Name: Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando lesempio di timo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Impara a isolare tessuti embrionali puri da embrioni di quaglia e pollo per studi di espressione genica. Questa tecnica di microchirurgia consente analisi funzionali ad alta risoluzione in biologia dello sviluppo.

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Gli autori sono grati a Isabel Alcobia per la lettura critica del manoscritto, Mário Henriques per video narrazione e Vitor Proa dal servizio istologia dell'Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con un sistema di video e di Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. l'incubazione delle uova di quaglia e pollo fertilizzato
<ol><li>Posto fecondate le uova di quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) in un incubatore di 38 ° C per 3 giorni. Incubare le uova (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto nella camera d'aria. Nota: L'ambiente umidificato si ottiene inserendo un contenitore di acqua nella parte inferiore dell'incubatore.</li>
	<li>Incubare uova fecondate di pollo (Gallus gallus) per 2,5 giorni in un incubatore di 38 ° C. Incubare le uova in posizione orizzontale e segnare la parte superiore utilizzando un pezzo di carbone per identificare la posizione di embrione. Nota: Iniziare con 40 uova di quaglia e 60 uova di gallina, quando si stabilisce questo esperimento.</li>
</ol>2. isolamento di endoderma quaglia contenente il dominio prospettico del rudimento timico
Nota: Utilizzare una cappa a flusso laminare orizzontale e strumenti sterilizzati e materiali per le procedure di manipolazione di uovo in condizioni sterili.
<ol><li>Rimuovere l'area embrionale contenente il territorio presuntivo di rudimento timico, la regione arco faringea contenente il 3rd e 4th archi (3/4PAR), come descritto7,8.<ol>
<li>Riempire una ciotola di vetro borosilicato di grandi dimensioni (100 x 50 mm; 100 cm3) con 60 mL di soluzione fredda tampone fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Con l'aiuto di forbici curve, toccare e tagliare un foro circolare nel guscio di una quaglia uovo che è stato incubato per 3 giorni. Praticare il foro sul lato opposto dell'uovo smussato e trasferire il tuorlo (con l'embrione) alla ciotola con PBS freddo.</li>
		<li>Rimuovere l'embrione dal tuorlo tagliando la membrana vitellina esternamente ai vasi extra-embrionali utilizzando forbici curve.</li>
		<li>Con l'aiuto di pinzette sottili, trasferimento dell'embrione in una piccola ciotola (60 mm x 30 mm; 15 cm3) riempito con 10 mL di PBS freddo.</li>
		<li>Con una schiumarola, spostare l'embrione in una capsula di Petri con una base nera di 100 mm (Vedi Tabella materiali) contenente 10 mL di PBS freddo e posizionarlo sotto un microscopio stereoscopico.</li>
		<li>Sezionare il 3/4PAR, come descritto in precedenza8.</li>
		<li>Aspirato il 3/4PAR e trasferirlo in un piatto di vetro tre quarti pieno di PBS freddo utilizzando una pipetta Pasteur sterile di 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolare l'endoderma contenente il territorio presuntivo di rudimento timico (l'endoderma 3/4PP) digestione enzimatica con pancreatina.<ol>
<li>Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, transfer 3/4PAR a un piatto di vetro tre quarti pieno di fredda pancreatina (8 mg/mL; diluizione di 1:3 di 25 mg/mL con PBS freddo).</li>
		<li>Incubare per 1 h sul ghiaccio per digestione enzimatica. Nota: Il tempo di digestione enzimatica dipende della fase di sviluppo (tabella 1).</li>
		<li>Mettere il piatto di vetro sotto lo stereomicroscopio (ingrandimento 40x x-60) per isolare l'endoderma da 3/4PAR. Nota: Tenere tutte le superfici e soluzioni fredde durante questa procedura. Modificare una nuova soluzione di pancreatina freddo se impiega troppo tempo per sezionare i tessuti (> 15 min). Come fonte di illuminazione, utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.</li>
