Name: Injetando ovos de Gryllus bimaculatus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Aprenda a injetar ovos de Gryllus bimaculatus para estudos de interferência de RNA e manipulação genômica. Este método versátil permite pesquisas em biologia do desenvolvimento e neurociência com alta taxa de sobrevivência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A pesquisa relatada neste projeto foi apoiada por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) do Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM10342 a HH3, e pelo número de prêmio NSF IOS-1257217 para CGE.

1. configuração de hardware e preparação de materiais
Nota: Consulte a tabela 1 e a tabela de materiais para preparação de soluções, reagentes e detalhes do equipamento.
<ol><li>Configurar um microscópio de dissecação para ver os ovos e guiar a agulha de injeção. (Figura 1a mostra um microscópio de dissecação equipado com fluorescência.) A capacidade de fluorescência é vantajosa, mas não necessária.</li>
	<li>Posicione um micromanipulador de 3 eixos para manobrar a agulha de injeção no lugar (Figura 1a).</li>
	<li>Configurar um microinjector com tubo e um suporte de agulha para injetar pequenas quantidades de material (Figura 1a). Opcionalmente, use um pedal que não é mostrado na figura.</li>
	<li>Projete e crie um carimbo para criar poços para ovos (Figura 1C) imprimindo o inverso do padrão desejado, seja com uma impressora 3D ou com um gravador a laser. Nota: O carimbo de amostra impresso em 3D mostrado é 4,5 cm x 5 cm com 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm saliências para a criação de poços individuais. Detalhes sobre como fazer uma variedade de moldes personalizáveis foram publicados em outros lugares16.</li>
	<li>Prepare o tampão de injeção 10x, o soro fisiológico tamponado de HEPES (HBS), e uma solução de estoque da tintura do Dextran de Tetramethylrhodamine e armazene em 4 ° c.</li>
	<li>Preparar soluções experimentais a serem injetadas, tais como dsRNA, crispr/Cas912, elementos transposáveis, in vitro tampado mRNA7,8, agentesfarmacológicos17, zfns, ou Talens9.</li>
	<li>Coloc a fita da dobro-vara em diversas camadas de fita padrão do laboratório em uma corrediça de vidro do microscópio a fim criar uma plataforma 1 milímetro ou assim acima da corrediça de vidro, que será usada segurando agulhas para a avaliação.</li>
	<li>Prepare um recipiente do grilo aproximadamente 40 cm x 60 cm no tamanho com uma tampa que possui uma abertura mesh-covered para a circulação de ar.</li>
	<li>Adicione alimentos, água e materiais de abrigando.</li>
	<li>Adicione várias dúzias de grilos adultos masculinos e femininos saudáveis. Identifique o grilo adulto pela presença de asas. Nota: Uma escala de idades do borne-imaginal pode aumentar Rendimentos do ovo. A densidade de grilos deve ser relativamente alta, a fim de ser capaz de coletar ovos suficientes para uma experiência, mas não tão lotado que o canibalismo ocorre. Por exemplo, cerca de duas dúzias de grilos saudáveis, com uma proporção aproximadamente igual de macho para fêmea, em um recipiente do tamanho mencionado acima deve ser suficiente para coletar cerca de 200 ovos em um período de um a dois h. Os grilos podem ser mantidos à temperatura ambiente, mas o desenvolvimento e o comportamento serão ótimos se os grilos forem mantidos em uma incubadora morna (23,5 – 26 ° c), úmida (40-60% de umidade relativa).</li>
</ol>2. fazendo agulhas para injeção
<ol><li>Use capilares de vidro de borosilicate com filamento (veja a tabela de materiais para detalhes do tamanho). Prepare as agulhas de tração no mesmo dia, ou até alguns dias antes de as injeções estarem concluídas.</li>
	<li>Coloc um vidro capilar no extrator, centram o vidro no filamento, e apertam os botões para fixar o vidro no lugar.</li>
	<li>Ajuste a temperatura do extrator perto do Temp da rampa de vidro (-5 ° c a + 10 ° c).</li>
	<li>Use um único-passo, alto-protocolo de calor para puxar um longo cone com uma pequena abertura, mas evitar derreter as extremidades fechadas. Nota: Por exemplo, ao usar o extrator de micropipeta detalhado na tabela de materiais equipados com um filamento de caixa, use os seguintes parâmetros para vidro com uma temperatura de rampa de 478: Heat 478; Puxe 45; Vel. 75; Del 120. As condições ideais para a produção de uma agulha com a forma mostrada na Figura 2b devem ser determinadas empiricamente por cada usuário.</li>
