Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van immunometabolisme over de bijdrage van immuuncellen aan obesitas-geïnduceerde ontsteking in vet en steatohepatitis in leverweefsel. Deze technieken zijn geoptimaliseerd voor de isolatie van vet- en lever immune cellen in een door voeding geïnduceerd model van niet-alcoholische steatohepatitis bereikt door een niet-specifieke pathogene-vrije knaagdierbehuizing. Deze methoden kunnen helpen om ons begrip van de immunologische mechanismen die betrokken zijn bij het behoud van metabole homeostase te verdiepen.

Over het algemeen, individuen nieuw aan deze techniek zal worstelen met het maximaliseren van de opbrengst van functioneel levensvatbare gescheiden cellen en het opzetten van de juiste gating in flow cytometrie. Voor het genereren van een vetweefsel eencellige suspensie, spray de borst van een geëuthanaseerde muis met 70%-ethanol, en zorgvuldig een vijf tot zes centimeter centrale incisie door de integument en buikwand langs de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte en het hart bloot te stellen. Met behulp van een 26-gauge naald, injecteren ten minste 10 milliliter van 0,9%zoutoplossing in de top van de linker ventrikel, en gebruik schaar om de buikholte te openen.

Ontleed vervolgens het epigonade vetweefsel en weeg het. Verwijder het vetweefsel mechanisch in fijne stukjes in een petrischaaltje bij vier graden Celsius voordat u de weefselfragmenten in een conische buis van 50 milliliter overzet. Spoel de petrischaal met een milliliter van 0,5% runder serum albumine, of BSA, in PBS, en voeg drie milliliter vers bereid vetweefsel verteren oplossing per gram vetweefsel aan de buis.

Na 20 minuten bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, voeg vijf milliliter van 0,5%BSA in PBS, en plaats de vetvertering op ijs. Triturate de oplossing meerdere keren met een 10-milliliter serologische pipet, en gebruik een zuiger om de oplossing door een 100-micrometer zeef. Scheid de weefselfracties door centrifugatie en gebruik een pipet om de drijvende adipocytefractie weg te gooien.

Resuspend de stromale vasculaire fractiecelpellet in een milliliter ammoniumchloride-kalium, of ACK, lysebuffer, waardoor de lysereactie na enkele seconden stopt met 10 milliliter van 2%foetaal kalfsserum, of FCS, in PBS. Verzamel vervolgens de geïsoleerde witte bloedcellen door centrifugatie en zet de pellet opnieuw op in 250 microliters van 2%FCS in PBS voor het tellen. Oogst de lever in een conische buis van PBS op ijs voordat u spuitzegels gebruikt om het weefsel mechanisch te scheiden in een petrischaaltje bij vier graden Celsius.

Breng de ontleed leverweefsel fragmenten in een 50-milliliter buis met 10 milliliter van warme lever digest oplossing, en spoel de petrischaal met drie milliliter verse lever verteren oplossing. Na 20 minuten bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, stop de spijsvertering met 20 milliliter HBSS en trituraat de weefseldrijfmest meerdere keren met een 10-milliliter serologische pipet. Gebruik een zuiger om de weefseloplossing door een 100-micrometer zeef te passeren en de levercellen te verzamelen door middel van centrifugatie.

Resuspend de pellet in 20 milliliter verse HBSS, en verwijder de hepatocyte matrix door centrifugatie. Verzamel de supernatant voor centrifugatie, resuspending de pellet in 10 milliliter van 33% lage viscositeit dichtheid gradiënt medium oplossing in HBSS. Scheid de lever immuuncellen door dichtheid gradiënt centrifugatie, en resuspend de leukocyte pellet in een milliliter van ACK lyse buffer.

Na vier minuten bij kamertemperatuur, stop de lysis met 10 milliliter HBSS en filtreer de cellen door een poriezeef van 30 micrometer in een buis van 15 milliliter voor centrifugatie. Vervolgens, resuspend de pellet in 250 microliters van 2% FCS in PBS voor het tellen. Voor flow cytometrische analyse van de geïsoleerde leukocyten populaties, toe te voegen tot drie keer 10 tot de zes cellen in 100 microliters van 2%FCS in PBS van het weefsel van belang in individuele polystyreen fluorescentie geactiveerde cel sorteren, of FACS, buizen.

Voeg 10 microliter anti-CD16/CD32-antilichaam toe aan elke buis om elke niet-specifieke binding gedurende 10 minuten op ijs te blokkeren, gevolgd door vlekken met het juiste volume van het antilichaammengsel en één microliter levensvatbaarheidskleurstof per monster om levende en dode celdiscriminatie mogelijk te maken. Na 20 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht, was de monsters twee keer met twee milliliters van 2%FCS plus PBS per wasbeurt, en centrifuge op 300 keer g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Dan, resuspend de pellet in verse PBS plus FCS.

Als u de cellen wilt analyseren door cytometrie in de stroom, gebruikt u een niet-gekleurd negatief controlemonster om de voorwaartse en zijverstrooiing in te stellen en de spanningen van de stroomcytometer aan te passen om de levensvatbare leukocytenpopulatie te detecteren en het puin uit te sluiten. Voer vervolgens enkel gekleurde controlemonsters uit voor veelkleurige compensatie voordat u de experimentele monsters uitvoert en verzamel ten minste vijf keer tien tot de vier gebeurtenissen per buis. Exporteer vervolgens de FCS-gegevensbestanden voor analyse en stel de gatingstrategie voor CD45-positieve leukocyten in om de identificatie van de daaropvolgende immuuncelpopulaties van belang mogelijk te maken.

Hier wordt een representatieve gating strategie voor T cel subpopulaties met inbegrip van doublet discriminatie en levensvatbaarheid vlekken in murine perigonadal vet getoond. CD45-positieve leukocyten worden eerst gated voor CD4 en CD8 en vervolgens voor CD44 en CD62 ligand om onderscheid te maken tussen naïeve, centrale geheugen, effector geheugen, en effector T cellen. CD44-positieve cellen worden dan verder gekenmerkt met CD127, killer cell lectine-achtige receptor G1, en geprogrammeerd death-1.

Hier wordt de gatingstrategie voor het analyseren van B-cellen, granulocyten, natuurlijke killercellen, macrofagen en dendritische cellen weergegeven. Een hoger percentage van effector geheugen CD4-positieve en CD8-positieve cellen kunnen worden gedetecteerd in vetrijke dieet muizen gehuisvest in niet-SPF voorwaarden, terwijl intrahepatische naïeve CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen blijken aanzienlijk lager te zijn bij deze dieren in vergelijking met SPF vetrijke dieet muizen in week zeven. Ernstige steatose, met inbegrip van een toename van grote lipide druppels resulterend in macrovesiculaire steatose, lobaire ontsteking, hepatocellulaire ballonvaren, en vernietigde lobular structuur wordt gevonden in vetrijke dieet blootgestelde muizen, terwijl slechts sommige SPF muizen vertonen een milde vetophoping in de lever.

Bovendien is het percentage natuurlijke killer cellen hoger in het perigonadale vetweefsel van vetrijke dieet blootgestelde muizen, terwijl vetrijke dieet SPF muizen aangetoond hogere percentages van dendritische cellen. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de cellen op ijs en in het donker te houden, tenzij anders vermeld. Je moet nu een goed begrip van hoe goed voor te bereiden eencellige suspensies en hoe murine vet en hepatisch weefsel te isoleren voor flow cytometrie experimenten.