		<li>Per isolare l'endoderma dai tessuti circostanti, è possibile utilizzare due acciaio inossidabile microscalpels nei supporti del perno. Nota: Utilizzare microscalpels con un diametro compreso tra 0,1 mm e 0,2 mm e ai titolari di pin di nichel con un diametro di apertura mascella da 0 a 1 mm.<ol>
<li>Prima di rimuovere il tubo neurale e mesoderma attaccate alla superficie dorsale dell'ipoblasto pharyngeal.</li>
			<li>Dal lato dorsale, attentamente staccare e rimuovere il mesenchyme tra gli archi pharyngeal ed esporre i sacchetti pharyngeal. Eseguire questa procedura su entrambi i lati di 3/4PAR.</li>
			<li>Rimuovere il tubo di cuore e il mesenchima che circonda i sacchetti anteriori.</li>
			<li>Dal lato ventrale, tagliare l'ectoderma della 2° e 3rd archi pharyngeal e rimuovere con cautela il mesenchyme collegato per le buste. Ripetere questa procedura sul lato opposto del 3/4PAR. In questa fase il rudimento della tiroide dovrebbe essere visibile.</li>
			<li>Rimuovere tutte le cellule mesenchymal rimanenti attaccate all'endoderma faringeo con i due microscalpels.</li>
			<li>Fare un taglio trasversale tra la 2nd e 3rd PP, dissociando l'ipoblasto pharyngeal contenente il 3rd e 4th sacchetti dalla parte anteriore dell'endoderma avendo il rudimento della tiroide e 2nd sacchetto pharyngeal.</li>
			<li>Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferimento l'endoderma 3/4PP isolato a un piatto di vetro tre quarti riempito con 100% freddo siero bovino fetale (FBS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tenere il piatto di vetro con i tessuti isolati sul ghiaccio durante la preparazione di analisi in vitro. In alternativa, possono conservarsi tridimensionalmente i tessuti isolati e analizzati in situ per espressione genica.</li>
</ol>3. isolamento del mesoderma somatopleura pollo
Nota: Eseguire uovo procedure di manipolazione in condizioni sterili, utilizzando materiali e strumenti sterilizzati e cappa a flusso laminare orizzontale.
<ol><li>Rimuovere il territorio embrionale contenente il mesoderma somatopleura a livello di somiti 19-24 (ss19-24).<ol>
<li>Togliere l'uovo di pollo dall'incubatrice dopo 2,5 giorni di incubazione.</li>
		<li>Con forbici curve, è possibile aprire un piccolo foro nel guscio. Inserire un ago ed aspirare 2 mL di albumina con una siringa da 10 mL per abbassare il volume di albumina nell'uovo e prevenire danni dell'embrione (che si trova sotto l'area marcata della shell). Scartare l'albumina aspirato.</li>
		<li>Tagliare una circolare del foro (fino a due terzi della superficie superiore) della regione contrassegnato della shell utilizzando forbici curve.</li>
		<li>Tagliate la membrana vitellina esternamente ai vasi Extraembrionali tenendo l'embrione con una pinza sottile.</li>
		<li>Sotto un microscopio stereoscopico, posto l'embrione in una capsula di Petri di 100 mm con una base nera contenente 10 mL di PBS freddo. Nota: Utilizzare uno stereomicroscopio da questo punto in avanti per l'ingrandimento progressivo di procedure di microchirurgia.</li>
		<li>Utilizzare quattro spilli entomologici sottili per contenere l'embrione alla parte inferiore della piastra. Inserire i perni della regione extraembryonic formando una forma quadrata.</li>
		<li>Eseguire due tagli tra i somiti 19 e 24 trasversalmente all'asse dell'embrione e attraversando tutto il territorio dell'embrione, usando le forbici wecker occhio.</li>
		<li>Rilascio della sezione di embrione, ss19-24, da taglio bordi marginali embrionale.</li>
