Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

3D-cultuur maakt het moeilijker om cellulaire functie te meten, met behulp van standaard biologische testen. Dit protocol maakt het mogelijk cellulaire en somatische activiteit te meten zonder verdere monsterverwerking, met behulp van een tl-sensor en een standaard microplate-lezer. Dit protocol maakt een aantal nieuwe toepassingen mogelijk, waaronder een screening van geneesmiddelen met een hoge doorvoer.

Bovendien kan de tl-sensor worden uitgewisseld met een andere sensor om andere proteases of celfuncties te meten. Het is belangrijk om het experiment zorgvuldig van tevoren te plannen, alle berekeningen voor de hydrogelvoorbereiding te voltooien en alle apparatuur en reagentia in te stellen om de tijd cellen in suspensie te minimaliseren. Om te beginnen, bereid de testmedia met 1%houtskool gestript Foetaal runderserum, twee mM L-glutamine, 10 eenheden per mL penicilline en 10 microgram per mL streptomycine.

Gebruik geen fenol rode media, die meer fluorescentie interferentie heeft. Om positieve controles te maken, voeg bacteriële collagenase enzym type een aan de testmedia bij de concentraties van 10 en 1000 microgram per mL. Bereid vervolgens de hydrogelprecursoroplossing voor door de reagentia toe te voegen aan een buis van 1,5 mL.

Zorg ervoor dat vortex na toevoeging van elk onderdeel. Verdeel de oplossing vervolgens in meerdere buizen van 1,5 mL voor verschillende omstandigheden. Om cellen in hydrogels in te kapselen, moet u eerst een eencellige suspensie voorbereiden door een schotel van 10 cm A375 melanoomcellen met 10 mL PBS te wassen.

Voeg vervolgens 0,05% trypsine toe aan de schotel om cellen te trypsiniseren. Broed de schotel op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, gedurende drie minuten. Tel na incubatie de cellen met een hemocytometer.

Vervolgens centrifugeren de celoplossing op 314 keer G gedurende drie minuten. Aspirate de cultuur media, en resuspend cellen in PBS buffer op ongeveer drie keer de uiteindelijke ingekapselde dichtheid. Tel de cellen opnieuw om een nauwkeurige celconcentratie te garanderen.

Voeg vervolgens zwevende cellen in PBS toe aan elke buis van de hydrogelprecursoroplossing volgens de vereiste zaaidichtheid en meng door op en neer te pipetten. Voor gecontroleerde omstandigheden, alleen toe te voegen PBS en vortex. Vervolgens pipette 10 microliters van de hydrogel precursor oplossing in het midden van elke put van een steriele, zwarte, ronde bodem 96 put plaat.

Visueel inspecteren van de plaatsing van de hydrogels in de putten. Niet-gecentreerde hydrogels kunnen worden verplaatst met behulp van een pipetpunt voor polymerisatie. Om de hydrogel precursor oplossing te polymeriseren, stel de plaat bloot aan UV-licht op 4 milliwatt per vierkante centimeter, gedurende drie minuten.

Voeg vervolgens 150 microliter van de testmedia toe aan alle putten met ingekapselde cellen en 150 microliters van het collagenase enzymoplossing aan de putten van positieve controles. Voeg 150 microliter PBS-buffer toe aan de buitenste putten van de plaat om verdamping tijdens incubatie te verminderen. Gebruik een microplatelezer om de fluorescerende intensiteit van de plaat op nul uur te meten, onmiddellijk na inkapseling.

Selecteer het ondoorzichtige 96 putplaatprotocol met 494 nanometer excitatie en 521 nanometer emissiegolflengten. Vervolgens, incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide, gedurende 18 uur. Voeg vervolgens metabolische activiteit reagentia op een een tot 10 volume verhouding per goed voor alle voorwaarden en controles.

Broed de plaat in 37 graden Celsius, 5%kooldioxide, gedurende zes uur. Tot slot, meet de fluorescerende intensiteit van de plaat op 24 uur, na inkapseling. Selecteer het ondoorzichtige 96 putplaatprotocol, met 494 nanometer excitatie en 521 nanometer emissiegolflengten, voor MMP-activiteit.

Om de metabolische activiteit te meten, selecteert u 560 nanometer excitatie, en 590 nanometer emissiegolflengten. In deze studie worden de quencher en fluoroforie gescheiden na blootstelling van de fluorogene sensor aan de juiste protease en fluorescentie. Fluorescentiemetingen van de geïncubeerde hydrogels met bacteriecollageenzym type één, tonen aan dat het laagste gedetecteerde signaal werd geproduceerd door negatieve controles, zonder collagenase.

Terwijl het hoogste gedetecteerde signaal werd geproduceerd door 1000 microgram per mL collagenase of hoger, wanneer het signaal begint te plateau. Het berekende werkbereik was van ongeveer 0,16 tot 474 microgram per mL collagenase. Fluorescentiemetingen voor A375 melanoomcellijn, ingekapseld in een reeks dichtheden direct na inkapseling, waren laag over zaaien dichtheden, en vergelijkbaar met gels controle zonder cellen zoals verwacht.

24 uur na de inkapseling was de MMP-activiteit direct evenredig met de zaaidichtheid en vallen de zaaidichtheid van of meer dan 1 miljoen cellen per mL binnen de grenzen van het werkbereik. Metabolische activiteitsmetingen van de A375-cellijn waren ook direct evenredig met de celzaaidichtheid. Door mmp-activiteit te normaliseren tot metabole activiteit, was er geen significant verschil in MMP-activiteit per cel bij het zaaien van dichtheden groter dan 2 miljoen cellen per mL.

Goede pipetting technieken is belangrijk. Dit omvat tips voorbevochtiging om nauwkeurige volumes van viskeuze oplossingen te bereiken. Ook centreren hydrogel precursor oplossing binnen de put, is van cruciaal belang om nauwkeurige metingen te bereiken door de plaatlezer.

Om specifieke MMP’s te identificeren die bijdragen aan de MMP-activiteit die hier wordt gemeten, kunnen expressietesten zoals western blot of PCR worden gebruikt. Het gebruik van levende cellen vereist een goede bioveiligheidsprocedure, aseptische techniek en een biologische veiligheidskast. Het UV-licht is gevaarlijk, gebruik een schild om de gebruiker te beschermen en kijkt niet direct in het licht.