	<li>Pontas da agulha chanfrada na preparação para as injeções.</li>
	<li>Molhe o plano do moedor giratório do chanfrador (Figura 2a) com água pingando. Use a osmose reversa (RO) ou o de (DEPC)-água destilada tratada.</li>
	<li>Coloque a agulha puxada no Biseladora cantos e rode para um ângulo de 20 °.</li>
	<li>Abaixe a agulha até que ele apenas toca o plano de moagem e bisel para 2 a 3 min.</li>
	<li>Avalie o chanfro coloc a agulha chanfrada na fita da dobro-vara que foi aderida a uma corrediça de vidro do microscópio.</li>
	<li>Coloque o slide segurando a agulha no palco de um microscópio composto equipado com uma câmera e software de aquisição de imagem.</li>
	<li>Adquira uma imagem da ponta da agulha usando um objetivo 20x.</li>
	<li>Utilize o software de imagem para medir o diâmetro do lúmen interior da agulha apenas proximal à abertura chanfrada (Figura 2C). O tamanho ideal é de 10 μm + 2 μm.</li>
	<li>Descarte as agulhas com uma abertura inferior a 8 μm e acima de 12 μm.</li>
	<li>Guarde as agulhas em um recipiente com uma tampa para evitar ficar empoeirado. Use uma tira de cera ou material similar para elevar as agulhas da parte inferior do recipiente para evitar quebrar as pontas (Figura 2D).</li>
</ol>3. coleta e preparação de ovos
<ol><li>Maximize o número de ovos colocados privando grilos de qualquer material úmido (frascos de água, pratos de ovos) durante a noite ou por pelo menos 8 – 10 h antes de tentar coletar ovos. Nota: Desde que as fêmeas têm a habilidade de armazenar internamente o esperma, um procedimento cronometrado diferentemente pode ser necessário se a fecundação com cuidado cronometrada é experimentalmente essencial18.</li>
	<li>Faça 40 mL de agarose de 1% em água e despeje em um prato de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Coloc um selo do ovo-poço na superfície do agarose antes que solidifies.</li>
	<li>Retire o carimbo, uma vez que o agarose é solidificado, para revelar os poços (Figura 1C).</li>
	<li>Encha a placa de poço de agarose com HBS contendo 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Coloque a tampa no prato, enrole no parafilm e armazene a 4 ° c. Nota: Os pratos podem ser armazenados por alguns dias a 4 ° c, mas devem ser aquecidos até à temperatura ambiente antes da utilização para evitar a condensação.</li>
	<li>Faça um prato de coleta de ovos para os grilos para colocar o ovo, preenchendo um prato de Petri de 35 mm com areia branca playground (Figura 1b). Nota: A areia especificada na tabela de materiais é do tamanho de grão apropriado. Se os grãos de areia são muito grandes, a areia vai danificar os ovos.</li>
	<li>Cubra o prato de ovo com um quadrado de papel toalha cortada para ser de aproximadamente 18 cm x 18 cm, e coloque na parte superior do prato com areia. Através desta toalha de papel cobrir o prato cheio com água da torneira.</li>
	<li>Incline o prato de Petri e aperte suavemente a parte superior para remover o excesso de água.</li>
	<li>Dobre os cantos do quadrado de papel toalha o prato e coloque o prato de ovo na tampa invertida, que vai ajudar a manter a tampa de toalha de papel no lugar.</li>
	<li>Coloque o prato de ovo no escaninho de críquete e permitir que as fêmeas adultas para ovipositar ovos para um a dois h. Nota: O tempo relativamente curto aqui garante que todos os ovos serão semelhantes no estágio de desenvolvimento no momento da injeção. Se a injeção antes da celularização for importante, as injeções devem ocorrer dentro de 14 h de ovos que colocam19.</li>
	<li>Enquanto isso, permitir que o prato de agarose (a partir do passo 3,6) para aquecer a temperatura ambiente em preparação para a realização de ovos para injeção.</li>
	<li>Retire o prato de coleta de ovos, agora contendo ovos recém-colocados, a partir do escaninho de críquete, e retire a tampa de toalha de papel. Coloque um filtro com um tamanho de poros de 0,5 – 1 mm sobre uma taça de pelo menos 500 mL de capacidade (Figura 1b).</li>