		<li>Aspirato il ss19-24 tessuti e trasferimento in un piatto di vetro tre quarti pieno di PBS freddo utilizzando una pipetta Pasteur sterile di 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolare il mesoderma laterale dalla regione somatopleura (ss19-24) per digestione enzimatica con pancreatina (8 mg/mL; diluizione di 1:3 di 25 mg/mL con PBS freddo).<ol>
<li>Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferimento i tessuti ss19-24 per un vetro piatto tre quarti riempiti con soluzione fredda pancreatina.</li>
		<li>Incubare per 30 min in ghiaccio per digestione enzimatica.</li>
		<li>Sotto lo stereomicroscopio, isolare il mesoderma dai tessuti circostanti utilizzando due microscalpels in un supporto. Nota: Tenere tutte le superfici e soluzioni fredde durante questa procedura. Modificare una nuova soluzione di pancreatina freddo se impiega troppo tempo per sezionare i tessuti (> 10 min.). Come fonte di illuminazione, utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.</li>
		<li>Durante l'isolamento del mesoderma, rimuovere prima l'ectoderma sulla superficie, seguita da un'attenta separazione dei tessuti splancnopleura situato ventralmente.</li>
		<li>Rilascio del mesoderma laterale di destra della somatopleura tagliando in un movimento parallelo al tubo neurale.</li>
		<li>Ripetere la separazione di mesoderma del lato sinistro dell'embrione. Nota: Assicurarsi di microscalpel movimenti lenti durante questa procedura. Le proteine della matrice extracellulare esposta bastone ai tessuti e agli strumenti impedendo movimenti fluidi.</li>
		<li>Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe transfer mesoderm isolato a un piatto di vetro tre quarti pieno di freddo FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tenere il piatto di vetro con i tessuti isolati sul ghiaccio durante la preparazione di analisi in vitro.</li>
</ol>4. In vitro organotipiche dosaggio: heterospecific associazione di endoderma 3/4PP Quaglia e pollo somatopleura mesoderma
<ol><li>Preparare il terreno di coltura con RPMI-1640 supplementato con 10% FBS e 1% Pen/Strep3,5.</li>
	<li>Posizionare una griglia metallica in una capsula di Petri con 5 mL di terreno di coltura da 35 mm. Nota: Rimuovere l'eccesso di liquido per livellare la superficie media con la parte superiore della griglia.</li>
	<li>Con l'aiuto di pinzette sottili, immergere un filtro a membrana nel terreno di coltura e poi è posto sulla parte superiore della griglia per avere una superficie a contatto con aria. Nota: Un quarto della zona della membrana (con 13 mm di diametro) è adeguato per l'associazione di tessuto.</li>
	<li>Sotto lo stereomicroscopio, associare i tessuti isolati sulla parte superiore del filtro a membrana. Prima trasferire l'endoderma 3/4PP (passaggio 2) dal piatto di vetro facendo scorrere dolce con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Ripetere questa procedura per il mesoderma isolato (passaggio 3). Nota: Con l'aiuto di un microscalpel, mescolare i tessuti per massimizzare la sua associazione.</li>
	<li>Posizionare con attenzione i tessuti associati in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per tessuti coltivati h. 48 possono essere innestati sulla membrana corio-allantoidea (CAM). Nota: Formazione ectopica dell'organo nel CAM era precedentemente dettagliate8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
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<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura di isolamento del tessuto embrionale dettagliata qui è stata migliorata dalle precedenti tecniche per produrre gli embrioni chimerici quaglia-pollo in diversi contesti biologici3,5,6.
Questo approccio è adatto per isolare i tessuti embrionali puri senza la necessità di manipolazione genetica o l'uso di marcatori tessuto-specifici, che spesso sono indeterminati, limitando l'uso di modelli ...

