Name: In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri un metodo di co-cultura in vitro per valutare l'attività antitumorale delle cellule CAR T contro cellule di glioblastoma attraverso sfide tumorali ripetute. Questa tecnica consente screening ad alto rendimento.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) grant TR3-05641 e sovvenzioni NIH P30 CA33572 (Core). D.W. è supportato da NCI fellowship 1F99CA234923-01.

Nostri IRB non richiede la modifica del presente protocollo. Riceviamo campioni tumorali di glioblastoma fresco scartati dalla città della speranza dipartimento patologie che sono codificate, e il nostro laboratorio non può accedere alla chiave. Riceviamo i campioni con dati solo su preventiva dello stato di malattia e trattamento al momento della biopsia/resezione, con nessun dati identificativi.
1. Media preparazione
<ol><li>Preparare il supporto di cellule staminali neurali per la coltura di linee di cellule GBM primarie: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µ g/mL eparina e 2 mmol/L L-Glutammina; completati con 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF) e 20 ng/mL basic fibroblast growth factor (FGF) due volte a settimana (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Preparare il supporto di cellula T: 15 X-VIVO contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS); completati con 70 IU/mL rhIL-2 e 0,5 ng/mL rhIL-15 ogni 48 ore (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Preparare il supporto di co-coltura: prendere delle cellule staminali neurali media senza supplemento EGF e FGF e aggiungere 10% FCS.</li>
	<li>Preparare FACS macchiatura soluzione (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. preparazione delle cellule del tumore GBM
<ol><li>Raccogliere sfere di basso-passaggio GBM tumore (TSs) mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti ed eliminare il surnatante. Nota: Tumore GBM sfere (TSs) vengono generati da resecato tumori come descritto in precedenza22,23,24e mantenuto in media delle cellule staminali neurali, in incubatrice con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Preriscaldare la co-coltura in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di freddo accutase a GBM TSs, dissociare TSs pipettando per 30-60 s e fermare la dissociazione aggiungendo 5 mL di caldo di co-coltura. Nota: GBM TSs non dovrebbero essere tenuti su accutase per più di 5 min.</li>
	<li>Raccogliere le cellule GBM mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di co-coltura.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di attuabilità delle cellule. Nota: Attuabilità delle cellule deve essere > 70%.</li>
</ol>3. preparazione delle cellule di T di auto
<ol><li>Meno di 24 ore prima del saggio, prendere 100 µ l di cellule T auto coltivate in un tubo di citometria a flusso e aggiungere 2 mL di FSS. Nota: Cellule T auto sono state generate come descritto in precedenza11,21 e coltivate in media delle cellule T.</li>
	<li>Centrifugazione a 300 x g per 4 min e scartare surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g per 4 min ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Macchia le cellule con l'anticorpo appropriato per indicare l'espressione di auto a 4 ° C per 30 min. Nota: Ad esempio, se un'auto IL13Rα2-mirati descritto precedentemente25 è utilizzato, quindi macchia con l'anticorpo anti-IL13.</li>
	<li>Lavare due volte con 2 mL di FSS e analizzare exn auto utilizzando un citometro a flusso.</li>
	<li>Determinare la % di auto sulle cellule T utilizzando la strategia di gating illustrata nella Figura 1B.</li>
	<li>Al giorno di co-coltura, raccogliere tutte le auto T cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di co-coltura.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di attuabilità delle cellule. Nota: Attuabilità delle cellule deve essere > 70%.</li>
</ol>4. messa a punto del tumore — co-coltura delle cellule T
<ol><li>Diluire le cellule del tumore per una concentrazione di 0,16 milioni/mL con mezzi di co-coltura.</li>
	<li>Basato su auto %, diluire le cellule di T auto a una concentrazione di cellule/mL di 0,04 milioni auto+ con mezzi di co-coltura. Nota: Ad esempio, se l'auto è del 50% e la concentrazione delle cellule T è 0,4 milioni/mL, quindi fare una diluizione 1:5 per ottenere la concentrazione finale di 0,04 milioni auto+ cellule/mL.</li>