	<li>Enxágüe o conteúdo do prato de ovos (areia e ovos) no filtro a água da torneira suavemente running deixando os grãos de areia cair através da malha do filtro na água na Taça abaixo, mas deixando os ovos de críquete na cesta do filtro.</li>
	<li>Encha um recipiente com água RO e coloque-o numa bandeja. Inverta o filtro sobre o recipiente e bata-o contra o prato para desalojar os ovos na água. Os ovos vão afundar para o fundo do recipiente.</li>
	<li>Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 com uma tesoura para fazer uma abertura de aproximadamente 3 mm de diâmetro. Coloc esta ponta em um pipetador P1000 e use-a para transferir os ovos do recipiente ao prato do molde do ovo do agarose, transferindo tão pouca água como possível.</li>
	<li>Use pinças de plástico para a linha de ovos em poços de agarose preenchido com HBS mais 1% penicilina/estreptomicina. Cada ovo vai afundar para o fundo de um indivíduo bem. Cubra com a tampa do prato de Petri até estar pronto para injetar.</li>
</ol>4. Prepare o Microinjector
<ol><li>Fixe o microinjector a uma fonte de ar comprimido ou de gás (este protocolo foi otimizado usando ar comprimido ou N2). Nota: Se estiver usando um tanque de ar portátil, preencha pelo menos 75 psi. O tanque perderá a pressão do ar durante todo as injeções e pode precisar de ser reenchido; as injeções tornam-se difíceis abaixo de 40psi.</li>
	<li>Ligue o microinjector. Defina o tempo de injeção para 0,17 s e a pressão para 10 – 15 psi. Nota: A pressão exata necessária dependerá da abertura da agulha e deve ser determinada empiricamente para cada rodada de injeção e/ou agulha nova usada.</li>
	<li>Certifique-se de que o botão BALANCE do microinjector está virado para 0 (normalmente totalmente no sentido anti-horário) e que o microinjector está pressurizado e no modo de injecção .</li>
</ol>5. injeções de
<ol><li>Filtre cerca de 500 μL de tampão de injecção 10x utilizando uma seringa de 1 mL e um filtro de seringa de 0,45 μm.</li>
	<li>Misture os reagentes da injeção (os detalhes que se seguem são para a injeção de dsRNA preparado como descrito em12). Nota: Pode ser aconselhável projetar e executar vários controles, especialmente quando se aprende primeiro esta técnica. Poking ovos sem injetar, injetando buffer + corante sozinho, ou injetando buffer + corante + um reagente de controle (como eGFP dsRNA) são todos bons testes de como disruptivas vários elementos do protocolo de injeção pode ser. Veja a Figura 3 para a capacidade de sobrevivência de vários controles diferentes.</li>
	<li>Comece com uma alíquota de 4 mL de dsRNA.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL do tampão de injeção 10x filtrado à alíquota de dsRNA.</li>
	<li>Adicionar 0,5 ml de 50 mg/ml tetramethyl rodamina Dextran Dye Stock Solution. Se trabalhar em um espaço de dissecação sem fluorescência, use o vermelho do phenol preferivelmente.</li>
	<li>Mantenha todos os materiais no gelo durante a duração do período de injeção.</li>
	<li>Coloque a solução de injeção em uma agulha de injeção usando pontas de carga de 20 mL e um Pipet P10.</li>
	<li>Elaborar uma solução injetável de 1,5 mL e inserir a ponta de carga na extremidade larga da agulha de injecção.</li>
	<li>Ejecte a solução tão distante para baixo na agulha como possível e elimine bolhas de ar sacudendo delicadamente; tenha cuidado para não quebrar a agulha.</li>
	<li>Coloque o prato de ovos o microscópio de dissecação e selecione uma baixa ampliação de cerca de 10x (1x ampliação visto através de 10x olho objetivos).</li>
	<li>Insira a agulha na carcaça de injecção e aperte. Nota: Tenha cuidado para que a agulha esteja correctamente e firmemente inserida na carcaça. Para fazer isso, puxe a extremidade larga da agulha para fora da carcaça metálica, trazendo a tubulação de silício na carcaça com ele. Ajuste a tubagem de silicone de modo a que a extremidade de vidro da agulha se saliente apenas para além do silício. Se isso não for feito, o tubo de silício pode ser beliscado entre o vidro ea carcaça de metal, bloqueando a extremidade da agulha.</li>
	<li>Insira cuidadosamente a carcaça de injeção com uma agulha acoplada no micromanipulador. Esteja ciente da extremidade afiada da agulha e tenha cuidado que não é colidido em superfícies e quebrado.</li>
