Name: Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד שיטת מיקרו-ניטרוליזציה מבוססת הדמיה לכימות נוגדנים נטרליזציה נגד RSV. השיטה מדגימה שחזוריות גבוהה עם שונות בין מבחנים של פחות מ-10% וניתנת להתאמה לסוגי דגימות שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.

הערה: כל השלבים צריך להתבצע בשכונה BSL2 אלא אם צויין אחרת. טיטור ויראלי נדרש מראש וזמינותו PRN כדי לקבוע ריכוז RSV אופטימלית בשימוש PRN וזמינותו. מומלץ aliquot את המניות וירוס באמצעי אחסון קטן להיות הקרת פעם, המשמש עבור כל assay NAb. מומלץ גם באמצעות המניה נגיפי זהה עבור כל מבחני NAb לבצע עבור כל דגימות מחקר אחד. ודא תרבות ומדיה באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת תא צלחות.
1. RSV טיטור ויראלי
הערה: בהתאם את מספר המניות וירוס מספר הכפילויות, הצלחת assay ניתן להגדיר על פי איור 1. כל מניה וירוס, צריך להיות טיטרציה שהפקידים למטה הצלחת assay, החל הריכוז הגבוה ביותר ויראלי (קרי, 1:10). Titrations טורי ניתן בדרך כלל 1:10. תרבית תאים A549, תחזוקה, כמו גם RSV תרבות הליך נעשים באמצעות הליכים סטנדרטיים, לא נכללות פרוטוקול זה.
<ol><li>צלחות זריעה (יום 1)
	<ol>
<li>Resuspend A549 תאים של Dulbecco הנשרים ששינה בינוני (DMEM) + 10% עגל עוברית סרום (FCS) + 1000 IU פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) ב 4 x 105/mL. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל תאים 4 x 104 A459.</li>
		<li>דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן). הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. מומלץ לא להתחיל את הניסויים בקבוקון תא חדש נמצאת עדיין הקטעים הראשונים.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהום בנגיף (יום 2)
	<ol>
<li>הכנת וירוס דילול טורי<ol>
<li>במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח. להכין 3 משכפל RSV כל וירוס מניות ניתן לבדיקה, להשתמש דילול מניות של וירוס הראשונית של 1:10 עם 100 μL של וירוס מדולל/טוב, להזמין לפחות עמודה אחת לשליטה שלילי. הערה: איור 1 מציג שליטה שלילי triplicates.</li>
			<li>להוסיף 100 μL של כל וירוס מדולל ב 1:10 שהפקידים בשורה A של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי. להוסיף μL 90/טוב של DMEM + עט 1000 IU/סטרפ ללא FCS שורות B ה</li>
			<li>לבצע 1:10 טורי דילולים למטה את הצלחת על ידי העברת μL 10 משורה A בשורה B. לערבב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים ולהמשיך את דילולים ten-fold עד השורה ה להשליך μL 10 הסופי כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 90 μL. הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
חיסון וירוס לתאים A549
		<ol>
<li>לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים ביום הקודם. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent. למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי.</li>
			<li>לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.</li>
			<li>העברה של דילולים וירוס מהצלחת טיטור ויראלי (איור 1) ולס המתאימות בצלחת תא A549. דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. לאחר דגירה 1 h, decant supernatants באמצעות פיפטה (כדי למנוע זיהום לחצות). להוציא 90 μL/טוב.</li>
			<li>להוסיף 100 μL 1 x בינוני 199 (M199, ראה טבלה של חומרים) + 1.5% חומצה גליקולית תאית נתרן מלח (CMC) נמוך צמיגות + 2% FCS המכיל עט/סטרפ כדי מכל קידוח. הערה: 2 x M199 + 4% FCS + 2% עט/סטרפ ופתרונות CMC 3% צריך להיות מוכן מראש, המאוחסנים ב 4 ° C לשימוש עתידי. ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.<ol>
