Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Redning af rekombinant Zikavirus fra en bakteriel kunstig kromosom cDNA-klon
Chapters
Summary June 24th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den nylige epidemi af Zikavirus fremhæver vigtigheden af at etablere omvendte genetiske tilgange til at udvikle vacciner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen til at redde en infektiøs rekombinant Zikavirus fra en fuld længde cDNA-klon samlet i et bakterielt kunstigt kromosom under kontrol af det humane Cytomegalovirus umiddelbare tidlige promotor.
Transcript
Det overordnede mål med denne eksperimentelle procedure er generering af infektiøs rekombinant zikavirus fra en cDNA-klon i fuld længde, samlet i et bakterielt kunstigt kromosom under kontrol af den humane cytomegalovirus umiddelbart tidlige promotor. Udviklingen af omvendt genetisk system for RNA-vira såsom Zika virus tillader direkte manipulation af virus genom til at studere flere aspekter af viral biologi og patogenese og til at udvikle vaccine strategi. Den største fordel ved denne teknik er, at opførelsen af Zika virus infektiøs klon som en bakteriel kunstig kromosom overvinder toksicitet forbundet med flavivirus genom og tillader redning af infektiøs virus ved direkte transfection af BAC cDNA klon i modtagelige celler.
Denne metode kan anvendes til at konstruere stabile og fuldt funktionelle infektiøse cDNA-kloner til andre flavivirus samt andre positivstrengede RNA-vira. For at starte denne procedure, konstruere Zika virus cDNA klon som beskrevet i tekstprotokollen, ved hjælp af passende begrænsning steder. Fire DNA-fragmenter, der spænder over Zika virus genom flankeret af den menneskelige CMV promotor i fem-prime ende og hepatitis delta virus ribosom og kvæg væksthormon opsigelse og polyadenylation sekvenser i de tre-prime ende er samlet i en bakteriel kunstig kromosom plasmid.
Først dyrke en enkelt koloni af E.coli DH10B transporterer pBAC-Zika virus infektiøs klon i fem milliliter LB medium indeholder chloramphenicol i otte timer ved 37 grader Celsius med blid rysten. Derefter tilsættes 500 milliliter af LB-mediet indeholdende chloramphenicol til en to-liters kolbe. Tilsæt en milliliter af den forberedte bakteriekultur til kolben og dyrk cellerne ved 37 grader Celsius i 14 til 16 timer, indtil OD600 er ca. 0,6 til 0,8.
Efter dette, bruge en kommerciel kit specielt udviklet til BAC rensning til at rense BAC infektion cDNA klon ved alkalisk lysis ved at følge producentens anvisninger. En dag før transfektion, plade Vero celler i brøndene af en seks-brønd plade ved en tæthed på 500, 000 celler pr brønd i vækstmedium. For at forberede transfektionsblandingen tilsættes fire mikrogram BAC-cDNA-klon til 250 mikroliter af serum reduceret medium og bland omhyggeligt.
I et separat rør fortyndes 12 mikroliter transfektionsmiddel i 250 mikroliter af serum reduceret medium. Vortex at blande og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter kombineres den fortyndede BAC cDNA med transfektionsagenten.
Bland omhyggeligt og inkubere ved stuetemperatur i 20 til 30 minutter. I denne inkubationsperiode skal du bruge vækstmedium uden antibiotika til at vaske Vero-cellerne og lade cellerne blive i en milliliter frisk medium uden antibiotika. Derefter fordeles de 500 mikroliter af cDNA og transfektion reagens blandingen på Vero celler dropwise.
Rock pladen frem og tilbage for at blande og inkubere cellerne i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i seks timer. Derefter fjernes transfektionsmediet og der tilsættes to milliliter frisk vækstmed antibiotika. Inkuber cellerne i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, og sørg for at kontrollere hver dag for induktion af cytopatisk effekt.
Efter fire til seks dages transfektion, når CPE er omkring 50 til 75%indsamle vævskultur supernatanter i 15-milliliter koniske rør og centrifuge i 10 minutter for at fjerne cellulære snavs. Høst derefter supernatanterne indeholdende rekombinant Zika-virus og kassér cellepillerne. Aliquot supernatant i kryorør og gemme dem på minus 80 grader Celsius.
Til at begynde, vokse Vero celler til 90% sammenløb. Vask cellerne to gange med PBS og inficere dem med den reddede virus med den mange forskellige infektion på 0,1 i vækstmedium, der indeholder 2% FBS. Placer pladerne af celler i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og sten hvert 15.
Efter viral adsorption, fjerne virale inoculum og tilsæt frisk vækstmed 2% FBS. Inkuber tre eller fire dage på de samme betingelser, som tidligere blev anvendt. Når CPE er ca 75% indsamle vævskultur supernatant og centrifuge at fjerne cellulære snavs.
Høst derefter supernatanten indeholdende rekombinant Zika virus og kassér pellet. Aliquot supernatant i kryorør. Placer rørene i en fryseboks og opbevar dem på minus 80 grader Celsius.
Når du er klar, fjerne en virus aliquot fra fryseren og bestemme viral titer ved plaque assay som skitseret i tekstprotokollen. I denne undersøgelse, en stabil, fuld længde cDNA klon af Zika virus stamme Rio Grande do Norte Natal genereres ved sekventielt kloning fire overlappende cDNA fragmenter i bakteriel kunstige kromosom pBeloBAC11 ved hjælp af konventionelle kloning metoder og unikke begrænsning steder til stede i det virale genom. Denne cDNA-klon i fuld længde blev flankeret i den femprimale ende af den humane cytomegaloviruspromotor for at tillade ekspression af viral RNA i kernen af transficerede celler og i den treprimale ende af hepatitis deltavirus ribosomet efterfulgt af kvægvæksthormontering og polyadenylationsekvens for at producere RNA'er, der indeholder den nøjagtige tre-primende ende af det virale genom.
Når BAC cDNA er samlet, kan infektiøs virus nemt genvindes efter direkte transinfektion af modtagelige Vero-celler med BAC cDNA-klonen ved hjælp af kationiske liposomer. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, R Zika virus RGN kan reddes med titere højere end en million plaque-dannende enheder pr milliliter. Desuden fremkalder den reddede virus en klar cytopatisk effekt og genererer homogene plaques på omkring to millimeter i størrelse.
Den reddede virusidentitet bekræftes via immunfluorescensanalyse ved hjælp af et specifikt monoklonalt antistof til Zika virus E-proteinet. Samlet set viser disse resultater, at infektiøs rekombinant zikavirus kan reddes fra cDNA-kloner i fuld længde samlet i en BAC. Sammenfattende har vi udviklet en kraftfuld Zika virus omvendt genetisk tilgang baseret på brugen af en bakteriel kunstig kromosom, der kunne tilpasses til at generere den stabile og funktionelle infektioner med cDNA klon af andre positive-strenge RNA-vira til at lette studiet af patologi, til at udvikle en vaccine, og eller for at lette identifikationen af narkotika med antiviral aktivitet.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