	<li>Ao olhar ambos os ovos e a agulha através do microscópio, mova a agulha perto dos ovos no canto esquerdo superior da grade do prato.</li>
	<li>Abaixe a agulha até a ponta entrar no HBS mais 1% de solução tamponada de penicilina/estreptomicina no prato.</li>
	<li>Centrar a agulha no campo de visão e mover o prato de ovo para que a agulha é de alguns mm mais perto da borda do prato do que os ovos.</li>
	<li>Não obstrua a vista da grelha dos ovos com a agulha.</li>
	<li>Ajuste o microscópio ao filtro apropriado para o RHODAMINE assim que é possível observar a fluorescência na agulha e centrar-se sobre a ponta da agulha.</li>
	<li>No microinjetor, gire lentamente o botão BALANCE no sentido horário até que a solução de injeção comece a vazar da agulha para a solução de suspensão. O número de saldo na tela do microinjector começará a aumentar, embora o valor numérico não seja importante. Em seguida, gire o botão para trás no sentido anti-horário ligeiramente apenas até que o corante pare de vazar da agulha. Nota: É crítico ajustar este contrapeso cada vez que uma agulha nova é usada. Sem o equilíbrio ajustado apropriadamente, o microinjector continuará a injetar por algum tempo depois que a injeção é disparada. É mesmo possível que um único impulso do botão de injeção com uma agulha desequilibrada resultará na expulsão de todo o conteúdo da agulha carregada.</li>
	<li>Com a agulha centrada no campo de visão, mova o prato de ovo para que a agulha é destinada ao ovo a ser injetado primeiro. Recomenda-se que as injeções comecem em um canto da grade de ovos arranjados, por exemplo, o canto esquerdo superior.</li>
	<li>Ajuste a ampliação para cerca de 50x; nesta ampliação, um único ovo preencherá a maior parte do campo de visão.</li>
	<li>Use tanto o micromanipulador e uma mão sobre o prato de ovo para mover a agulha em posição para a injeção.</li>
	<li>Avance a agulha utilizando o micromanipulador e insira a ponta da agulha no primeiro ovo a ser injetado.</li>
	<li>Insira a agulha a 20 – 30% de comprimento do ovo da extremidade posterior (blunter) do ovo (Figura 1e), perpendicular ao eixo longo do ovo.</li>
	<li>Injete a solução com o pedal de injecção ou com o botão de injecção no microinjector. Um bolus pequeno do material fluorescente dentro do ovo indicará uma injeção bem sucedida (Figura 1D). Nota: Não é incomum que algumas gemas sejam ejetadas do ovo durante a injeção (Figura 1F), e isso não indica necessariamente que o óvulo injetado será inviável.</li>
	<li>Retraia a agulha do ovo. Se o ovo é levantado involuntariamente fora de seu poço em cima da retração da agulha, use o fórceps pequeno para empurrar o ovo de volta em seu poço ao retrting a agulha.</li>
	<li>Se a agulha obstruir durante a injeção, retire a agulha do ovo e, mantendo a agulha submersa no HBS mais 1% solução de penicilina/estreptomicina cobrindo os ovos, limpe a agulha entupida usando a função Clear ou empurrando a injeção Botão.</li>
	<li>Continuando a usar a mesma agulha, repita o procedimento de injeção para o maior número possível de ovos. No início, este pode ser apenas cerca de 20 ou 30 ovos, mas vai aumentar para mais de 100 com a prática.</li>
	<li>Se a agulha ficar entupida e não puder ser apagada, descarte a agulha, encha uma nova agulha e comece novamente (ou seja, retorne à etapa 5,7).</li>
	<li>Guarde o prato de ovos injetados em uma incubadora quente (23,5 – 26 ° c) que é levemente úmido (para minimizar a evaporação) até que os embriões tenham atingido o estágio desejado de desenvolvimento para a análise.</li>
	<li>Pelo menos a cada 24 h, remover os ovos que não são mais viáveis (Figura 3a, B), e substituir a solução de suspensão com HBS fresco mais 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Dois a três dias após a injeção, transfira os ovos pela pipetagem delicada ou com o fórceps plástico às toalhas de papel umedecidas com HBS mais 1% penicilina/Streptomycin em um prato de Petri lidded para continuar o desenvolvimento na incubadora morna, úmida.</li>
	<li>Monitore os ovos e remova os ovos que não são mais viáveis a cada dia (Figura 3a, B).</li>
</ol>