	<li>Pipettare 100 µ l di cellule del tumore diluito in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti a fondo piatto.</li>
	<li>Pipettare 100 µ l di cellule di T di auto diluite in ciascun pozzetto che contiene ben mix e le cellule del tumore. Nota: Ogni co-coltura delle cellule di tumore-T sarà analizzato a 4 punti di tempo. 4-6 ripetizioni potrebbero essere richiesti a ogni volta punto basato su analisi diverse, ma < 3 ripetizioni per punto nel tempo non è consigliato; vedere la tabella 1 per un rappresentante platemap.</li>
	<li>Mantenere la piastra in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>5. tumore delle cellule Rechallenge
Nota: Rechallenge avviene a 2, 4 e 6 giorni dopo l'installazione iniziale di co-coltura (Figura 1A).
<ol><li>Raccolto e dissociare GBM TSs come descritto sopra (punti 2.1-2.6).</li>
	<li>Risospendere le cellule GBM ad una concentrazione di 0,64 milioni/mL.</li>
	<li>Determinare i pozzi di co-coltura che bisogno rechallenge (Vedi tabella 1) e rimuovere con cura 50 µ l supporto dalla parte superiore di ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della sospensione di cellule GBM in ciascun pozzetto e mescolare bene, quindi rimettere la piastra a 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>6. raccogliere campioni e analisi Cytometric di flusso
Nota: I campioni saranno raccolti a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo che l'installazione iniziale di co-coltura, con 1, 2, 3 e 4 giri di sfida del tumore, rispettivamente.
<ol><li>Soluzione di tripsina-EDTA 0,05% pre-riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Determinare i pozzi che bisogno di raccogliere e trasferire i media in una piastra a 96 pozzetti turno-fondo nuova.</li>
	<li>Pipettare 50 µ l di tripsina-EDTA nei pozzetti per digerire le cellule del tumore rimanente a 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>Sotto un microscopio, confermare che le cellule sono staccate dal fondo.</li>
	<li>Pipettare intorno alla parte inferiore ben per risospendere le cellule indipendente, quindi trasferire la tripsina-EDTA contenente cellule indipendente ai rispettivi pozzetti della piastra 96 pozzetti turno-inferiore.</li>
	<li>Centrifuga della piastra a 96 pozzetti turno-inferiore a 300 x g, 4 ° C per 4 min, poi gettare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l/pozzetto di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 minuti, quindi eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 100 µ l/pozzetto FSS che contiene gli anticorpi (Vedi Tabella materiali) e macchia cellule a 4 ° C per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto FSS alle celle, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 min, poi scartare surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l/pozzetto di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 minuti, quindi eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 100-200 µ l/pozzetto di FSS con 500 ng/mL DAPI, quindi analizzare campioni tramite flusso cytometry.</li>
</ol>7. funzionale e Phen Otypic analisi delle cellule di T di auto
<ol><li>Recuperare i file di dati da citometro a flusso e cancello tutte le cellule vive (DAPI-) (Figura 1C).</li>
	<li>Quantificare le cellule del tumore di gating il CD45 popolazione– e cellule di T auto di gating il CD45+, + automobile popolazione (Figura 1C). Nota: Se le cellule tumorali esprimono CD45 (ad es. cellule di linfoma Raji), anti-CD3 macchiatura può essere utilizzata per differenziare le cellule di T dalle cellule del tumore.</li>
	<li>Trama delle cellule del tumore e il numero delle cellule di T di auto attraverso il corso di tempo.</li>
	<li>Identificare l'attivazione delle cellule T di co-espressione di 4-1BB e CD69. Nota: Questi marcatori di superficie possono essere utilizzati per analizzare co-coltura del 6-24 h post di cellula T l'attivazione iniziale.</li>
	<li>Identificare cellule T esaurimento dall'espressione di PD-1, Gal-3 e TIM-3.</li>
	<li>Identificare lo stato delle cellule T memoria dall'espressione di CD45RO e CD62L.</li>
</ol>