<li>להכין פתרון x M199 2: 1 שקית/500 מ"ל מזוקקים מים + 20 מ"ל FCS + אפשרות למצוא עט 10 מ"ל (להמציא 2 x MI99). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן 0.22 μm.</li>
				<li>הכנה של 3% CMC, להוסיף 15 גרם של CMC לאט לתוך 500 מ ל מים מזוקקים. להמיס את CMC במים באמצעות חימום קדירות מתכתי ב 50 מעלות צלזיוס, אשר לוקח בערך 1 h של הכנה. לערבב היטב לעשות 3% CMC ו אוטוקלב הפתרון. הערה: יש להוסיף את CMC מלא במים כדי להיות מומס; הוספת מים בבית מוצק יבש מייצרת "גוש" של מוצק שקשה מאוד להתמוסס.</li>
				<li>להכין 1 x M199 + 1.5% CMC צמיגות נמוכה + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי ערבוב 1:1 2-M199 ו- 3% CMC מוכן בשלב 1.2.2.4.2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
	<ol>
<li>קיבוע וצלחת assay המתפתח<ol>
<li>להתעלם M199 + CMC + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי היפוך בעדינות את הצלחת. להוסיף לאט לאט (כדי להימנע להפריע את שכבת תאים) μL 200 קיבוע מאגר (אצטון 80%, 20% ל- PBS, המאוחסנים ב-20 ° C) לתקן תאים. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
			<li>לבטל את המאגר קיבעון, כתם בעדינות על מגבת נייר סופג. להשאיר צלחת פנים עד יבש למשך 10 דקות. הערה: משלב זה ואילך, ניתן לבצע assay מחוץ למכסה BSL2.</li>
			<li>להכין 5% חלב diluent פתרון חסימה ב- PBS מסוננים המכילה 0.05% polysorbate 20 (PBS-polysorbate, ראה טבלה של חומרים). על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים לצורך חסימת בהתבסס על 200/110 ובקו בארות: 200/טוב x 110 בארות = 22 מ"ל (חלב מרוכז מ ל 1.1 diluent ב 20.9 mL מסונן PBS-polysorbate). בשלב זה, גם להמציא פתרון חסימה מספיק נוגדנים ראשיים ומשניים. על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים עבור כל הפתרונות נוגדן מבוסס על בארות 50/טוב, 110: בארות 110 x 50/טוב = 5.5 mL. לכן, הנפח הכולל של חלב diluent חוסם את הפתרון הנדרש וזמינותו הלוח היחיד הוא 33 מ.</li>
			<li>להוסיף 200 /well של פתרון חסימה. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות להשליך את הפתרון על-ידי היפוך בעדינות את הצלחת, כתם על מגבת נייר סופג.</li>
			<li>להכין נוגדן עז X RSV שבערך (mAb-נוגדן ראשוני) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון mAb, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.</li>
			<li>להכין 1:5,000 אלקסה-עבור חיל הים החמור עז אנטי איג (נוגדנים משניים) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון נוגדנים משניים, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 5 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.</li>
			<li>לקרוא את לוחית הזיהוי בקורא נקודות אוטומטית באמצעות תעלת isothiocyanate (FITC) fluorescein ולספור הגדרות כמוצג באיור2. לעטוף את צלחת בנייר ולאחסן ב 4 º C. לכייל את המכשיר באמצעות צלחת שאינם בשימוש תרבות 96-ובכן, הזנת הגדרות לספור לפני וזמינותו. הערה: סריקה חוזרת תוך מספר ימים אפשרי אם נדרש. כיול והגדרת הרוזן יכול תישמר ולא שימשו את הסריקה בעתיד אם וזמינותו משתמשת מאותו סוג של צלחת המשמש את הכיול.</li>
			<li>בדוק את התמונות של בארות הפלאק החפץ או קטועים תא monolayers (איור 3). הכללת וולס עם monolayers תא קטועים. הערה: בהתאם לגודל של הפלאק החפץ, ספירות ידנית ייתכן שתצטרך לבצע עבור מאותן בארות או מאותן בארות ייתכן שתצטרך להיות מושלך מניתוח נתונים. קריטריונים לקבלת תוצאה חוקית כוללים אין תא שיבשו טפט או החפץ הפלאק זוהה שכפול אחד או יותר טוב, אין PFU זוהה בבארות שלילי (בארות ללא וירוס נוסף).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
לקבוע ריכוז ויראלי