Agli inizi del 1970, un sistema elegante quaglia-pollo chimera è stato sviluppato da Le Douarin, aprendo nuove vie per comprendere il ruolo della migrazione cellulare e interazioni cellulari durante lo sviluppo1,2. Il modello è stato ideato sulla premessa che scambio di cellule tra le due specie non vorrei disturbare notevolmente l'embriogenesi, successivamente confermato quando utilizzati per lo studio di numerosi processi di sviluppo, tra cui la formazione del sistema nervoso e l'ematopoietiche sistemi1. Prendendo quest'ultimo come un esempio, le onde cicliche dei progenitori ematopoietici colonizzando il rudimento epiteliale del timo in primo luogo è stata osservata mediante quaglia-pollo chimera system3. Per questo, il territorio prospettico del timo, l'endoderma dei sacchetti di terzi e quarto pharyngeal (3/4PP), era meccanicamente ed enzimaticamente isolato da embrioni di quaglia (q) in 15-30 - fase somite [giorno embrionale (E) 1.5-E2.5]. Queste fasi corrispondono al pollo Hamburger e Hamilton4 (HH) - fasi 12-17. Le procedure di isolamento iniziato con l'uso di tripsina enzimaticamente dissociare l'endoderma dal mesenchima allegato. L'endoderma isolato è stato innestato nella regione somatopleura di embrione di pollo (c) ospite presso E3-E3.5 (HH-fasi 20-21). Questo mesenchima eterologa è stato considerato "permissivo" allo sviluppo di epitelio timico che contribuiscono anche alla formazione dell'organo3. In seguito, ondate successive di cellule progenitrici ematica di pollo ospite infiltrato la controparte quaglia donatore timici epiteliali che contribuiscono alla formazione di timo in embrione host3.
Più recentemente, una versione modificata di questo approccio è stato anche dimostrata di essere importante per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. A questo proposito, i tessuti coinvolti nella formazione del timo ectopico in embrioni chimerici3 erano isolati, sia da donatore e host embrioni e associati ex vivo. Un protocollo migliorato è stato usato per isolare l'endoderma 3/4PP di quaglia (E2.5-E3) e il mesoderma somatopleura di pollo (E2.5-E3). Brevemente, i tessuti embrionali sono stati isolati di microchirurgia e soggetto a digestione in vitro pancreatina. Inoltre, le condizioni di digestione enzimatica, temperatura e tempo di incubazione sono state ottimizzate secondo tessuto tipo e Stadio di sviluppo (tabella 1).
Successivamente, i tessuti isolati sono stati associati in un organotipiche sistema in vitro per 48 h, come precedentemente segnalato5,6. L'associazione in vitro di tessuti imita il locale interazioni cellulari nell'embrione, superando alcune restrizioni della manipolazione in vivo. Questo sistema è particolarmente utile per studiare le interazioni cellulari in eventi morfogenetici complessi, quali lo sviluppo dell'apparato faringeo.
Il contributo di ogni tessuto nell'istogenesi di timo, così come la capacità dell'associazione heterospecific per generare un timo può essere ulteriormente esplorato utilizzando la metodologia di CAM, precedentemente dettagliate5,7,8. Succintamente, i tessuti coltivati sono stati innestati la CAM di embrioni cE8 e ha permesso di sviluppare in ovo per 10 giorni. Quindi, formazione di timo è stata valutata mediante analisi morfologica in espianti di raccolti. Come gli studi classici di quaglia-pollo3, l'epitelio timico quaglia è stata colonizzata da cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da un embrione di pollo, che più successivamente è stato indicato per contribuire allo sviluppo di organo9,10 . La HPCs migrati dall'embrione al timo ectopico chimerico attraverso l'altamente vascularized CAM5,7,8. Quaglia epitelio timico derivata può essere identificato mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, QCPN - MAb Quaglia perinucleare), superando la necessità di marcatori molecolari del tessuto-specifica.
Questo metodo sperimentale, come l'approccio in due fasi segnalato nella precedente pubblicazione8, consente la modulazione della trasduzione del segnale dalla regolare somministrazione di agenti farmacologici durante in vitro e in sviluppo di ovo. Inoltre, espianti possono essere raccolto in qualsiasi momento del corso dell' esperimento8.