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<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
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</ol>

Il costrutto di auto descritto in questo lavoro sono stati concessi da Mustang Bio., Inc., per i quali S.J.F. e c.e.b. ricevere pagamenti di canoni. Tutti gli altri autori non dichiarano nessun potenziali conflitti di interesse.

Questa analisi di sfida delle cellule di tumore ripetitivo fornisce un approccio conveniente per valutare la potenza funzionale delle cellule di T auto, che utilizza un'installazione in vitro che ricapitola l'onere di alto tumore connesso con modelli in vivo del tumore. Durante questo test di 7 giorni, le cellule T auto subiscono quattro giri di sfida del tumore (co-coltura iniziale e rechallenge x 3), creando un ambiente dove esausto T cellule potrebbero perdere la loro capacità di rispondere alla sfida del tumore malgrado una potente risposta iniziale. Eliminare le cellule del tumore e l'espansione di cellule T auto rappresentano due letture fondamentali che possono essere acquisite da questo test, mentre i fenotipi delle cellule di T di auto possono essere facilmente analizzati dalla macchiatura marcatori di superficie o intracellulari che indicano l'attivazione delle cellule T, esaurimento e/o memoria. Questo test è anche conveniente combinare con imparziale analisi del trascrittoma di cellule T auto, proteoma o fosforo-proteoma21,26e polifunzionalità delle cellule T, che è stato adottato per predire le risposte cliniche27. Inoltre, le cellule del tumore possono essere testate anche per loro risposta adattativa contro l'immunità delle cellule T come citochina secrezione28. Dal momento che i campioni sono raccolti a più punti di tempo, questa analisi consente non solo statica, ma anche analisi dinamica del comportamento delle cellule di T auto quando si risponde a un numero in eccesso delle cellule del tumore.
Il dosaggio è particolarmente potente in confronto la potenza dell'effettore delle cellule di T auto targeting per lo stesso antigene, ma con differenti disegni e/o processi di fabbricazione. Abbiamo usato questo test per identificare quel CD4+ auto T cellule erano in grado di mediare funzioni effettrici a lungo termine superiori di CD8+ cellule21. Inoltre è stato indicato che in vivo l'efficacia di auto è stato correlato con la citotossicità in momenti successivi (D5-D7) durante questo test, evidenziando ulteriormente la necessità di utilizzare sfida tumore ripetitivo per valutazione in vitro di cellule T auto. Anche se le cellule GBM sono state utilizzate come nell'esempio delle cellule bersaglio qui, questo test potrebbe essere facilmente adottato ad una combinazione di diverse cellule T-tumore. In particolare, comportamento delle cellule di T auto possa variare anche a seconda densità differenti dell'antigene e cellule tumorali ingegneria per esprimere vari livelli di antigeni designati forniti lo strumento per studiare gli eventi molecolari sequenziali su auto riconoscimento29. Pertanto, questo test può essere sfruttato anche per esaminare il pattern di attivazione di determinate cellule di T auto contro bersagli diversi.
Poiché l'attuabilità delle cellule bersaglio e l'espansione di cellule T auto sono due letture iniziali di questo test, è fondamentale che tutte le co-culture iniziano con vitali (> 70%) tumore e cellule T. Quando si esegue i processi di rechallenge, l'azione di aspirazione media (punto 5.3) non dovrebbe disturbare tumore e le cellule T nel fondo dei pozzetti, in modo da non introdurre inutili variazioni della conta delle cellule. Quando si esegue questo test su linee cellulari di sospensione destinazione, è consigliabile raccogliere le cellule rimanenti mediante centrifugazione prima rechallenge delle cellule del tumore.
Una limitazione di questo test è che i parametri di configurazione (E:T rapporti di co-coltura iniziale e rechallenge) regolare deve essere basata su diverse combinazioni di auto-tumore. Ad esempio, se le cellule tumorali esprimono un notevole livello di molecole immuno-inibitori (es. PD-L1), un più alto rapporto di E:T è raccomandato dato che la totale efficienza di abbattimento è alterata rispetto alle cellule di tumore del PD-L1-basso. Prima di applicare l'analisi di nuove combinazioni di auto-tumore, uno studio pilota è raccomandato per determinare le condizioni ottimali, che solitamente permette che le cellule di T di auto più potente nel test per eliminare > 80% delle cellule del tumore nel punto finale. Poiché contatto diretto cellula-cellula è necessario per l'auto mediata da cellule T uccisione, se le cellule del tumore sono stati etichettati di fluorescenza, quindi il pannello di analisi cytometric di flusso deve essere regolato di conseguenza (per esempio se le cellule del tumore erano GFP-etichettata, quindi ogni anticorpo coniugato FITC anticorpi non dovrebbero essere usati).
L'attività clinica di cellule di T auto contro le malignità delle cellule di B ha portato a due farmaci approvati dalla FDA. Tuttavia, la risposta ha mostrato una variazione sostanziale attraverso diversi pazienti27,30,31, che è stata delucidata per correlare con la proprietà fenotipiche delle auto prodotti30. Questo test di sfida del tumore in vitro ripetitivo ulteriormente fornisce un approccio per funzionalmente testare la potenza del effector di auto oltre alla caratterizzazione fenotipica e la produzione di citochina di polifunzionalità e permette per un throughput più elevato screening di prodotti clinici rispetto ai modelli in vivo del tumore pur mantenendo la fedeltà predittiva. Nel complesso, questa analisi potrebbe essere usata per il test funzionale delle cellule T per la progettazione di auto T cellulare, sviluppo pre-clinico e clinico.

