可溶性CD40リガンドと抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を追加して、メモリーB細胞活性化を行います。精製したメモリB細胞をインターロイキン-2、インターロイキン-10、インターロイキン-15で4日間、6ウェル培養プレートにプレートします。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞選別機を使用して、4日目にCD38陰性CD20陰性プレプラズマ芽細胞を精製します。4日目に、細胞を数え、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって、1ミリリットル当たり250,000個の細胞密度で12ウェル培養プレートにプレートします。分化を誘導するには、CPGオリゴヌクレオチドおよび可溶性CD40リガンドを除去し、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-10およびインターロイキン-15を含む新しいサイトカインカクテルを含む新しい培養培地を添加する。37°Cで3日間細胞を培養します。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、7日目にCD38陽性、CD20陰性プラズマ芽細胞を精製します。7日目に、セルを数えます。12ウェル培養プレートに細胞を12ウェル培養プレートに500,000個の細胞密度でプレートし、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。インターロイキン-6、インターロイキン-15、インターフェロンアルファを含む新鮮な培地を摂氏37度で3日間使用して、プラズマ芽細胞を初期の形質細胞に分化する。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、CD20陰性、CD38陽性、CD138陽性初期の形質細胞を10日目に精製します。まず、培養液で5日間の間質細胞を培養する。0.2マイクロリットルフィルターを使用して、間質細胞培養上清を濾過し、間質細胞コンディショナー培地を得て、使用できる状態になるまで凍結します。次に、初期の形質細胞を12ウェル培養プレートで培養し、前に得られた間質細胞培地をインターロイキン-6およびAPRILで、ウェル当たり500,000個の細胞密度で使用し、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えた。摂氏37度でインキュベートし、毎週間質細胞調節培地を更新する。次に、フローサイトメトリーソート血漿細胞からの免疫グロブリン分泌を測定する。1ミリリットル当たり100万個の密度で24時間、形質細胞を培養し、培養上清を収穫する。ELISAキットを用いて、免疫グロブリンG、および免疫グロブリンA.Firstを測定し、GenomicScapeオープンアクセスバイオインフォマティクスウェブツールを起動します。データの参照メニューで、ヒト B 細胞という名前のデータセットを、形質細胞に選択します。分析ツールの発現/共発現レポートツールを使用して、ユニークな遺伝子の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子リストの可視化が可能です。次に、分析ツール webSAM を選択して SAM ツールをロードします。ヒトB細胞から形質細胞へのデータセットを選択し、比較するサンプルのグループを選択します。使用できるさまざまなフィルターを使用して、対象のフィルター・オプションを適用します。SAM ツールで遺伝子発現プロファイルを比較するには、フォールド変更、順列数、偽発見率、比較の種類などのフィルタリングオプションを変更します。ソフトウェアは分析を計算し、選択したグループ間で遺伝子を差し出して提供します。本研究では、正常な形質細胞分化におけるエピジェネティック因子の発現変化を調べる。多クラスSAM分析を用いて、71個の遺伝子が、5%以下の偽発見率を有するメモリB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および骨髄形質細胞の間で有意に差が発現することが分かる。、ヒストンデメチル酵素の21.74%、メチル結合タンパク質の4.35%、ヒストンデアセチラーゼの4.35%。14エピジェネティックプレーヤー遺伝子は、ヒストンメチルトランスレシエーアーゼの50%、DNAメチルトランスレシエーアーゼの14.28%、ヒストンデアセチラーゼの21.43%、ヒストンデメチル酵素の7.14%、ヒストンアセチルトランス酵素の17.14%を含むプレプラズマ芽細胞段階で有意に過剰発現している。この手順に従って、これらのB2血漿細胞分化中にクロマチン構造およびアーキテクチャにおける修飾を同定し、理解するためのいくつかの分析が行われる。このin vitro分化モデルは、この分子解析を完了するのに十分な細胞を生成し、この全体のモデリングに関与する経路とB2血漿細胞分化中の下流転写影響の両方を明らかにすることを可能にする。この研究から得られたこの知識は、より良い予後と改善された治療戦略が非常に必要とされる決定的な治療法のない癌である多発性骨髄腫の場合のような形質細胞疾患の診断および治療戦略を知らせ、指導することができる。B2血漿細胞分化中にクロマチンに影響を与えるエピジェネティックリモデリング構造および建築変化を特徴付け、理解することは特に興味深いものです。これは、遺伝子シーケンシング、ERRBS、ATACシーケンシング、IC、およびRNAシーケンシングを使用して行われます。中程度の異質性は、健常ドナーの血液に応じて、活性化されたB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および形質細胞の割合で観察され、記憶B細胞の精製に使用される。

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。...

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

ヒト末梢血は、体液性免疫応答の評価に一般的に使用されます。ここでは、末梢血からヒトB細胞を単離する方法、培養中のヒトB細胞を抗体(Ab)分泌B細胞(ASC)に分化させる方法、およびELISpotアッセイによる総IgM-およびIgG-ASCの列挙方法について説明します。...

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。...

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ここでは、原発性ヒト単球単球単球の分離に関するプロトコルと、マクロファージおよび樹状細胞への分化、および上皮細胞を有する多細胞ヒト肺モデルへの組み立てのためのプロトコルを提示する。免疫細胞からなる共培養物の生物学的応答は、単球または解凍された単球から分離し、炎症促進性刺激に曝露した際に、比較される。...

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro...

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

ここでは、多能性幹細胞を脳微小血管内皮細胞(BMEC)様細胞に分化させるプロトコルである拡張内皮細胞培養法(EECM)について述べる。これらの細胞は内皮細胞接着分子発現を示すため、in...

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

このプロトコルは、ナイーブCD4+ T細胞の in vitroでの病原性Th17細胞への分化について説明しています。具体的には、マルチパラメータフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせると、この分化法を用いてナイーブなCD4+...

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

CD8 T細胞の分化と機能をin vitroで研究するために、CD8 T細胞をマウスから分離し、既存の感染マウス膣上皮オルガノイドと長期共培養することができます。ここではこの過程を説明し、共培養時の常駐記憶T細胞マーカーの獲得状況を評価します。...

in vitro 上皮オルガノイド-T細胞共培養システムを用いた常駐記憶CD8 T細胞分化

学ぶB細胞から形質細胞への分化モデル。多段階培養系を用いてin vivoの分化段階と転写変化を再現し、オープンアクセスのバイオインフォマティクスツールでデータ解析を支援する。免疫学研究に有用なプラットフォームを提供する。

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

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