Infine, il protocollo di isolamento qui dettagliato consente la conservazione delle proprietà naturali e 3D-architettura di tessuti embrionali, particolarmente utili per dettagliare modelli di espressione genica in situ dei territori embrionali altrimenti inaccessibili da metodi convenzionali. Inoltre, approcci di analisi del trascrittoma, tra cui RNA-seq o microarrays, possono anche applicarsi in tessuti isolati senza la necessità di marcatori genetici, fornendo un'analisi di tessuto-specifico elevato throughput "omics".

<table><tbody><tr><td>Uova fecondate di gallina (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portogallo</td><td></td><td>Allevamento di pollame&nbsp;</td></tr><tr><td>Uova fecondate di quaglia (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portogallo</td><td></td><td>Allevamento di uccelli&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in PP da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in PP da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in pyrex da 60 x 20 mm</td><td>Gruppo Duran</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in pyrex da 100 x 20 mm</td><td>Gruppo Duran</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Griglia metallica</td><td>Griglia in acciaio inossidabile a maglia fine</td><td>Goodfellows</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>Filtro a membrana Isopore da 0,6 mm</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciotole in pyrex 60 x 30 mm (misura piccola)</td><td></td><td></td> <td>dal supermercato</td></tr><tr><td>Ciotole in pyrex 100 x 50 mm (grandi dimensioni)</td><td></td><td></td> <td>dal supermercato</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>Pipetta in plastica da 2 mL Pipetta</td></tr><tr><td>pasteur in vetro</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td> in plastica trasparente <td>dal supermercato&nbsp;</td></tr><tr><td>Citocheratina (pan; acida e basica, citocheratine di tipo I e II), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>Preparare una soluzione da 25 mg/mL secondo le istruzioni del produttore; centrifugare e filtrare prima di aliquote e conservare a -20&ordm;C. Le aliquote possono essere conservate congelate per diversi anni.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr>Studi sullo sviluppo degli<td>anticorpi QCPN</td><td>Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010</td><td></td> Bluesil RTV141A<td></td></tr><tr><td>/B Elastomero siliconico 1,1 kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Per preparare la base posteriore per la capsula di Petri</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Pinze sottili</td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini, curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Forbici curve</td></tr><tr><td>Perni per insetti&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>Perno in acciaio inossidabile da 0,3 mm</td></tr><tr><td>Micro spatola&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Cucchiaio da trapianto</td></tr><tr><td>Perni per minuzie Strumenti per la</td><td>scienza fine</td><td>26002-20</td><td>Microbisturi in acciaio inossidabile da 0,2 mm</td></tr><tr><td>Perni per minuzie Strumenti per la</td><td>scienza fine</td><td>26002-10</td><td>Microbisturi in acciaio inossidabile da 0,1 mm</td></tr><tr><td>Moria Portaspilli nichelato</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>26016-12</td><td>Supporto per perni nichelato</td></tr><tr><td>Cucchiaio perforato Moria</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Forbice per gli occhi</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Microscopio MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer&nbsp; S360 Digitale scanner per vetrini&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

La capacità di isolare i tessuti embrionali era un passo essenziale per stabilire il sistema di quaglia-pollo chimera, che a sua volta ha fornito contributi indiscussi per svelare processi chiave nella biologia inerente allo sviluppo.
Qui è descritto un metodo ottimizzato per isolare i tessuti embrionali da quaglie e polli di microchirurgia e digestione enzimatica pur conservando le sue proprietà biologiche. Dopo l'isolamento, tessuti da entrambe le specie sono associati in un saggio in vitro organotipiche per 48 h. Quaglia e tessuti di pollo possono essere discriminate da distinte caratteristiche nucleari e marcatori molecolari, permettendo lo studio del cellulare cross-talk tra Associazione heterospecific dei tessuti. Questo approccio è, pertanto, uno strumento utile per lo studio delle interazioni complesse del tessuto in processi di sviluppo con modifiche spaziali altamente dinamiche, come quelle che si verificano durante la morfogenesi della faringe e la formazione della del foregut endoderma-derivato organi. Questo approccio sperimentale è stato sviluppato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi di formazione di timo. In questo, l'endoderma-derivato prospettico rudimento timico e mesenchima derivato dal mesoderma, sono state isolate da embrioni di pollo e quaglia, rispettivamente.