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os dois desafios principais com esta técnica são as edições relacionadas do tamanho e do survivability óptimos da agulha. Embora as agulhas menores melhorem o survivability, as agulhas com lúmens mais estreitos têm um maior grau de forças capilares no trabalho, que o faz mais provável que o gema se mova na agulha que causa o entupir. Na melhor das casos, os bloqueios podem ser limpos simplesmente injetando outro ovo ou limpando a agulha como descrito acima. Um pode igualmente tentar aumentar a pressão do contrapeso no mi...

A capacidade de modificar o genoma ou influenciar a expressão gênica em organismos é a base para o projeto de muitos tipos de experimentos que testam a causalidade funcional. Também é fundamental para o trabalho comparativo e evolutivamente relevante que técnicas de modificação genômica e não-genômica estejam disponíveis em organismos fora dos sistemas de modelo animal de laboratório genético tradicional (por exemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans). Se é o desejo de compreender a diversidade organizosa1 ou a adesão ao princípio de Krogh, que para cada questão biológica há um organismo mais adequado à sua solução2,3, acapacidade de modificar genomas ou influência da expressão gênica é essencial para projetos experimentais modernos.
O grilo Gryllus bimaculatus é um sistema emergente de modelo. Usado para o século passado em experimentos de Neurologia4, as duas últimas décadas testemunharam um aumento do interesse experimental no críquete, particularmente focado na evolução e desenvolvimento deste organismo5. O grilo é um inseto hemimetábolos que ramifica basalmente aos insetos holometábolos well-estudados, tais como D. melanogaster e castaneum do Tribolium6. Devido à sua posição útil na árvore evolutiva, os cientistas estão interessados em fazer perguntas experimentais modernas e sofisticadas neste inseto, o que levou a um crescente interesse em adaptar ferramentas moleculares para o uso em G. bimaculatus.
Injeções de reagentes moleculares em ovos de críquete podem ser usadas para experimentos de modificação genômica, bem como manipulações não-genômica da expressão gênica em embriões. Por exemplo, G. bimaculatus transgênica carregando inserções de EGFP foram criadas usando a peptídeo piggybac7,8. Os investigadores criaram com sucesso o Knockout G. bimaculatus usando nucleases do zinco-dedo (ZFNs) e a transcrição ativador-como (tal) nucleases efetoras (Talens) para introduzir rupturas dobro-encalhados em regiões genomic específicas9. Embora ZFNs e TALENs permitam segmentação local específica em animais além dos quatro grandes sistemas de modelos, esses reagentes foram rapidamente ultrapassados pelo sistema CRISPR/Cas9, que é mais simples de usar, mais eficiente e altamente flexível10. Crispr tem sido usado em G. bimaculatus para produzir knock-out11 , bem como Knock-in linhas12,13 além de modificação genômica, dsRNA pode ser injetado em ovos para derrubar a expressão de mRNA no desenvolvimento embriões, permitindo que os investigadores compreendam o papel das transcrições específicas ao longo do desenvolvimento14,15. Alguns detalhes limitados sobre como injetar ovos de críquete foram publicados anteriormente12.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para injetar ovos adiantados do G. bimaculatus . Este protocolo é eficaz e facilmente adaptável a vários ajustes do laboratório, materiais da injeção, e possivelmente a outros insetos. Embora detalhes adicionais para projetar e implementar experimentos de modificação e knockdown genômica tenham sido publicados em outro lugar12,13, essasabordagens, emúltima análise, dependem do protocolo de injeção detalhado aqui.