Immunoterapia con recettore chimerico antigene (auto)-cellule T ingegnerizzate ha visto risultati promettenti contro B cellula malignità1,2,3,4, mentre il potenziale di targeting per altri tumori continua ad essere sotto indagine rigorosa5,6,7. Grandi progressi per ottimizzare il costrutto auto, il processo di fabbricazione e il paziente pre-infusione regimi6,7,8, e approcci di biologia sintetica romanzo si pensano che aumentino loro persistenza, sicurezza e tumore specificità9,10. Tuttavia, è stato difficile e laborioso per valutare in modo appropriato il potenziale terapeutico delle cellule di T auto al fine di orientare la scelta migliore per traduzione clinica. Il modello più affermato finora per valutare la funzione delle cellule di T auto è in topi immunodeficienti che sopportano gli xenotrapianti del tumore umano, per cui le cellule T auto sono esaminate per efficacia antitumorale e rispetto alle cellule titolato dosi11,12 , 13 , 14 , 15. questi studi in vivo murini sono laborioso e che richiede tempo, soprattutto quando un numero elevato di parametri di screening. Ulteriori studi in vivo possono essere trattenuti dall'accessibilità di diversi ceppi di topi, tecniche di gestione degli animali e servizi di cura degli animali. Di conseguenza, c'è la necessità di sviluppare le analisi in vitro più conveniente consentendo rapide letture di attività dell'effettore, che rispecchiano anche la funzione antitumorale in vivo di queste cellule di T.
I metodi convenzionali per determinare la citotossicità delle cellule T in vitro si sono concentrati sull'individuazione di degranulazione, produzione di citochine e la capacità di lisare cellule bersaglio con etichetta del radioisotopo (i.e., saggi di rilascio di cromo). Mentre queste analisi sono informative per definire la specificità delle cellule di T auto e riconoscimento di destinazione reindirizzata, riescono spesso a riflettere il potenziale antitumorale in vivo di derivati dal T cellule12,13,16. In alcuni casi, in vitro uccidendo attività nelle analisi a breve termine hanno mostrato una correlazione inversa con funzione antitumorale in vivo16. Tale incoerenza è probabilmente il risultato di rapporti dell'effettore: target alto (E:T) utilizzato in questi saggi in vitro e quindi l'incapacità di differenziare i prodotti delle cellule T auto che sono inclini a esaurimento17. Al contrario, durante l'estirpazione del tumore in vivo T cellule rispondono solitamente contro gli oneri di grande tumore, quindi che richiedono più cicli di abbattimento e successivamente guida cellula T differenziazione ed esaurimento18,19, 20, che è uno dei principali ostacoli contro lo spazio di efficace del tumore da auto T cellule12,13. Nel frattempo, analisi di uccisione in vitro più a breve termine anche fanno non le differenze di lettura nella proliferazione delle cellule T, mentre in auto T cellulare trattati pazienti la capacità di espansione di cellule T auto è fortemente correlata con le risposte cliniche4. Così, l'analisi in vitro appropriato avrebbe bisogno di ricapitolare le condizioni di carico elevato del tumore, induzione di cellule T esaurimento e consente la lettura dell'espansione delle cellule T.
Qui descriviamo una strategia per valutare le cellule di T auto per uccisione potenziale, con un saggio di semplice co-coltura in vitro del tumore ripetitivo. Parametri di attività differenti delle cellule T effettrici possono essere esaminati simultaneamente, tra cui uccisione delle cellule bersaglio, espansione di cellule T auto e fenotipi associati di memoria o esaurimento. I risultati generati da questo test correlano bene con l'effetto antitumorale in vivo delle cellule di T di auto e possono essere sfruttati per valutare la potenza dei prodotti delle cellule di T di auto. Mentre Descriviamo un test per valutare le cellule di T di auto IL13Ra2-mirati contro primario GBM linee21, può essere facilmente adattato a qualsiasi piattaforma di cellula T auto.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina/0,53 mM EDTA in HBSS senza calcio e magnesio</td><td>Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutammina</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilidolo, dicloridrato (DAPI) - Grado FluoroPuro</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologie cellulari innovative</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleuchina Proleuchina (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anti-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anti-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anti-CD4, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 Integratore senza siero (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Micropiastre in polistirene trattato TC a fondo piatto ben trasparente, confezionate singolarmente, con coperchio, sterili (prodotto #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino definito, HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) senza Glutammina</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc senza L-Glu, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 50:50 Miscela con L-glutammina e 15 mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>FCS inattivato a caldo</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodico (1.000 U/mL)</td><td>americano Farmaceutico</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x con CA e MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS con 1 mM EDTA (No Ca2+ o Mg2+)</td><td>VWR Scientific Products</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF umano ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 Diluizione di lavoro (10 ng/&micro; L)</td><td>CellGenix, Operazioni negli Stati Uniti</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TAMPONE TC-HEPES (1 M) SOLN 100ML&nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Maschera procedurale Tecnol</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro del tumore delle cellule rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule t