La capacità dei tessuti associati per generare gli organi possa essere ulteriormente testata mediante innesto li sulla membrana corio-allantoidea (CAM) di un embrione di pollo. Il CAM fornisce le sostanze nutrienti e consente lo scambio di gas ai tessuti espiantati. Dopo 10 giorni di sviluppo di ovo, gli organi chimerici possono essere analizzati in espianti di raccolti con i metodi morfologici convenzionali. Questa procedura permette anche di studiare tessuto-specifici contributi durante la formazione dell'organo, dal suo iniziale sviluppo (sviluppo in vitro) alle fasi finali dell'organogenesi (in sviluppo di ovo).
Infine, il metodo migliore isolamento fornisce anche tridimensionale (3D) conservato tessuti embrionali, che possono essere utilizzati anche per analisi topografiche ad alta risoluzione dei modelli di espressione genica tessuto-specifica.

Il protocollo in dettaglio un metodo per isolare i tessuti embrionali aviaria per essere utilizzato in diversi approcci tecnici di biologia cellulare e dello sviluppo. Questo metodo è stato precedentemente impiegato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. Nel presente documento, nuovi risultati sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2, utilizzando ...

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un approccio sperimentale ottimizzato per isolare i tessuti embrionali dalla quaglia e dagli embrioni di pollo. Con questa tecnica, otteniamo tessuti embrionali puri che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e nei test funzionali. I tessuti provenienti da embrioni di quaglia e pollo sono isolati dalla microchirurgia e sottoposti a digestione enzimatica in vitro preservandone le proprietà biologiche.Dopo l'isolamento, i tessuti conservati tridimensionali possono essere utilizzati per l'analisi dei modelli di espressione genica topografica ad alta risoluzione. Questo approccio è particolarmente utile per dettagliare l'espressione genica in situ in territori embrionali altrimenti inaccessibili con metodi convenzionali. Inoltre, gli approcci di analisi del trascritoma possono anche essere applicati in tessuti isolati senza richiedere marcatori genetici, fornendo al contempo un'analisi omica ad alta produttività specifica dei tessuti.In alternativa, i tessuti isolati di entrambe le specie possono essere associati in un saggio organotipico in vitro per 48 ore. Questo approccio consente di studiare le interazioni dei tessuti, poiché le cellule di quaglia e pollo possono essere discriminate da caratteristiche nucleari distinte e marcatori molecolari. La capacità dei tessuti di coltura di formare organi può essere ulteriormente testata mediante saggio ovo.Questo metodo è quindi uno strumento utile per studiare complesse interazioni tissutali in processi di sviluppo con modifiche uciali altamente dinamiche e può anche aiutare a rivelare il potenziale di specifici territori embrionali alla formazione di organi. Ad esempio, nel presente documento viene descritta la formazione di timo chimerico di quaglia-pollo da tessuti embrionali isolati. In primo luogo, l'endoderma del terzo e quarto sacchetto faringeo, la potenziale rudimento timica è isolata dalla regione faringea degli embrioni di quaglia con tre giorni di sviluppo.Quindi, questo tessuto è associato a un mesenchima in grado di sostenere il suo sviluppo, il mesoderma somatopleura. Infine, l'associazione eterospecifica dei tessuti viene coltivata in vitro e in ovo per formare un timo chimerico. Eseguire tutte le procedure di manipolazione delle uova in condizioni sterili utilizzando una cappa orizzontale a flusso laminare e strumenti e materiali sterilizzati.Le uova di quaglia fecondate sono state incubate con la camera d'aria rivolta verso l'alto. Per iniziare, rimuovere le uova di quaglia dall'incubatrice. Preparare una grande ciotola di vetro borosilicato piena di PBS freddo.Con forbici curve, toccare e tagliare un foro circolare nel guscio di un uovo di quaglia con tre giorni di incubazione. Rendere il foro sul lato opposto dell'uovo smussato e trasferire il tuorlo nella ciotola con PBS