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de dissecação fluorescente</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Estereomicroscópio com fluorescência</td></tr><tr><td>Fonte de luz externa para fluorescência</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM-300-Os</td> <td>acessórios podem incluir suporte de agulhas de injeção, mangueira de entrada (com um conector de mangueira), cabo de alimentação CA, pedal, junta de borracha de silicone -</td></tr> <tr><td>cubo</td> <td>de filtro mCherryO</td> cubo de filtro Leica <td>M205FA / M165FC</td><td>para mCherry ou corante vermelho semelhante funcionará</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>Usado com Suporte Magnético (Narishige, Tipo GJ-8)</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Pipeta (Porta-agulha)</td><td>Tubulação Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>para conectar a fonte de ar ao microinjetor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carimbo de poço de ovo</td><td>impresso em 3D</td><td>personalizado</td><td>impresso em 3D em um Lulzbot Taz 5 usando termoplástico</td></tr> <tr>de ácido polilático<td>Microondas</td><td>várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadoras ou salas com temperatura controlada</td><td>várias</td><td></td><td>temperaturas de 23,5-26 &deg; C são necessários.</td></tr><tr><td>Comida de críquete</td>, <td>vários</td><td></td><td>alimentos para gatos ou flocos de peixe são alimentos apropriados.&nbsp;</td></tr><tr><td>Água de grilo</td><td>vairous</td><td></td><td>A água pode ser mantida em frascos e apresentada aos grilos através de bolas de algodão</td></tr><tr><td>Abrigo de críquete</td><td>arious</td><td></td><td>Os materiais de abrigo podem incluir toalhas de papel amassadas ou caixas de ovos</td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidro</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Item nº 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; Capilares de vidro borossilicato, 100 mm de comprimento, 0,58 mm de diâmetro interno, 1,0 mm de diâmetro externo, com filamento</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Flaming/Brown</td><td>Modelo P-97</td><td>Distribuído pela Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Beveller/Micro moedor</td><td>Narishige</td><td>Modelo EG-45/EG-400</td><td>EG-400 inclui uma cabeça de microscópio</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>CellTreat</td><td>Código do produto 229693</td><td>90 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Areia branca Agarose</td></tr><tr><td></td> American <td>Bioanalytical</td><td>AB000972</td><td>Agarose GPG/LE ultrapure</td></tr><tr><td>Filtro de ovos: Malha de sarja extra fina Filtros cônicos de aço inoxidável</td> Modelo <td>de suprimentos de cozinha dos EUA</td><td>SS-C123</td><td>O tamanho dos poros deve estar entre 0,5 - 1,0 mm</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td>Caneta Strep</td></tr><tr><td>Pinças de plástico</td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Preto Dissipativo Estático, 118 mm</td></tr><tr><td>Filtros de seringa, 25 mm de diâmetro, 0,45 &micro; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>Use com seringa de 1 mL</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL, com Ponta Deslizante de Tuberculina</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Use com filtro de seringa para filtrar Tampão de Injeção, seringas de ponta Luer-Lok também funcionariam</td></tr><tr><td>Tanque de ar (opcional)</td> <td>Midwest Products</td><td>Air Works&reg;</td><td>Tanque de ar portátil</td></tr><tr><td>Corante de rodamina</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>dextrano, tetrametilrodamina 10.000MW,</td></tr> <tr><td>pontas de carregamento de 20 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Nº de pedido 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu; L Microloader</td></tr><tr><td>Microscópio composto</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20x objetiva</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; software</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>Versão 4.6.2 usado aqui</td></tr></tbody></table>