		<ol>
<li>לבחור את שתי האחרונות דילולים איפה נקודות ניתן לספור בבירור. לחשב את המספר הממוצע של כתמים מבארות שכפל-דילול אותו. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים (PFU לכל מ ל) של המדגם מניות באמצעות הנוסחה שלהלן: PFU/מ"ל = המספר הממוצע של הפלאק / (דילול גורם × נפח של וירוס מדולל נוספות הבאר) הערה: ריכוז הוירוס נקבע עבור כל מניה RSV יכול כעת לשמש וזמינותו PRN (שלב 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. RSV ניטרול Assay
<ol><li>
צלחות זריעה (יום 1)
	<ol>
<li>Resuspend A549 תאים DMEM + 10% FCS + עט 1000 IU/סטרפ-/mL עונה 4 פרק 105. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל 4 x 104 A459 תאים, דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן). הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. לא מומלץ להשתמש A549 תאים לפני המעבר מספר 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת וירוס וסרום (יום 2) הערה: בהתאם לסוג לדוגמה, ישנם צעדים הנדרשים עבור דגימות מראש עיבוד לפני וזמינותו NAb. מומלץ להשתמש את RSV בינלאומי סטנדרטי סרה עכשיו זמינות על פי בקשה מן המכון הלאומי עבור פקדים (לסטנדרטיזציה) ותקני ביולוגי.<ol>
<li>
הכנת בסרום
		<ol>
<li>להפשיר את הנסיוב התייחסות אנושית RSV (הפניה סרום, שופט), סרום לבחון דגימות-בטל-RT. חום הדוגמאות סרום וההתייחסות בנסיוב באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש. להכין דילולים לפי התבנית צלחת (איור 4).</li>
			<li>להכין לדילול מטריים להכין הפניה למעורר מינימום של μL 110 של שופט מעורבבת עם DMEM + עט/סטרפ ללא FCS לכל צלחת assay (למשל, μL 1.5 של שופט, הנפח הכולל של 150 μL). להוסיף μL 110 בטחונות מדולל REF ב- A12 טוב של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי.</li>
			<li>להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות B12 כדי H12 בעמודה 12. לבצע סידורי דילולים 1:2 את הלוח על ידי העברת 55 μL row A בשורה B, ערבוב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים, שתמשיך עד השורה ה להשליך את μL 55 הסופי של מדיה, כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 55 μL. השתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.</li>
			<li>להכין מטריים דילול של נסיוב הבדיקה דוגמאות. כל הדוגמאות סרום הם לבדיקה שהפקידים, להכין נפח מינימלי של μL/טוב 110 x 3 = 330 μL עבור דגימה בדיקת סרום.</li>
			<li>להוסיף μL 110 של כל מדגם בדיקת סרום מדולל (1: 100; S1 = סרום 1, S2 = סרום 2, וכו '.) כדי המתאימים בארות A1 אל A9 וגם E1 כדי E9 של צלחת סטרילי 96-ובכן לפי איור 4.</li>
			<li>להוסיף μL 55 של DMEM + עט/סטרפ ללא FCS כדי כל בארות מתויג אקס בצע טורי 1:2 דילולים לפי שלב 2.2.1.3 עד שורה D (עבור דגימות 1, 2 ו- 3). למחוק את μL 55 הסופי של מדיה כך שאמצעי האחסון הסופי היטב כל 55 μL. באופן דומה, לבצע הטורי דילולים 1:2 על דגימות 4, 5 ו- 6 עבור שורות E ה הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.</li>
			<li>להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות בעמודות 10 ו-11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הכנת וירוס
		<ol>
<li>במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח.</li>
			<li>לדלל וירוס DMEM + עט/סטרפ ללא FCS מבוסס על ריכוז aliquot RSV שנקבע בשלב 1.3.2. החל לדילול שנותן כ PFU/טוב 200. היכונו הנפח הכולל של 5.5 mL (בארות 100).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הכנת תערובת וירוס-סרום
		<ol>
<li>להוסיף 55 של הנגיף מדולל בארות כל העמודות 1-9 ווולס שורות E-H של עמודות 10 ו-11 (בקרה חיובית) על פי התבנית צלחת (איור 4).</li>