freddo. Rimuovere l'embrione dal tuorlo tagliando esternamente la membrana vitellina ai vasi extraembrionici.Con l'aiuto di forcep sottili, trasferire l'embrione in una piccola ciotola piena di PBS freddo, quindi spostare l'embrione in una piastra di Petri con base nera con uno skimmer. Rimuovere la regione faringea contenente il terzo e il quarto sacchetti faringei come descritto nella precedente legatura di Jove SPA. Quindi, trasferire la terza e la quarta regione dell'arco faringeo in un bicchiere riempito con pancreatina fredda e incubare per un'ora, sul ghiaccio, per la digestione enzimatica.Si noti che il periodo di incubazione della digestione enzimatica dipende dallo stadio di sviluppo. Posizionare la lapide di vetro al microscopio stereo e isolare l'endoderma dalla terza e dalla quarta regione dell'arco faringeo, utilizzando due micro-bisturi in un supporto. In primo luogo la regione faringea con il lato dorsale verso l'alto, mostrando internamente l'endoderma e l'ectoderma nella superficie esterna.Osserva l'ectoderma, l'endoderma, il mesenchima, il tubo cardiaco e la porzione ventrale del tubo neurale. Rimuovere il tubo neurale e il mesoderma attaccato alla superficie dorsale dell'endoderma faringeo. Osserva l'endoderma della faringe, il quarto e il terzo sacchetto faringeo e il tubo cardiaco.Con il lato dorsale verso l'alto, staccare con cura e rimuovere il mesenchima tra gli archi faringei ed esporre i sacchetti faringei. Eseguire questa procedura nell'altro lato della regione faringea. Rimuovere il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e osservare la quarta busta faringea.Con il lato posteriore verso l'alto, osservare sia la quarta sacchetti faringea sinistra che destra. Continuare rimuovendo il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e alla seconda busta. Rimuovere il tubo cardiaco e il mesenchima che circonda i sacchetti interni.Con il lato ventrale verso l'alto, osserva la faringe endoderma e il lato destro del secondo arco faringeo. In questa fase, l'endoderma del rudimento tiroideo dovrebbe essere visibile. Staccare l'ectoderma del secondo e del terzo arco faringeo e rimuovere con cura il mesenchima degli archi.Osservare la rimozione del mesenchima del secondo arco faringeo sul lato destro. Si noti la posizione del quarto e terzo sacchetto e rudimento tiroideo. Rimuovere i resti alle cellule mesenchimali attaccate ai sacchetti faringei.Osservare la terza e la quarta busta del lato destro e la quarta busta dal lato sinistro. Ripetere il distacco del mesenchima del lato sinistro. Osserva ora la terza busta del lato sinistro.Osservare il distacco del mesenchima del secondo arco sul lato sinistro. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura. Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti.Infine, fai un taglio trasversale tra il secondo e il terzo sacchetto faringeo per rimuovere i secondi sacchetti e il rudimento tiroideo. A questo punto, l'endoderma isolato è composto dalla terza e quarta sacchettia e dalla punta posteriore della faringe. Rimuovere i resti staccati mesenchima con l'aiuto di due micro-bisturi.Trasferire l'endoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Le uova sono state poste in posizione orizzontale e il lato superiore contrassegnato per l'uso di un carbone. Per iniziare, rimuovere le uova dall'incubatrice.Con una forbice curva, aprire un piccolo foro nel guscio, inserire un ago e aspirare due millilitri di albumina con una siringa da 10 millilitri. Aprire un foro circolare nella regione marcata del guscio e tagliare la membrana vitellina esternamente ai vasi embrionali extra tenendo l'embrione con force sottili. Al microscopio stereo, posizionare l'embrione in una piastra di Petri con base nera contenente PBS freddo.Usa quattro spilli per insetti per tenere l'embrione sul fondo del piatto. Posizionare i perni nella regione extraembrionica formando una forma quadrata. Eseguire due tagli tra i somiti 19 e 24 trasversalmente all'asse embrionale e attraversare l'embrione.Rilasciare questa sezione tagliando i bordi embrionali marginali. Osservare