injetando ovos de gryllus bimaculatus

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Alterando a função gênica em um organismo em desenvolvimento é central para diferentes tipos de experimentos. Embora as ferramentas genéticas tremendamente poderosas tenham sido desenvolvidas em sistemas modelo tradicionais, é difícil manipular genes ou RNA mensageiro (mRNA) na maioria dos outros organismos. Ao mesmo tempo, abordagens evolutivas e comparativas dependem de uma exploração da função gênica em muitas espécies diferentes, necessitando do desenvolvimento e adaptação de técnicas para manipular a expressão fora do momento geneticamente tratável Espécie. Este protocolo descreve um método para injetar reagentes em ovos do grilo para ensaiar os efeitos de uma manipulação dada no desenvolvimento embrionário ou larval. Instruções sobre como coletar e injetar ovos com agulhas chanfradas são descritas. Esta técnica relativamente simples é flexível e potencialmente adaptável a outros insetos. Pode-se reunir e injetar dezenas de ovos em um único experimento, e as taxas de sobrevivência para injeções de buffer-only melhorar com a prática e pode ser tão alto quanto 80%. Esta técnica apoiará vários tipos de abordagens experimentais, incluindo a injecção de agentes farmacológicos, o mRNA tampado in vitro para expressar genes de interesse, RNA duplo-encalhado (dsRNA) para alcançar a interferência do RNA, o uso de aglomerados regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR) em concerto com reagentes de proteína 9 (Cas9) associados à CRISPR para modificação genômica e elementos transponíveis para gerar linhas transgênicas transitórias ou estáveis.

Os grilos prontamente colocam ovos no material úmido, e fornecendo material adequado, como areia úmida ou sujeira, induz-os a colocar um grande número de ovos. Isto é especialmente eficaz se os grilos são primeiro privados de material de postura de ovos para 8 – 10 h. os ovos colocados em areia limpa podem ser facilmente separados, recolhidos (Figura 1b) e colocados em poços de ovos concebidos medida para injeção (Figura 1C). Um ...

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Esta técnica serve como um método fundamental para experimentos projetados para avaliar o desenvolvimento embrionário ou larval do críquete. A principal vantagem dessa técnica é que ela é flexível e suportará vários tipos de abordagens experimentais, como aquelas que utilizam interferência de RNA ou manipulação genômica. Demonstrando o procedimento estará Hadley Wilson Horch, o principal investigador do laboratório.Para começar este procedimento molhe o plano de moedor giratório do beveler com água pingando. Coloque a agulha puxada no beveler e gire-a para um ângulo de 20 graus. Abaixe a agulha até que ela toque apenas a placa de moagem e coloque-a por dois a três minutos.Avalie o bisel colocando a agulha chanfrada na fita de vara dupla que foi aderida a um slide de microscópio de vidro. Coloque o slide no palco de um microscópio composto equipado com um software de aquisição de câmera e imagem. Adquira uma imagem da agulha usando um objetivo de 20x.Use o software de imagem para medir o diâmetro do lúmen interior da agulha apenas proximal à abertura chanfrada. Descarte quaisquer agulhas com uma abertura menor que oito micrômetros ou maior que 12 micrômetros. Primeiro, faça 40 milil

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Ovos de Schistosoma mansoni são potentes estimuladores do tipo T helper 2 (Th2) resposta imunológica, característica da infecção por parasita, asma e inflamação alérgica. Este protocolo utiliza S. mansoni injecção de ovo para gerar CD4 de resposta de citocinas induzida por Th2 inflamatória no pulmão, caracterizada por formação de granuloma pulmonar em torno do ovo, eosinofilia e macrófagos activação alternativa.

Usando Ovos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como um<em&gt; Em vivo</em&gt; Modelo de Helmintos induzida por inflamação pulmonar

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo...

Criação e injeção de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; As larvas para avaliar a virulência bacteriana

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Trata-se de protocolos de coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de cigarrinhas de milho com a finalidade de modificar seu genoma via edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 ou para a adição de elementos transponíveis marcados por meio de transformação germinativa.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

Este artigo descreve métodos básicos para padronizar fatores importantes como densidade, disponibilidade de ração, fonte de hidratação e controles ambientais para a criação a longo prazo de culturas laboratoriais do grilo comestível, Gryllus bimaculatus.

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

O presente protocolo descreve um método de injeção de embriões de carrapatos. A injeção embrionária é a técnica preferida para manipulação genética para gerar linhas transgênicas.

Técnica de injeção de embriões para edição de genes no carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis

Aprenda a injetar ovos de Gryllus bimaculatus para estudos de interferência de RNA e manipulação genômica. Este método versátil permite pesquisas em biologia do desenvolvimento e neurociência com alta taxa de sobrevivência.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Explorar mais vídeos