Biochemistry
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पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना
Chapters
Summary March 23rd, 2020
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हम जटिल जैविक नमूनों से सर्वव्यापी प्रोटीन से उत्पन्न होने वाले डिग्ली पेप्टाइड्स की शुद्धि, पता लगाने और पहचान के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत विधि सर्वव्यापकविश्लेषण की गहराई के स्तर के संबंध में प्रकाशित तरीकों को पुन: उत्पन्न, मजबूत और बेहतर प्रदर्शन करती है।
Transcript
छोटे प्रोटीन सर्वव्यापकता द्वारा प्रोटीन के पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन सेल में कई घटनाओं में शामिल है। यह अध्ययन प्रोटीन सर्वव्यापकता विश्लेषण के लिए टूलबॉक्स के लिए एक मूल अतिरिक्त प्रस्तुत करता है। हम गहरी सर्वव्यापकता को उजागर करने के लिए संवर्धन तकनीकों और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करते हैं।
हमने डाइगली पेप्टाइड्स के विश्लेषण में कई सुधार किए हैं जो सर्वव्यापी प्रोटीन से उत्पन्न होते हैं। इनमें संवर्धन से पहले क्रूड पेप्टाइड अंश और ऑर्बिटरैप में अधिक उन्नत पेप्टाइड विखंडन सेटिंग्स का उपयोग शामिल है। कुल मिलाकर यह सर्वव्यापकिनोम का एक बड़ा कवरेज में परिणाम है ।
प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को शब्दों में वर्णन करना मुश्किल है। एक अलग प्रयोगशाला में विभिन्न ऑपरेटर द्वारा इन विश्लेषणों को दोहराने में सक्षम होने के लिए कुछ प्रमुख चरणों का दृश्य आवश्यक है। प्रक्रिया का प्रदर्शन करेल बेजस्टारोस्टी द्वारा किया जाएगा, जो मेरी प्रयोगशाला में एक वरिष्ठ तकनीशियन हैं।
प्रयोग के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं या माउस मस्तिष्क ऊतक तैयार करके शुरू करें। यदि कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, तो बर्फ की ठंड के दो मिलीलीटर में एक 150 सेंटीमीटर चुकता संस्कृति प्लेट से सेल पेलेट को lyse करें, 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोटल के साथ 50 मिलीमोलर ट्रिस एचसीएल। पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर lysate उबाल लें।
इसके बाद इसे 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सोनिकेट करें। यदि वीवो माउस मस्तिष्क ऊतक में उपयोग कर रहे हैं, तो इसे 100 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल, 12 मिलीमोलर सोडियम डिऑक्सीकोटल और 12 मिलीमोलर सोडियम एन-लॉरॉयलसरकोसिनेट युक्त आइस कोल्ड बफर में lyse करें। सोनीकेटी को 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ले जाया गया ।
इसके बाद इसे पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। इसके बाद, कैलोरीमेट्रिक अवशोषण बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके कुल प्रोटीन राशि का मात्रा निर्धारित करें, जो सफल डिग्ली पेप्टाइड इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए कम से कम कई मिलीग्राम होना चाहिए। SILAC प्रयोगों के लिए, कुल प्रोटीन राशि के आधार पर एक से एक अनुपात में प्रकाश और भारी लेबल प्रोटीन मिलाएं ।
50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पांच मिलीमोलर डीटीटी के साथ सभी प्रोटीन को कम करें। और बाद में उन्हें अंधेरे में 15 मिनट के लिए 10 मिलीमोलर iodoacetamide के साथ alkylate । इसके बाद चार घंटे तक Lys-C के साथ प्रोटीन पाचन करें।
और 30 डिग्री सेल्सियस, या कमरे के तापमान पर रात भर में ट्रिपसिन पाचन। अगले दिन, नमूने को दो मिलीलीटर एप्पेंडोर्फ ट्यूबों में विभाजित करें और सभी डिटर्जेंट को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर 0.5% अपकेंद्रित्र की अंतिम एकाग्रता में पचाए गए नमूने में टीएफए जोड़ें। बाद के अंश के लिए सुपरनेट युक्त पेप्टाइड को इकट्ठा करें।
ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए उच्च पीएच रिवर्स चरण C18 क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करें। प्रोटीन डाइजेस्ट के बारे में 10 मिलीग्राम के लिए स्थिर चरण सामग्री के 0.5 ग्राम से भरा एक खाली छह मिलीलीटर कॉलम कारतूस तैयार करें। पेप्टाइड्स को तैयार कॉलम पर लोड करें और इसे 0.1% टीएफए के लगभग 10 वॉल्यूम के साथ धोएं, इसके बाद 10 वॉल्यूम पानी।
क्रमशः सात, 13.5 और 50% एसीटोनि्रिल के साथ 10 मिलीमोलर अमोनियम फोरमेट के 10 कॉलम वॉल्यूम का उपयोग करके पेप्टाइड्स को तीन अंशों में एल्यूट करें। फिर, लिथोलिस सभी अंशों को। सर्वव्यापकता अवशेष आकृति एंटीबॉडी का एक बैच प्रोटीन के लिए संयुग्मित एक agarose मनका घोल छह बराबर अंशों में विभाजित है ।
पांडुलिपि दिशाओं के अनुसार तीन पेप्टाइड अंशों को भंग करें और मलबे को नीचे स्पिन करें। बर्फ पर अन्य तीन अंशों को रखते हुए मनका घोल में तीन अंशों के सुपरनेटेंट जोड़ें। और उन्हें एक रोटेटर इकाई पर चार डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
फिर, मोतियों को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को मोतियों के नए बैच में स्थानांतरित करें। और शेष तीन मनका घोल अंशों के साथ इनक्यूबेशन दोहराएं।
बाद के वैश्विक प्रोटेम विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट स्टोर करें। और मोतियों को 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप्स में स्थानांतरित करें जो जीएफएफ फिल्टर प्लग से लैस हैं। एक अपकेंद्रित्र टिप एडाप्टर से लैस १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में युक्तियां रखो और बर्फ ठंडी IAP बफर के २०० माइक्रोलीटर के साथ तीन बार मोतियों को धोएं, इसके बाद बर्फ ठंडे शुद्ध पानी के साथ तीन वॉश करें ।
वॉश के बीच दो मिनट के लिए 200 बार जी पर कॉलम को नीचे स्पिन करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि कॉलम को सूखा न चलने दें। अंतिम धोने के बाद, पेप्टाइड्स को 0.15% टीएफए के 50 माइक्रोलीटर पर दो चक्रों के साथ एल्यूट करें। सी18 स्टेज टिप के साथ पेप्टाइड्स को डेसाल्ट करें और उन्हें वैक्यूम अपकेंद्री के साथ सुखाएं।
एक नैनोफ्लो एलसी प्रणाली के साथ मिलकर एक संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमीटर पर एलसी-एमएस/एमएस प्रयोग करें । स्तंभ पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार स्थापित किया गया है और ५० डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है । डेटा निर्भर अधिग्रहण मोड में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करें।
4E5 के स्वचालित लाभ नियंत्रित लक्ष्य सेटिंग और 50 मिलीसेकंड के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ उच्च रिज़ॉल्यूशन पर एमएस 1 मास स्पेक्ट्रा एकत्र करें। तीन सेकंड के कुल चक्र समय के साथ शीर्ष गति विधि का उपयोग करके, सबसे तीव्र पहले मोड में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करें। फिर कम से कम तीव्र पहले मोड में डीडीए एमएस विश्लेषण का दूसरा दौर करें, जो कम बहुतायत पेप्टाइड्स का इष्टतम पता लगाना सुनिश्चित करेगा।
उनके प्रभारी राज्यों और मोनोसोटोपिक पीक असाइनमेंट के अनुसार अग्रदूत आयनों को फ़िल्टर करें। और पहले 60 सेकंड के लिए गतिशील रूप से पूछताछ की अग्रदूत को बाहर करें। पेप्टाइड अग्रदूतों को एक क्वाड्रपोल मास फिल्टर के साथ अलग करें जो 1.6 थॉमसन की चौड़ाई तक सेट होता है।