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Il campo della terapia delle cellule T di chimerico antigene recettore (auto) sta avanzando rapidamente con miglioramenti in CAR design, approcci di ingegneria genetica e le ottimizzazioni di produzione. Una sfida per questi sforzi di sviluppo, tuttavia, è stata l'istituzione di analisi in vitro che può informare robustamente selezione dei prodotti delle cellule T auto ottimali per il successo terapeutico in vivo. Dosaggi standard lisi del tumore in vitro spesso non riescono a riflettere il vero potenziale antitumorale delle cellule di T di auto a causa del tempo relativamente breve co-coltura e alta delle cellule di T al rapporto del tumore. Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro per valutare auto T cellulare ricorsiva uccidendo potenziale alto tumore delle cellule carichi. A questo dosaggio, la funzione citotossica a lungo termine e la capacità proliferativa delle cellule di T auto viene esaminati in vitro oltre i 7 giorni con tumore ulteriori obiettivi amministrati alla co-cultura ogni altro giorno. Questo test può essere abbinato a profilatura l'attivazione delle cellule T, esaurimento e fenotipi di memoria. Usando questa analisi, abbiamo distinto con successo le differenze fenotipiche e funzionali tra CD4+ e CD8+ auto T cells contro il glioblastoma (GBM), riflettendo la loro attività antitumorale in vivo differenziale in orthotopic modelli di xenotrapianto. Questo metodo fornisce un facile approccio per valutare la potenza delle cellule di T di auto e per delucidare le variazioni funzionali attraverso diversi prodotti delle cellule di T auto.