la piastra laterale, il tubo neurale e le somiti. Aspirare e trasferire i tessuti in un piatto di vetro riempito con pancreatina fredda.Incubare per 30 minuti sul ghiaccio per la digestione enzimatica. Al microscopio stereo, isolare il mesoderma dai tessuti circostanti usando due micro-bisturi nei supporti. Osserva il mesoderma somatopleura, lo splanchnopleura, il tubo neurale e l'ectoderma.In primo luogo, rimuovere l'ectoderma sulla superficie. Osservare il mesoderma somatopleura dissociato dall'ectoderma. Quindi, staccare con cura la splancnopleura posizionata ventralmente dal somatopleura.Osservare il mesoderma laterale destro del somatopleura. Rilascialo tagliandolo in un movimento parallelo al tubo neurale. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura.Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti. Osservare il mesoderma laterale sinistro del somatopleura, dei somiti, del tubo neurale e dell'ectoderma. Ripetere il rilascio di mesoderma di questo lato.Fai movimenti lenti con il micro-bisturi. Le proteine della matrice extracellulare esposte siedono attraverso tessuti e strumenti, prevenendo i movimenti dei fluidi. Tagliare con cura il somatopleura in un movimento parallelo al tubo neurale.Trasferire il mesoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Mettere una griglia metallica a maglie fini in una piastra di Petri e riempire con mezzo di coltura. Rimuovere i liquidi eccessivi per livellare la superficie media con la parte superiore della griglia.Con l'aiuto di pinza sottile, immergere un filtro a membrana nel mezzo di coltura e posizionarlo con cura sulla parte superiore della griglia per avere una superficie a contatto con lei. Al microscopio stereo, trasferire l'endoderma isolato dalla piastra di vetro al filtro a membrana scivolando delicatamente con l'aiuto di spatole e forcep sottili. Ripetere questa procedura per il mesoderma isolato.Con l'aiuto di un micro-bisturi, mescolare i tessuti per massimizzare la sua associazione. Posizionare con cura i tessuti associati in un'incubatrice umidificata a 37 gradi con 5%CO2 per 48 ore. Dopo il periodo di incubazione, innestare i tessuti di coltura sulla membrana di tipo coriolano e consentirgli di svilupparsi in ovale per ulteriori 10 giorni per completare la formazione di organi come descritto in precedenza.Ecco il metodo reticolare che permette l'isolamento dei tessuti embrionali aviari da utilizzare in distinti approcci sperimentali. Ad esempio, l'espressione di geni noti per essere coinvolti nella formazione dei sacchetti faringei è stata anche valutata un endoderma isolato contenente la seconda, terza e quarta sacchetti faringei dagli embrioni di pollo al terzo giorno e mezzo embrionale per ibridazione in situ montata intera. L'espressione di Sonic Hedgehog è stata rilevata nell'endoderma della faringe centrale ed è stata esclusa dai sacchetti, mentre BMP7 è stata espressa nell'endoderma della seconda e della terza busta faringea ed esclusa dalla faringe centrale e dalla quarta busta faringea.I tessuti isolati possono anche essere vitro specificamente associati in vitro per 48 ore, innesto sulla membrana di tipo coriolano e permesso di svilupparsi per ulteriori 10 giorni. Le espianto possono essere analizzate mediante istologia convenzionale e immunoistochimica. Alcuni risultati rappresentativi dell'associazione dell'endoderma di quaglia dal terzo e quarto sacchetto faringeo con mesoderma di somatopleura di pollo sono i seguenti-Innesti hanno mostrato un timo chimerico completamente formato con cellule epiteliali timiche derivate dalla quaglia positive per qcpn e cellule linfoidi di pollo.Inoltre, l'epitelio timomico positivo alla citocheratina mostrò caratteristiche morfologiche normali, mostrando una tipica architettura reticolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le quaglie e i tessuti embrionali di pollo che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e formando organi chimerici possono anche aiutare a decifrare la complessità della genetica degli organi.

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