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Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal
Chapters
Summary June 1st, 2019
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Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.
Transcript
Meu laboratório está interessado em mecanobiologia, que examina como as células se exercitam e são influenciadas por forças mecânicas. Uma maneira de quantificar a mecanobiologia é medir a contratilidade celular. Nas células aderentes, a contratlidade se manifesta em forças de tração exercidas no substrato celular. Quantificamos essas forças usando uma metodologia geralmente referida como microscopia de força de tração ou TFM. E tfm é implementado em uma ampla variedade de métodos diferentes, mas um aspecto comum é que é uma técnica de laboratório bastante serial e lenta feito tipicamente em um único prato como este aqui. Isso nos restringe a avaliar uma população ou condição de cada vez. Ao longo da cultura celular foi melhorado há algum tempo, mas criar pratos multiwell e pensamos, não seria ótimo que pudéssemos para tfm com o mesmo rendimento aumentado e a mesma eficiência de tempo e reagentes? E essa era nossa solução. Então criamos um prato de força de tração 96 bem. E se parece muito com um prato convencional de cultura de tecido 96, no entanto, com este prato podemos não só examinar 96 condições diferentes de cultura celular, mas também quantificar sua contratilidade celular. Isso apresenta uma solução de throughput muito maior do que abordagens de prato único, permitindo-nos examinar diversas condições celulares e respostas contratuais. Durante a metástase do câncer, as células cancerígenas viajam de seu local principal para locais secundários, espalhando a doença em nosso corpo. Esse comportamento metastático das células cancerosas é responsável por 90% da morte relacionada ao câncer. Um dos mecanismos propostos para que as células cancerígenas epiteliais adquiram um fenótipo mais migratório e invasivo é a transição epitelial-mesenquimal, EMT. Durante o EMT, eles se tornam mais migratórios e invasivos, mudando seu comportamento físico. Para entender melhor essas mudanças no comportamento físico, utilizamos nosso substrato de silício macio para medir mudanças na contratilidade das células da glândula mamária do rato com indução de EMT pela TGF-Neste estudo, investigamos como diferentes concentrações e tempo de incubação do comportamento físico das células TGF-afet. Polidimtilsiloxano é uma borracha muito compatível com o módulo mais baixo de Young de cerca de 0,6 quilopascal. A rigidez deste material também pode ser incapaz de usar diferentes concentrações de agente crosslink, incluindo SYLGARD 184.To medir propriedades mecânicas do PDMS usamos um reômetro. Depois de misturar a parte A e a parte B do PDMS, em uma relação de peso de um para um e adicionar o agente de cura com a porcentagem de peso especificada, carregue o lote preparado na placa de reômetro. Certifique-se de carregar o suficiente da amostra para cobrir completamente a área do eixo. É importante ter certeza de que o fuso toca a amostra completamente sem espaço livre na borda. Qualquer amostra extra deve ser cuidadosamente aparada e limpa da placa. Meça o módulo final de armazenamento e a dependência de tempo da viscoelasticidade de cada amostra fazendo varreduras de tempo e frequência em uma cepa de cisalhamento oscilatória de 0,5%Newsha]Este gráfico é um exemplo de teste seq de tempo, tendo feito para medir o comportamento reológico de polidimtilsiloxano com cepa de cisalhamento oscilatória aplicada de 0,5% e temperatura de 100
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