Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי
Chapters
Summary March 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.
Transcript
פרוטוקול זה ממלא פער טכני ביכולתנו ליצור מערכי רצף ארוכים במיוחד. היא מאפשרת לנו לבחון את מורכבות הגנום המוגבלת על ידי גישות הנוכחיות לקריאה קצרה בגנומיקה. השיטה ייחודית בביצועים, חוסן, רב-תכליתיות ופוטנציאל להשתלב עם יישומים חדשים ומבטיחים.
זה חל על חומרים שונים והוא יכול להיות לווסת עבור גדלים מידיים שונים. טכניקה זו החלה לחולל מהפכה בנוף הקליני. כלי האבחון שלה בהפרעות התרחבות חוזרות התגבר על חסרונות נוכחיים רבים.
כמה רישומי השתלות ניצלו הקלדת HLA ברזולוציה גבוהה לתוצאה קלינית טובה יותר. שיטות אלה מספקות מידע ארוך טווח שלא היה נגיש בעבר, כגון phasing ושונות מבנית מורכבת. יחד עם קריאה אפיגנטית במבחן אחד, זה יאפשר רפואה מדויקת.
זה פרוטוקול ארוך עם הרבה טכניקות חדשות וקשה לדעת אם זה עובד עד רצף סופי. אני ממליץ לתרגל טעינה על תאי זרימה ישנים לפני הפעלת דגימות. משתפי פעולה אמרו כמה טכניקות מבלבלות בהשוואה לגישות קריאה קצרה.
באופן ספציפי, החילוץ הוא עדין יותר בשל איכות גבוהה, משקל מולקולרי גבוה DNA. כדי להתחיל את החילוץ של ה-DNA HMW, תחילה להוסיף 200 microliters של ההשעיה התא ל 10 מיליליטר של חיץ תזה בצינור 50 מיליליטר. לאחר מכן, מערבולת במהירות הגבוהה ביותר במשך שלוש שניות.
ו דגירה הפתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, מוסיפים שני מיקרוליטרים של RNS-A לליאזט. בעדינות לסובב את הצינור 50 מיליליטר לערבב את המדגם דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, מוסיפים 10 מיליליטר של שכבת פנול של פנול-כלורופורם-isoamyl אלכוהול תערובת ליסנט. ולשים את הצינור על מסובב ב 20 סל"ד במשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע אדים. לאחר צנטריפוגה עם צינורות ג'ל, בזהירות לשפוך את supernatant לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.
לאחר מכן, מוסיפים 25 מיליליטר של אתנול 100% קר כקרח, ומסובבים בעדינות את הצינור ביד, עד שהדנ"א מזרז. לכופף קצה 20 microliter כדי להפוך את וו. באמצעות הקרס, בזהירות להוציא את ה-DNA HMW ולתת לנוזל לרדת.
לאחר מכן, מניחים את הדנ"א לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר של 70% אתנול, בעדינות להפוך את הצינור שלוש פעמים כדי לשטוף את ה-DNA. כדי להכין את הספרייה מבוססת ההטיה המכנית, השתמש תחילה במזרק ללא מחטים באורך 100 מיליליטר כדי לשאוף לכל הדנ"א. לאחר מכן, לשים מחט 27 מד על המזרק ולפלט את כל ה-DNA לתוך המנה בעדינות ולאט.
חזור 29 פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 143 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים שהושעו מחדש ו-143 מיקרוליטרים של תערובת תגובת תיקון הדנ"א לצינור. מקפיצים את הצינור שש פעמים כדי לערבב בעדינות, ולשים את הצינור על מסובב ב 20 סל"ד במשך 30 דקות.
צנטריפוגה הצינור ב 1000G במשך שתי שניות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את המדגם, ולאחר מכן למקם את הצינור על מתלה מגנטי במשך 10 דקות. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי בזמן שהצינור עדיין על המדף. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של אתנול 70%.
חכה 30 שניות. ואז להסיר את האתנול. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 1000G במשך שתי שניות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את המדגם.
מניחים את הצינור בחזרה על המדף המגנטי ולהסיר כל אתנול שיורית. לייבש את הכדור במשך 30 שניות. לאחר מכן, הסר את הצינור מהמתלה המגנטי והוסף 103 מיקרוליטרים של מאגר T-E.
לאחר מכן, להעיף את הצינור בעדינות כדי להבטיח כי חרוזים מכוסים במאגר ולשים את הצינור על המסובב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לבסוף, מניחים את הצינור בחזרה על המדף המגנטי במשך 10 דקות כדי גלולה את חרוזים. השתמש טיפ נשא P200 רחב להעביר 100 microliters של eluate לצינור 0.2 מיליליטר, ולהמשיך סוף תיקון dA-tailing ותגובות קשירה מתאם.
