Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondriell funktion är avgörande för cellulär homeostas och syreförbrukning är en avgörande indikator på mitokondriell hälsa. Detta protokoll ger detaljerade instruktioner mot att analysera syreförbrukningshastigheten i C.elegans. Detta protokoll använder sig av levande, mobil C.elegans ger en rättslig mätning av mitokondriell funktion.

Upplysning behovet av att isolera mitokondrierna, ett steg som potentiellt kan påverka det integritet. Till att börja överföra L4-larver av önskad genetisk bakgrund på en nyfröd gräsmatta av Escherichia coli på nematodtillväxtmedia eller NGM-plattor. Använd minst två 100 mm eller tre 60 mm plattor för varje stam.

Inkubera maskarna vid lämplig tillväxttemperatur i tre till fyra dagar, eller tills plattorna är koncentrerade med ett stort antal ägg och gravidmaskar. Tvätta äggen och maskarna från plattorna med hjälp av cirka 6 milliliter M9 buffert per 100 millimeters platta nematoder. Med hjälp av glas betesmark pipetter, överföra ägg och maskar i enskilda 15 milliliter centrifugrör för varje stam.

Snurra avse-rör ner i tre minuter vid 6, 180 g. Efter centrifugeringen aspirerar du ut M9-bufferten som behåller bara djur- och äggpelletsen. Tillsätt tre till fyra milliliter blekmedel lösning till varje rör och intermittent virvel i sex minuter.

Lägg sedan till M9-buffert för att fylla varje rör och snurra vid 6, 180 g i en minut. Aspirera supernatanten och upprepa denna tvätt med M9, tre gånger. Efter tvätten flyttar du äggpelleten till ett färskt 15 milliliterrör innehållande cirka nio milliliter M9-buffert.

Synkronisera de nykläckta maskarna genom att nöta vid 20 grader Celsius i 16 till 48 timmar. Efter att ha snurrat ner dessa rör på 6, 180 g i 1,5 minuter, lägg de synkroniserade L-1 djuren ner på en nyfrögräsmatta av OP50 på individuella NGM-plattor. Håll plattorna på 20 grader Celsius tills djuren når larvstadiet L-4 efter cirka 42 timmar.

Vid denna tid, använd en platina plocka för att flytta L4 larverna till OP50 seedade NGM plattor som innehåller 0,5 milligram per milliliter av FUdR för att förhindra att producera avkomma. Hydrera sensorpatronen genom att tillsätta 200 mikroliter av destillerat vatten till varje brunn på plattan, vilket säkerställer att sensorns sonder är nedsänkta. Förvara plattorna över natten i rumstemperatur.

Stäng av värmeelementet inom gränssnittet för respirometer. Att förvara maskinen inuti en 15 grader Celsius inkubator sänker kärntemperaturen inom maskinen och förhindrar att djuren överhettas under analysen. Efter inkubation över natten, pipettera ut och kassera destillerat vatten som används för att hydratera sensorn sonder, och ersätta den med 200 mikroliter av calibrant lösning i varje brunn.

Späd ut FCCP-stamlösningen till 100 mikromolar FCCP i destillerat vatten. Tillsätt sedan 20 mikroliter av den utspädda lösningen till injektionsport A i sensorkassetten. Tillsätt 22 mikroliter på 400 millimolarnatriumazider till injektionsport B av sensorpatronen.

Sätt på respirometern. På hemskärmen väljer du Startskärmen så visas mallsidorna. På sidan mallar väljer du tomt”eller en tidigare utformad mall.

Sidan grupper kommer att visas. På sidan grupper väljer du brunnar A och H som bakgrundsväldarna, och tilldelar de återstående sex brunnarna i lämpliga grupper enligt experimentplanen. Få åtkomst till protokollsidan genom att klicka på pilen på nedre högra, och se till att knappen equilibrate, basal och injektioner en och två är markerade.

Justera antalet avläsningar av basal OCR samt maximal OCR och icke-mitokondriell OCR. Markera pilen på det nedre högra hörnet. En uppmaning att ladda sensorns patronplatta kommer att visas.

Se till att sensorkassettens plåt är laddad i rätt orientering, följ anvisningarna på skärmen för påminnelseuppmaning. Respirametern kommer nu att jämviktskassetten. Tillsätt 200 mikroliter M9-buffert i var och en av de åtta brunnarna och omgivande reservoarer av cellplattan.

Plocka cirka 100 maskar från varje stam på oseedade NGM plattor, och låt vila i två till tre minuter. Sedan våt slutet av platina plocka med M9 buffert och plocka 20 ålder synkroniserade djur i brunnar B genom G, lämnar bakgrunden brunnar A och H tom. Klicka nu på OK på respirometerprogramvaran för att mata ut plattan som innehåller kalibreringsbuffert.

Ta bort plattan från respirometern som lämnar sensorkassetten inuti instrumentet. Byt ut calibrantplattan mot plattan som innehåller djuren. Ladda plattor och stäng dörren genom att slå fortsätta och låt analysen att köra.

När analysen köra är klar, följ uppmaningarna på skärmen för att ta bort cellplattan och sensorn patron. Sätt in ett flashminne i USB-porten för att spara formatet run data war. Ta bort sensorkassetten och låt djuren lägga sig till botten av brunnarna i cirka två minuter.

Placera cellplattorna under ett stereo dissekerande mikroskop och räkna antalet djur per brunn. Öppna analysprogramvaran, följt av normaliseringsfliken, för att normalisera syreförbrukningshastigheten till djurnummer. Tillämpa lämpliga nivåer för de olika grupperna under fliken ändra”, och exportera filen som en prisma-fil för vidare analys.

Genomsnittet av de första fem mätningarna är den basala OCR. Genomsnittet av de fem mätningarna efter FCCP tillägg är det maximal OCR. Slutligen är medelvärdet av de senaste fem mätningarna efter natriumazidtillsats den icke-mitokondriella respirationshastigheten.

Eftersom kalcium dysregulation kan resultera i ändrade mitokondriell funktion, OCR i både sel-12 mutanter och vilda typ djur mättes för att undersöka effekten av sel-12 mutationer på mitokondriell funktion och hälsa. Vilda typ djur visade konsekvent basala OCR priser under fem picomoles per minut, per mask. Medan alla tre stammar av sel-12 mutanter visade betydligt förhöjda OCR, av cirka sju picomoles per minut, per mask.

Vid tillägg av FCCP, det fanns en ökning av OCR av vilda typ, liksom SEL-12 mutanter, som förväntat. Vilda typ djur visade maximal OCR på cirka sju picomoles per minut, per mask. Medan sel-12 mutanter hade OCR på cirka 10 picomoles per minut, per mask.

Använd levande, väl utfodrat, och asynkroniserade djur i denna analys, och undvika överföring av ägg eller slaktkroppar i assay wells. Vidare bör instrumentets inre temperatur inte överstiga 25 grader Celsius. Bleach, FCCP, FUdR, och natriumazid är giftiga.

Därför bör man se till att bära skyddshandskar under beredning av stamlösningar och läkemedelsbelastning.