Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Denne protokol giver en streng og reproducerbar teknik til ekstraktion og isolering af små ekstracellulære vesikler fra hele vævsprøver til downstream ex vivo-analyser. Med blandt de højeste niveauer af renhed i øjeblikket opnåelige, denne metode letter den direkte morfologiske, immunophenotypic, og dyb karakterisering af interstitielle vesikler udskilles i forskellige vævsprøver, herunder tumorer. Her demonstrerer vi isolering af vævs-el fra hjerne- og lungetumorprøver.

Men, denne teknik kan anvendes til undersøgelser ved hjælp af forskellige, godartede, eller andre tumor prøver samt. Til at begynde, forberede 10 milliliter dissociation buffer i Dvale-E medium for hver 0,4 til 1,0 gram væv. Tilsæt hele frisk eller frosset væv til bufferen i en 50 milliliter rør, og inkuberes i et varmt vandbad ved 37 grader celsius i 20 minutter.

Derefter tilsættes protease- og fosfatasehæmmere til en endelig 1x koncentration i dissociationsbufferen. Hæld opløsningen med vævet i en løs pasform downs homogenisator. Brug ca. 30 langsomme strøg pr. prøve til forsigtigt at adskille vævet.

Derefter overføres den dissocierede vævs- og bufferopløsning til et konisk rør på 50 milliliter. Centrifuge ved 500x g og ved fire grader celsius i fem minutter for at pellet cellerne og de resterende fibre eller sammenhængende vævsfragmenter. Overfør supernatanten til et rent 50 milliliter konisk rør, og centrifuge ved 2, 000x g og ved fire grader celsius i 10 minutter for at pelletere og kassere de store cellulære snavs.

Overfør denne supernatant til en ren 50 milliliter konisk rør, og centrifuge ved 10, 000x g og ved fire grader celsius i 40 minutter til pellet eventuelle uønskede større vesicles eller små apoptotiske organer. Supernatanten dekanteres gennem et 0,45 mikrometerfilter i et rent 12 milliliter ultracentrifugeringsrør. Dernæst ultracentrifuge prøven ved 100, 000x g og ved fire grader celsius i to timer, at pellet små elbiler.

Dekanter supernatanten og lad de ultracentrifugeringsrør vendes om i fem til 10 minutter, og der trykkes ofte for at fjerne eventuel resterende væske på siderne af rørene. Derefter resuspend ev pellet i 1,5 milliliter 0,25 molar saccharose buffer. Dæk rørene med Parafilm, og vortex elverne til løsning.

Rock ultracentrifugerørene i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Og så vortex igen. Rørene centrifugeres kortvarigt med en hastighed på under 1.000 x g for at genvinde væskeaffjedringen i bunden af røret.

Hvis det er nødvendigt, opbevares suspensionen ved fire grader celsius natten over. Først tilsættes 1,5 milliliter 60% iodixanol til de 1,5 milliliter af saccharose tris buffer, der indeholder eldrevne køretøjer til at skabe en endelig opløsning, der indeholder 30% iodixanol. Pipette op og ned flere gange for at blande opløsningen grundigt.

Denne opløsning overføres til bunden af et 5,5 milliliter ultracentrifugeringsrør. Dernæst blandes 60% iodixanol bestand med ultra rent vand til at forberede mindst 1,5 milliliter af både en 20% og en 10% iodixanol opløsning. Ved hjælp af en sprøjte og en 18 gauge nål, måle 1,3 milliliter af 20% iodixanol opløsning og omhyggeligt lag det på toppen af bunden gradient.

Hold kanylens facet i kontakt med indersiden af røret lige over menisken og tilsæt opløsningen dråbe klogt for at undgå at blande lagene på tætheden interface. Derefter lag 1,2 milliliter af 10% iodixanol opløsning på toppen af 20%-laget, ved hjælp af samme teknik. Balanceret forsigtigt og indlæs ultracentrifugeringsrørene i rotorspande.