Usando l'analisi sopra descritta, abbiamo distinto la potenza differenziale effettrici e uccidendo dinamica mediata da CD4+ e CD8+ auto T cellule. I risultati presentati qui illustrano la differenza tra CD4+ e CD8+ auto T cellule, generate da un donatore sano indipendente della nostra precedente pubblicazione21.
Attraverso un test di degranulazione standard, siamo stati in grado di osservare che entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule è diventato ugualmente attivati contro le cellule GBM che esprimono l'antigene mirato, come indicato dall'espressione di CD107a e intracellulari di cytokine (Figura 2A). Tuttavia, usando l'analisi di sfida di tumore ripetitivo, abbiamo trovato che CD4+ ma non CD8+ auto T cellule hanno esibito la capacità dell'uccisione multipla-turno (Figura 2B). CD4+ auto T cellule anche raggiunto espansione migliore rispetto alle cellule CD8 + durante questo test (Figura 2C). La differenza di dilatazione tra sottoinsiemi a cellula T di auto sono stati osservati soltanto da D3 dopo due turni di sfida del tumore (1:12 t), mentre la differenza di citotossicità è stata osservata cominciando a D5 dopo tre turni di sfida del tumore (1:20 E:T), che indica che analisi a breve termine non è riuscito a chiarire le differenze nella potenza dei diversi prodotti delle cellule di T auto. Quando il 1:1 misto CD4+ e CD8+ auto T le cellule sono state applicate a questo test, sono stati trovati a sovraperformare CD8+ ma non CD4+ auto T cellule su citotossicità a lungo termine (Figura 2B). L'espansione di CD8+ auto T cellule è stata indotta tramite il co-applicata CD4 cellule+ , mentre CD4+ espansione di cellule T auto è stata inibita in presenza di CD8+ cellule (Figura 2C).
Per spiegare il meccanismo che contraddistingue l'attività dell'effettore tra CD4+ e CD8+ auto T cellule, confermiamo innanzitutto che 24 h dopo la co-cultura, entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule erano attivati in modo paragonabile (Figura 3 A). Nel frattempo, come indicato dall'espressione CD45RO e CD62L, entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule hanno mostrato una transizione dalla memoria centrale (CD45RO+, CD62L+) alla memoria dell'effettore (CD45RO+, CD62L–) fenotipo durante la sfida di tumore ripetitivo (Figura 3B). Poi abbiamo caratterizzato le cellule a D3 di questo test, un tempo prima che i sottoinsiemi a cellula T di auto ha iniziato a visualizzare la differenza funzionale. Esaurimento delle cellule t è stato caratterizzato dal co-espressione di recettori inibitori PD-1, Gal-3 e TIM-315,21, che ha mostrato quella CD8+ auto T cellule erano più inclini ad esaurimento rispetto con CD4+ auto T cellule ( Figura 3 C). Inoltre, si è osservata nessuna differenza il CD8+ esaurimento di cellula T auto in presenza/assenza di co-applicata CD4+ cellule (Figura 3C), che indica quella indotta da CD4 CD8+ espansione di cellule T auto non è associato a una migliore funzione effettrice.
Insieme, i risultati di questa analisi identificato quel CD4+ auto T cellule CD8 ha superato+ cellule specificamente nella citotossicità a lungo termine. Nonostante la citotossicità simile a breve termine (1-3 giorni, una volta rechallenged), CD4+ auto T cellule effettrici sostenuta funzione su sfida ripetitivo del tumore, mentre CD8+ cellule è diventato esaurite e non è riuscite a controllare la crescita delle cellule tumorali. Quando i due sottoinsiemi sono stati mescolati, CD4+ auto T cellule ha facilitato l'espansione di CD8+ auto T cellule, ma lo stato di esaurimento di CD8+ le cellule non sono state migliorate, con conseguente mancanza di effetto sinergico fra i due gruppi. Simile differenza tra CD4+ e CD8+ auto T cellule è stata veduta in un modello in vivo come descritto in precedenza21. Infatti, CD8+ auto T cellule erano in grado di mediare lo spazio ma seguita a breve termine-del tumore con la ricorrenza dell'antigene-positivo; in contrasto, CD4+ trattamento di cellule di T di auto ha provocato a lungo termine del tumore eradicazione21, che è rievocativo del loro potenziale di uccisione ripetitivo usando l'analisi in vitro rechallenge.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figura 1 : Strategia di analisi e schema di dosaggio ripetitivo sfida. Schema (A) e sequenza temporale di analisi di sfida del tumore ripetitivo. Per ciascun pozzetto, cellule di T di auto sono stati co-coltivate con cellule di GBM PBT030-2 (4.000 auto + cellule, 16.000 cellule del tumore) e risfidate con 32.000 cellule tumorali ogni altro giorno (D2, D4 e D6). Analisi della cellula tumorale e numero di cellule T auto, nonché a fenotipo delle cellule di T auto avviene a D1, D3, D5 e D7. (B) Gating strategia per determinare la % di auto in T cellule prima di impostare la co-cultura. (C) strategia di cellule vive, le cellule del tumore e le cellule di T auto del dosaggio ripetitivo sfida di Gating. Numero di cellule di (D) del tumore in momenti diversi del test rechallenge, co-coltivate con le cellule di T untransduced. Barre di errore = valori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figura 2 : Sfida ripetitivo analisi rivela differenze nella potenza di uccisione e proliferativa tra CD4+ e CD8+ auto T cellule. (A) degranulazione e intracellulari di cytokine colorazione dei CD4+ e CD8+ auto T cellule dopo 5 h di co-coltura con cellule di GBM (t = 1:1). (B) CD4+, CD8+ o misto (CD4:CD8 = 1:1) le cellule di T di auto sono state applicate a dosaggio ripetitivo sfida, e cellule tumorali vitali sono state quantificate. p &lt; 0,05, * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001 confrontato con CD4+, usando il One-way ANOVA con più test di confronto di Bonferroni. CD4 (C)+ e CD8+ espansione di cellule T auto durante l'analisi di sfida del tumore ripetitivo. Confronto di (da sinistra a destra) CD4+ vs CD8+, singolo sottoinsieme; CD4+ vs CD8+, all'interno del gruppo "misto"; CD4+, singolo vs miscelati; CD8+, singolo vs miscelati. p &lt; 0,05, * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0,001 utilizzando il test t di Student un spaiati. Barre di errore = valori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figura 3 : Analisi del fenotipo delle cellule di T durante il dosaggio ripetitivo sfida. (A) 4-1BB e CD69 colorazione sulle cellule di T auto a D1 del dosaggio. (B) CD45RO e CD62L macchiatura delle cellule di T auto prima di applicare per risfidare test (ingresso) e a D3 e D7 del dosaggio. (C) co-espressione di PD-1, Gal-3 e TIM-3 sulle cellule di T auto a D3 del dosaggio. (In alto) Gating strategie per identificare le cellule di T che esprimono recettori inibitori 1, 2 o 3. (In basso) Confronto tra: CD4+ cellule (singolo sottoinsieme), CD8+ cellule (singolo sottoinsieme), CD8+ cellule (all'interno del gruppo "misto"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabella 1: Mappa rappresentante piastra di installazione rechallenge.

Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro di cellule di T del tumore targeting sfida in modo ricorsivo, che consente analisi fenotipica e funzionale di attività antitumorale delle cellule T.