			<li>להוסיף 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות כל שורות A-D של עמודות 10 ו-11 (בקרה שלילית). דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
חיסון וירוס לתאים A549
		<ol>
<li>לפני סיום תקופת דגירה, לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים בשלב 2.1.1. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent.</li>
			<li>למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי. לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.</li>
			<li>העברת /well 100 של תערובת וירוס-סרום הבארות המתאימים בצלחת תא A549 בעקבות התבנית צלחת Incubate הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
			<li>אחרי ה' 1, באמצעות פיפטה של, תוציא 90/היטב ולהוסיף 100 של prewarmed 1 x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + עט/סטרפ. תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הערה: ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
	<ol>
<li>לפתח קיבוע ואת וזמינותו הצלחת ביצוע השלבים 1.3.1.1 כדי 1.3.1.8.</li>
		<li>לקבוע את כייל ניטרול של 50%<ol>
<li>לקבוע שכייל ניטרול של 50% על-ידי חישוב המרחק פרופורציונלי בין סרום הדדיים של דילולים מעל ומתחת 50% של הפקד 'אין סרום' בארות (שליטה וירוס חיובי - עמודה 10, שורות E-H).</li>
			<li>לספור את מספר PFU (קרי, שלטי) הנובעות בודדים זיהומים נגיפיים סרום בארות, בארות שליטה ללא סרום. לחשב את מספר PFU אין נסיוב בקרה הבארות רשע וקבע את הערך 50%.</li>
			<li>לזהות דילולים סרום עם ספירות שהינם מיד מעל ומתחת הערך 50% אין נסיוב בקרה הבארות. באמצעות גרף למחצה להיכנס או תבנית גיליון אלקטרוני, להתוות את מספר PFU על ציר ה-x (סולם ליניארית), דילול סרום הדדיים בציר ה-y (יומן10 סולם). למתוח קו בין שתי נקודות וקרא titers 50% ניטרול של הבדיקה הדוגמאות סרום מהקו הזה. הערה: גליון assay RSV PRN (גליון משלים) משמש כדי לקבוע את כייל ניטרול של 50%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
<li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li>
<li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+%28RSV%29+vaccine+development%2C+Geneva%2C+25-26+April+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li>
<li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape%3A+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li>
<li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li>
<li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84(2005).</li>
<li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253(2012).</li>
<li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195(2013).</li>
<li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTripp%2C+RA+%22Human+respiratory+syncytial+virus%3A+methods+and+protocols%22">Human respiratory syncytial virus: methods and protocols</a>. , Humana Press. (2016).</li>
<li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li>
<li>McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y">http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y</a> (2017).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576(2014).</li>
<li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies%3A+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל ירידה לפרטים, ורגישות של זיהוי ספוט בהשוואה פלאק מסורתי איתור שיטות6,7. פעולה זו מאפשרת אפיון RSV זנים עם infectivity נמוך ומספק גם של כימות מדויק של RSV ריכוז לפני השימוש ב- P...

הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים4.
קיימות מספר תבניות assay NAb בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם, כולל מבחני מבוססת תא, מבוסס על מולקולרית, אשר עשו מאמצים סטנדרטיזציה מאתגר5,-6,-7,-8. עם זאת, וזמינותו ניטרול (PRN) פלאק קונבנציונלי-הפחתת המודד את מספר מופחת פלאק ויוצרים יחידות (PFU) על ידי הנוכחות של נוגדנים ספציפיים RSV נשאר עדיין תקן זהב9. כאן, אנחנו מדווחים פרוטוקול PRN משופרת מפושטת, תפוקה גבוהה יכול לשמש בשורות תאים רבים, זנים RSV ועם תפוקה מוגברת וזמינותו. פרוטוקול זה נבדקו באמצעות דגימות קליניות של הגדרות שונות, כמו גם על דגימות מן המודל החייתי ניסויים.

<table><tbody><tr><td><חזק>קו תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>מסופק על ידי ד"ר קית' צ'אפל, אוניברסיטת קווינסלנד</td></tr><tr><td><זנים חזקים>ויראליים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>מספר אצווה 60430286</td></tr><tr><td><חזקים>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor חמור נגד עזים IgG (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC אבקת מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (ללא סרום, 3.7 גרם/ליטר NaHC, P/S) (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג)</td> <td>שירותים מדעיים &ndash; תרבית</td><td></td> רקמות <td>MCRI באספקה ביתית</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (מאוחסן ב-50 מ"ל ב-20 מעלות; ג)</td> <td>נוגדן</td><td>Interpath SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-סרום רב-שבטי אנושי לנגיף סינציאלי נשימתי (RSV) (מאוחסן ב-45 ומיקרו; L aliquots ב-20 & deg; ג)</td> <td>משאבי BEI</td><td>NR-4022</td><td>הזמנה חינם דרך משאבי BEI בעת ההרשמה. סרום זה שייך לפאנל של אנטי-סרום אנושי וגלובולין חיסוני לאבקת RSV (NR-32832)</td></tr><tr><td>M199 Life</td><td>Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חסימת חלב מדלל (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C)</td> <td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (מאוחסן ב-6 מ"ל ב-20 מעלות; ג)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O ממתקן Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>In-house dispensation</td></tr><tr><td>סטרילי 1x PBS לתרבית (מאוחסן ב-4 מעלות; ג)</td> <td>שירותים מדעיים &ndash; תרבית</td><td></td> רקמות <td>MCRI באספקה ביתית</td></tr><tr><td>Tween 20 פוליסורבט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים מתכלים כלליים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז חרוטי (50 מ"ל)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון 0.22 &mu; m (500 מ"ל)</td>צינורות <td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf סטריליים (1.5 מ"ל)</td><td>Australia PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>צלחות סטריליות עם תחתית שטוחה (96 בארות עם מכסה)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>צלחות U-bottom סטריליות (96 בארות עם מכסה)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>אינטרפת'</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת קצה 1-200 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>TIP פיפטה 5-20 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>TIP פיפטה 100-1,000 ומיקרו; LClear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>TIP פיפטה 1-10 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery Racked מעוקר מראש 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Equipments and softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISpot מערכת קורא</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, שטרסבורג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AID ELISpot תוכנה גרסה 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, שטרסבורג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס syncytial הנשימה (rsv)