Indstil accelerations- og decelerationshastighederne for en svingspandrotor til minimumshastighederne, og centrifugering ved 268, 000x g og ved fire grader celsius i 50 minutter. Mens prøven centrifugeres, mærkes 10 1,5 milliliter mikrocentrifugerør for hver prøve, der svarer til fraktioner 1 til 10 af massegradienten. Når centrifugering er færdig, skal du forsigtigt fjerne rørene fra rotorspandene og placere dem i en stabil holder.

Pipette 10 serielle fraktioner af 490 mikroliter fra toppen af gradienten til de tilsvarende rør. Ved hjælp af et refraktometer måles brydningsindeksene for fraktionerne. Derefter overføres hver fraktion til et rent 12 milliliter ultracentrifugeringsrør.

Tilsæt fem milliliter 1x PBS til hvert rør og pipette op og ned langsomt for at blande. Tilsæt yderligere seks milliliter 1x PBS til toppen af røret, og bland forsigtigt igen. Ultracentrifuge rørene ved 100, 000x g og ved fire grader celsius for at re-pellet de små vesicles.

Supernatanten dekanteres, og rørene tørres, før vesiklerne lyser for proteinanalyse eller reresuspending af eldrevne køretøjer til morfologisk analyse. For at lyse eldrevne køretøjer til proteinanalyse tilsættes 40 mikroliter stærk lysisbuffer indeholdende proteasehæmmer til EV-pellets. Placer Parafilm over hvert rør, og vortex kraftigt.

Dernæst rock rørene i 20 minutter ved stuetemperatur og vortex igen. Prøven centrifugeres kort ved 1,000x g i 30 til 60 sekunder for at genvinde hele prøvevolumenet. Hver prøve overføres til et nyt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, og den opbevares ved en temperatur på mellem 20 og 80 grader celsius, indtil det er klar til videre behandling.

For at forberede de rensede lysater til immunoblotanalyse tilsættes 5x Laemmli prøvebuffer til prøverne for en endelig koncentration på 1x. Prøven koges ved 95 grader celsius i fem til 10 minutter. Indlæs derefter en tilsvarende mængde brøker en til 10 i en 10% SDS-sidegel.

Belastning en lige masse af væv homogenat. Udfør elektroforese og western blot analyse for at bekræfte EV proteiner i de rensede lysater og sammenligne relative EV overflod i fraktioner. I denne undersøgelse udvindes og renses ekstracellulære vesikler fra hele vævet.

Efter ultracentrifugering af 10 til 30% iodixanol gradient, en population af lette elbiler kan ses migrere op til fraktion to, mens en population af tætte elbiler kan ses migrere op til fraktion fem, afhængigt af vævstype. Repræsentative immunoblots af gradient fraktioner udviser effektiv adskillelse og rensning af små tumor afledte elbiler i fraktion fem. Især, lunge tumor prøver synes beriget i tætte elbiler i forhold til lette elbiler, der tidligere blev høstet fra hele hjernen væv.

Repræsentativ nanopartikelsporingsanalyse og elektronmikroskopi af vævsafledte vesikler i den fremherskende vesikel, der indeholder fraktion, viser tilsætning og konservering af hele vesikler. I overensstemmelse med små elbilers kendte størrelse og struktur. Interstitielle elbiler repræsenterer lovende mål for udviklingen af nye diagnostiske eller prognostiske biomarkøranalyser.

Denne teknik giver forskerne værktøjer til ekstraktion og rensning af vesikler til downstream nytte. Efter ekstraktion af hele eller lysede vævs-eVs kan der udføres en bred karakterisering af vesikler, herunder proteomiske, genomiske og lipidomic analyser. Derudover kan prøver anvendes til mere målrettede tilgange.

Vesicles isoleret direkte fra vævsprøver kan give yderligere indsigt i sygdomsmekanismer, herunder tumorgener, og kan give vigtige diagnostiske eller prognostiske værktøjer i fremtiden.