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Questo protocollo fornisce un metodo funzionale a lungo termine, in vitro, per la valutazione del recettore dell'antigene chimerico, o cellule CAR T, attraverso la sfida ripetitiva delle cellule tumorali. Questa tecnica richiede meno tempo e meno lavoro rispetto alla valutazione in vivo della funzione cellulare CAR T, pur ottenendo una rappresentazione accurata della vera efficacia antitumonale. Questa tecnica in vitro consente lo screening ad alta produttività e la differenziazione della potenza antitumomica delle cellule CAR T.Che ha la potenziale applicazione per valutare l'efficacia clinica dei prodotti cellulari CAR T. Inizia dissociando le tumorisfere del glioblastoma da una cultura della tumorsfera del glioblastoma. Con un millilitro di accutasi a freddo e da 30 a 60 secondi di pipettazione.Quando le tumorisfere sono state interrotte, interrompere la reazione con cinque millilitri di mezzo caldo di co-coltura. E pellettò le sospensioni delle cellule tumorali per centrifugazione. Sospendere di nuovo le cellule del glioblastoma a 1,6 volte 10 alla quinta colonna tumorale per millilitro di concentrazione media di cocoltura fresca e diluire le cellule T raccolte da una coltura cellulare CAR T alla percentuale appropriata di cellule T positive CAR per millilitro di concentrazione media di co-coltura.Successivamente, aggiungere 100 microlitri delle cellule tumorali diluite a ciascun pozzo di una piastra di coltura del tessuto del tessuto ben piatta. E 100 microlitri di cellule CAR T in ogni pozzo di cellule tumorali con miscelazione delicata. Quindi posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius, 5%.Nei giorni due, quattro e sei di coltura, rimuovere con cura 50 microlitri di mezzo da ogni pozzo della cellula tumorale, la piastra di co-coltura delle cellule T prevista per la ridiscussa secondo la tabella. Quindi, aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare di glioblastoma fresco, preparati come appena dimostrato, ma con il doppio del numero cellulare della cocoltura iniziale ad ogni pozzo con miscelazione delicata. E riportare il piatto nell'incubatrice di coltura cellulare.I giorni uno, tre, cinque e sette di co-coltura, trasferiscono il supernatante da ogni pozzo per essere raccolto in una nuova piastra inferiore ben rotonda 96 secondo la tabella e aggiungono 50 microlitri di EDTA di triptarina pre-riscaldata allo 0,5% in ogni pozzo impoverito medio. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, confermare che le cellule si sono staccate dal fondo di ogni pozzo mediante microscopia leggera e pipettare delicatamente la soluzione enzimatica intorno al fondo di ogni pozzo per rimorsi le cellule. Prima di trasferire la sospensione cellulare staccata nei pozzi corrispondenti appropriati della nuova piastra da 96 pozzi.Pellet le cellule per centrifugazione e lavare le cellule con 200 microlitri di soluzione stagnante di smistamento cellulare attivata fluorescenti, o FFS per pozzo con una seconda centrifugazione. Sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri del cocktail anticorpale di interesse in 100 microlitri di SSS per pozzo per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione rimuovere qualsiasi anticorpo non legato da lavaggi FSS sequenziali da 100 e 200 microlitri e sospendere le cellule in 100-200 microlitri di macchia nucleare DAPI e FSS.Quindi, analizzare le cellule in base ai protocolli di analisi citometrica a flusso standard. Per l'analisi funzionale e fenotipico delle cellule CAR T dopo la co-coltura delle cellule tumorali, recuperare i file di dati dal citometro di flusso e gate tutte le cellule negative DAPI vive. Per quantificare le cellule tumorali, gate la popolazione negativa cd45.Per quantificare le cellule CAR T gate la popolazione positiva di CAR CD45. Quindi tracciare i numeri delle cellule tumorali e CAR T nel corso del tempo dell'esperimento, identificando l'attivazione delle cellule T mediante la co-espressione di 41BB e CD69. Esaurimento delle celle T per l'espressione di PD1, LAG3 e TIM3, stato della memoria della cella T LAG3 e TIM3, stato della memoria della cella T da CD45RO ed espressione ligando CD62.da CD45RO, ed espressione ligando CD62. Sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive si attivano ugualmente contro le cellule del glioblastoma che esprimono l'antigene bersaglio come indicato dalla loro espressione di citochina CD107a e intracellulare. Tuttavia, come valutato da una sfida tumorale ripetitiva SA, CD4 positivo, ma non cd8 positivo, le cellule CAR T sono in grado di uccidere più round.Anche le celle CAR T positive cd4 ottengono un'espansione più robusta. Quando le cellule CAR T positive CD4 e CD8 sono mescolate con un rapporto uno a uno, questa combinazione di cellule esegue cellule CAR T positive CD8, ma non POSITIVE CD4 in termini di citotossicità a lungo termine. Inoltre, l'espansione delle cellule CAR T positive cd8 è indotta dall'aggiunta di cellule T positive CD4.Mentre l'espansione positiva delle cellule CAR T CD4 è inibita in presenza di cellule positive CDa. 24 ore dopo la cocoltura iniziale, sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive sono attivate in modo simile. Durante la sfida del tumore ripetitivo, sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive dimostrano una transizione da un fenotipo di memoria centrale positivo CD45RO, cd62 ligan positivo, a un fenotipo di memoria ligan cd45RO positivo CD45RO.Le cellule CAR T positive CD8 sono anche più soggette all'esaurimento rispetto alle cellule CAR T positive CD4 valutate dalla loro espressione PD1, GAL3 e TIM3 dopo tre giorni di co-coltura. Inoltre, nessuna differenza osservata nell'esaurimento positivo delle cellule CAR T CDa in presenza o assenza di cellule T positive CD4, indicando che l'espansione positiva delle cellule CAR T CD4 indotta da CD4 non è associata a una migliore funzione di effettore. Questo saggio può anche essere accoppiato con lo smistamento delle cellule T formando la co-coltura per eseguire ulteriori analisi su trascrittimi, proteomica e specifici geni di interesse.Questa sfida tumorale ripetitiva potrebbe anche essere utilizzata come piattaforma per indagare gli eventi biologici post car t riconoscimento del tumore delle cellule T.