כדי להכין את הספרייה מבוססת פיצול טרנספוזאז, תחילה לעשות תגובת תג DNA על ידי הוספת 22 microliters של ה-DNA HMW, מיקרוליטר אחד של 10 מילימולרים טריס, pH 8, עם 0.02% טריטון X-100, ו 1 microliter של תערובת הפיצול, לצינור 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בקצה נשא ברוחב P200 כדי לערבב את התגובה שש פעמים, ותדקרו ב-30 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואחריה 80 מעלות צלזיוס לדקה אחת. החזק בארבע מעלות צלזיוס.
לבסוף, השתמש בקצה נשא ברוחב P200 כדי להעביר את התגובה לצינור 1.5 מיליליטר ולהוסיף במהירות 1 microliter של תערובת מתאם מהיר. השתמש טיפ נשא P200 רחב לערבב את התגובה שש פעמים. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ולהמשיך רצף.
כדי להתחיל ברצף, הכנס תחילה תא זרימה חדש לאחד הערוצים של התקן Nanopore. לאחר מכן, בתוכנת בקרת רצף הנלווית, סמן את תיבת המיקום של תא הזרימה. בחר את סוג תא הזרימה הנכון ולחץ על זרימת העבודה של תא זרימת הסימון.
לחץ על כפתור הבדיקה להתחיל כדי להתחיל את ניתוח QC תא זרימה. לאחר מכן, עם פיפטה P1000 מוגדר 100 microliters, למשוך בחזרה פחות מ 30 microliters של מאגר כדי להסיר בועות מתא הזרימה. הוסף 30 microliters של תערובת priming כדי לכסות את החלק העליון של היציאה priming כדי למנוע החדרת בועות.
לאחר מכן, פיפטה 800 מיקרוליטרים של תערובת priming לתוך היציאה priming לטעון את תא הזרימה. מוציאים את הקצה כאשר יש כ -50 microliters של תערובת priming שמאלה, ולהוסיף את שאר תערובת priming על החלק העליון של הנמל priming. לאחר מכן, עם פיפטה P1000, להוסיף 200 microliters של תערובת priming לתוך תא הזרימה.
לאחר מכן, ממש לפני הטעינה, השתמש בפיגט P200 מוגדר ל 80 microliters כדי pipette למעלה ולמטה ספריית ה-DNA שש פעמים. לבסוף, טען את הספריה לערבב טיפה חכם לתוך תא הזרימה דרך היציאה לדוגמה, ולהמשיך רצף וניתוח הנתונים. ניתוח QC של DNA מוכן לבניית ספרייה מבוססת גימה מכנית הביא יחס טוהר 260 עד 280 של כ 1.9, ואת היחס 260 כדי 230 של כ 2.3, מראה מדגם DNA טוב.
אותה תוצאה נראתה באמצעות בניית ספרייה מבוססת פיצול DNA מוכן להמרה. בקרת איכות גודל של DNA HMW מגונבט מחט על ידי אלקטרופורזה ג'ל שדה הדופק הראה כי רוב ה-DNA HMW היה גדול מ 50 קילו-באז. התוצאות של ארבע ריצות באמצעות תא HG00733 הראו כי N50 של ספריה מבוססת גיזום מכני היה קצר יותר מאשר ספרייה מבוססת פיצול טרנספוסאז.
כמו כן, בכל ארבעת הריצות היו מעל 2300 קריאות באורך של יותר מ-100 קילו-בבס. האורך המרבי היה ארוך יותר בספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז עם זמן ההכנה הקצר יותר שלה, בהשוואה לספריות מבוססות ההטעיה המכנית. הספריות המכאניות המבוססות על צביעה יצרו קריאות כוללות יותר בהשוואה לספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז, מה שמצביע על תשואה גבוהה יותר.
שתי הספריות הראו איכות גבוהה עקבית ויותר מ -97% מכלל הבסיסים שלהם היו מיושרים עם הגנום התייחסות אנושית. התפלגות הגודל הצפויה הראתה שלרבעת הריצות היה חלק גדול מהנתונים מעל 50 קילו-באז, בעוד שלספריות המבוססות על פיצול טרנספוזאז היה יחס גבוה יותר של קריאות ארוכות במיוחד. המטרה הכוללת היא לשמור על הדנ"א שלם, ולכן חשוב להימנע מטיפול קשה בדנ"א.
גורם מפתח שיכול למקסם את ערך השיטה הוא הניתוח החישובי. הצוות שלנו פיתח צינור ניתוח ארוך שנקרא PICKY שיכול לזהות מגוון רחב של רכבי שטח עם רגישות גבוהה. הוא יפתח אפיקים חדשים לאזורים מרגשים כמו זיהוי רכבי שטח מורכבים וסידורים מחדש ושינויים ברמת המולקולה הבודדת.
זה ישפר מאוד את ההבנה שלנו של ארכיטקטורת הגנום. פנול מאוד מאכל. אתה חייב לעבוד עם זה ברדס אדים עם ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות, חלוק מעבדה, מכנסיים ארוכים ונעליים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