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ' נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.

טיטרציה של מלאי וירוס בוצעה מ 1:10 עד 1:108 דילול כדי לקבוע ריכוז מניות וירוס לפני וזמינותו PRN (נציג תוצאות המוצג באיור5). איור 5, PFU ניתן לספור באופן אמין-דילולים של 1:104 ו- 1:105. המספר הממוצע של PFU מבארות triplicate-הדילול באותו מחושב. מאז המספר הממוצע של נקודות ב- 1:105 דילול בת 14, כייל ויראלי של מלאי ויראלי זה נקבע כדלקמן:
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

יש צורך בשיטת תפוקה מדויקת וגוהה למדידת נוגדנים לנטרול RSV, כסמן חשוב להגנה מפני וירוס סינפטיאלי נשימתי. שיטה זו היא מאוד לשכפל עם וריאציות בין assay עבור antiserum התייחסות להיות פחות מ 10%אנו מאמינים כי בדיקה זו ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם בעלות נמוכה יחסית. אנו מתארים כאן בדיקה מבוססת מיקרו-נטרול הדמיה שנבדקה בקבוצת משנה A של RSV, וגם יכולה להיות מותאמת לקבוצת משנה B של RSV ולסוגי מדגמים שונים.הדגמת ההליך תהיה ראובן Tse, חבר בצוות המחקר ב MCRI. כדי לזרוע צלחות ביום הראשון, הראשון resuspend A549 תאים במדיה DMEM, עם 10%FCS ו 1, 000 יחידות פניצילין-סטרפטומיצין תערובת בריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר. ואז זרע 96 צלחות סטריליות שטוחות תחתית עם 40, 000 תאי A459 בצפיפות של 100 מיקרוליטרים ל באר.דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני לילה. כדי להכין את דילול הסרום ביום השני, הפשרו תחילה את דגימות מבחן RSV וסרום אנושיות בטמפרטורת החדר. ואז למקם אותם באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לחמם ולהפעיל אותם.לאחר מכן, להכין יותר מ 110 microliters של אחד עד 100 דילול של סרום הייחוס על ידי ערבוב 1.5 microliters של סרום התייחסות עם מדיה DMEM ללא FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין לנפח סופי של 150 microliters. פיפטה 110 מיקרוליטרים של דילול זה לתוך גם A12 של צ

an-improved-high-throughput-respiratory-syncytial-virus-rsv-micro

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Bouillier, C., ועמיתיהם יצירה, הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)הסרטון מדגים בדיקת טיטרציה של פלאקים (plaque titration assay) המשמשת לכימות של נגיף סינציטנלי נשימתי (RSV) רקומביננטי זיהומי בשכבות מונו-שכבה של תאי אפיתל. הוא מציג את הדבקת תאי המאכסן באמצעות תרחיפי נגיף בדילולים סדרתיים, את הגבלת התפשטות הנגיף על ידי שכבת כיסוי חצי-מוצקה מבוססת תאית, ואת היווצרות פלאקים מקומיים כתוצאה מאפקטים ציטופתיים. הפרוצדורה מסתיימת בצביעה, דה-קונטמינציה...

בדיקת טיטרציה של פלאקים לכימות של נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV) זיהומי

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת נוגדנים מנטרלים כנגד נגיף סינסיטיאלי נשימתי (RSV). טרום דגירה עם סרום המכיל נוגדנים מנטרלי RSV מנטרל את חלקיקי הנגיף, מפחית זיהום תאי והיווצרות פלאק. תאים נגועים בנגיף עוברים לאחר מכן קיבוע, חסימה ותיוג נוגדנים מצומדים פלואורופורים להדמיית פלאק. תהליך זה מאפשר זיהוי של דילול הסרום הגבוה ביותר המנטרל חמישים אחוז של RSV, המייצג את טיטר הניטרול.

בדיקה למדידת נוגדן מנטרל titer ספציפי עבור וירוס סינסיטיאלי נשימתי

הנגיף הסינציאלי הנשימתי האנושי (HRSV) יכול לגרום לברונכיוליטיס חמורה בתינוקות צעירים. חלק מהפתוגנזה של מחלת HRSV חמורה נגרמת על ידי התגובה החיסונית של המארח. גירוי של תאי חיסון אנושיים ראשוניים עם HRSV מספק מערכת מודל מהירה וניתנת לשחזור לחקר הפעלה של מסלולים דלקתיים וזיהום.

מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

למד שיטת מיקרו-ניטרוליזציה מבוססת הדמיה לכימות נוגדנים נטרליזציה נגד RSV. השיטה מדגימה שחזוריות גבוהה עם שונות בין מבחנים של פחות מ-10% וניתנת להתאמה לסוגי דגימות שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

גלה סרטונים נוספים