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In questo video, dimostriamo il test ripetitivo di provocazione tumorale per valutare il potenziale ripetitivo di uccisione tumorale delle cellule CAR T durante elevati carichi di cellule tumorali. Inoltre, le cellule CAR T possono essere analizzate utilizzando la citometria a flusso per determinare le diverse sottopopolazioni di cellule CAR T nel campione.

Saggio ripetitivo di provocazione tumorale: un test di coltura in vitro per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) per il potenziale di uccisione ripetitiva del tumore

Questo video mostra una tecnica per produrre cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ex vivo. Le cellule T umane sono incubate con biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, insieme a un terreno integrato con interleuchina-2 (IL-2), che porta all'attivazione e alla proliferazione delle cellule T. Vengono introdotti vettori lentivirali transgenici, che consentono all'RNA transgenico di integrarsi nel genoma ospite ed esprimere il transgene. Ciò si traduce in...

Una tecnica ex vivo per produrre cellule T del recettore dell'antigene chimerico

Questo video dimostra una tecnica per la generazione ex vivo di cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) antigene specifico del tumore. I vettori retrovirali che trasportano RNA transgenico vengono mescolati con le cellule della milza in un terreno integrato con interleuchina-2 per promuovere la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T. La miscela viene quindi trasferita su una piastra rivestita con frammenti di fibronectina umana ricombinante e centrifugata per facilitare...

Una tecnica ex vivo per generare cellule T del recettore dell'antigene chimerico tumore-specifico

Questo video mostra un test in vitro per convalidare l'attività delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Le cellule di linfoma a cellule B che esprimono l'antigene CD19 e la luciferasi citoplasmatica sono co-coltivate con cellule CAR T specifiche per CD19. Il legame del CAR al CD19 su un tumore induce le cellule CAR T a rilasciare citochine e tossine che causano citotossicità delle cellule tumorali. L'attività delle cellule CAR T viene valutata quantificando la citochina...

Un test in vitro per valutare l'attività antitumorale delle cellule CAR T specifiche del tumore

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Questo protocollo descrive la generazione chirurgica di tumori pancreatici ortotopici e la rapida digestione di tumori pancreatici del murino appena isolati. Dopo la digestione, le popolazioni di cellule immunitarie vitali possono essere utilizzate per ulteriori analisi a valle, tra cui la stimolazione ex vivo delle cellule T per il rilevamento della citochina intracellulare mediante citometria di flusso.

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

Qui, descriviamo un protocollo in cui un modello di xenotrapianto derivato dal paziente di leucemia linfoblastica acuta viene utilizzato come strategia per valutare e monitorare le tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico mirato al CD19.

Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Scopri un metodo di co-cultura in vitro per valutare l'attività antitumorale delle cellule CAR T contro cellule di glioblastoma attraverso sfide tumorali ripetute. Questa tecnica consente screening ad alto rendimento.

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T (Video) | JoVE Journal

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

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