फिर 50 मिलीसेकंड के अधिकतम इंजेक्शन समय और 30% की एचसीडी टकराव ऊर्जा के साथ 7E3 के स्वचालित लाभ नियंत्रण में आयन जाल में MS2 स्पेक्ट्रा एकत्र करें, एक उपयुक्त खोज इंजन का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री कच्ची फाइलों का विश्लेषण करें, जैसे एंड्रोमेडा खोज इंजन के आधार पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध मैक्सक्विंट सॉफ्टवेयर सुइट। मैक्सक्विंट खोलें और उपयुक्त कच्चे डेटा फ़ाइलों का चयन करें। प्रोसेसर की संख्या सेट करें और समूह विशिष्ट मापदंडों टैब पर क्लिक करें।
पाचन का चयन करें, और तीन चूक गए दरार के लिए अनुमति दें। फिर संशोधनों का चयन करें और परिवर्तनीय संशोधनों में diGly जोड़ें। वैश्विक मापदंडों टैब का चयन करें और सही प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस जोड़ें।
अन्य सेटिंग्स को डिफ़ॉल्ट रूप में छोड़ दें और डेटाबेस खोज करने के लिए शुरू करें। SILAC प्रयोग फ़ाइलों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, दो करने के लिए बहुलता सेट, और भारी अमीनो एसिड लेबल का चयन करें। जब खोज समाप्त हो जाती है, तो टेक्स्ट फ़ाइलों को पर्सियस में आयात करें।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग नैनोफ्लो एलसी-एमएस/एमएस के साथ डिग्ली पेप्टाइड्स का पता लगाकर सुसंस्कृत कोशिकाओं और वीवो सामग्री में प्रोटीन में सर्वव्यापी स्थलों की पहचान करने के लिए किया गया था । मौजूदा प्रोटोकॉल में कई सुधार किए गए जिसके परिणामस्वरूप पता चला डिग्ली पेप्टाइड्स की संख्या अधिक हुई। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन से पहले तीन अंशों में कच्चे तेल का अंश किया गया था।
अंशों में से एक में सर्वव्यापी का अपना K48 संशोधित ट्राइप्टिक डिग्लि पेप्टाइड होता है, जो एलसी क्रोमोटोग्राम में एक व्यापक चोटी की विशेषता है। इसके अलावा, पेप्टाइड विखंडन शासन को एलसी-एमएस को डेटा विश्लेषण प्रक्रिया में उच्चतम पहले और सबसे कम पहले विखंडन व्यवस्थाओं के साथ संचालित करने के लिए समायोजित किया गया था, जिसने 4, 000 से अधिक अतिरिक्त अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स का उत्पादन किया था। 23, 000 से अधिक डिग्ली पेप्टाइड्स को नियमित रूप से एक प्रोटीसोम अवरोधक के साथ इलाज किए गए हेला कोशिकाओं के एक नमूने से पहचाना जा सकता है।
तीन जैविक प्रतिकृति स्क्रीन पर पहचाने गए सभी डिग्ली पेप्टाइड्स में से, 9, 000 से अधिक तीनों में मौजूद थे, जबकि 17, 000 से अधिक तीन प्रतिकृति में से कम से दो में मौजूद थे। पेप्टाइड पहचान की संख्या इनपुट सामग्री की मात्रा पर अत्यधिक आकस्मिक है। शुरुआती सामग्री के आधार पर पहचाने गए डिग्लि पेप्टाइड्स की अनुमानित संख्या की उम्मीद की जा सकती है, लेकिन ये संख्याएं केवल अनुमान हैं और उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के प्रकार पर भी निर्भर करेंगी।
इस प्रोटोकॉल को अंजाम देते समय, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स विधियों और मिनट के नमूना मात्रा को संभालने और विश्लेषण करने के साथ पूर्व अनुभव निश्चित रूप से लाभप्रद होगा। मैक्सक्विंट सॉफ्टवेयर को एल्गोरिदम खोजने वाले किसी भी अन्य डेटाबेस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा एक अलग प्रकार के मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जा सकता है।
पेप्टाइड पहचान के संदर्भ में परिणाम थोड़ा अलग हो सकते हैं, लेकिन यह किसी भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स परख के लिए विशिष्ट है। सर्वव्यापी प्रोटीन क्षरण की प्रगति में महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी कोशिका में कई अन्य प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभाता है। एक पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन के रूप में सर्वव्यापी का गहरा ज्ञान इसके कार्य को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
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