Name: 콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장 라미나 프로프리아에서 단핵 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 장면역 세포 면역표현형 분석 및 염증성 장질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 #1K08HL088260 및 #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) 및 소아 연구를위한 배치 재단 (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.)에 의해 지원되었습니다. 이 연구에서 사용된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 우리 시설에서 사육되었거나 잭슨 연구소 또는 타코닉에서 제공했습니다.

모든 연구는 미국 협회가 정한 수의학적 기준을 충족하는 마이애미 밀러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인된 설치류 연구 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물 과학 (AALAS)에 대 한.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
표 1에 기재된 바와 같이, 결장 완충제, 실리카 계 밀도 분리 매체 100%, 실리카 계 밀도 분리 매체 66%, 실리카 계 밀도 분리 매체 44%, 콜라제나제 E 소화 완충제 및 FACS 버퍼를 준비한다.
	<ol>
<li>수술 전날 결장 완충을 준비하고 4 °C에서 하룻밤 보관하십시오.</li>
		<li>시술 전날 100% 실리카 계 밀도 분리 매체를 준비하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하고, 해동시 오전에 실온에 두었다.</li>
		<li>실온 100% 실리카 계 밀도 분리 매및 결장 완충액을 사용하여 격리의 아침에 66% 및 44% 실리카 기반 분리 매체를 준비합니다.</li>
		<li>적당량의 클로스트리디움-유래콜라게나아제 E를 측정하고 시술 전에 -20°C에서 하룻밤 동안 보관하였다. 다음 날 아침, 콜라게나아제 소화 완충액을 유도하기 위해 결장 완충액을 적정량에 녹입니다. 콜라게나아제 소화 완충액이 있는 모든 배양물의 경우, 용액을 37°C로 미리 데우다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로토콜 단계 전체에 대해 1개의 원심분리기를 20°C에서 유지하고 회전 속도를 859 x g로유지하며, 그라데이션 원심분리를 위해 브레이크가 비활성화(0 감속)됩니다. 세척 단계에 대한 표준 감속과 함께 4 °C 및 회전 속도를 859 x g로설정합니다.</li>
</ol>2. 결장 수확
<ol><li>CO2 질식을 통해 마우스를 안락사시키고 AALAC 승인 확인 방법.</li>
	<li>마우스를 스파인 위치에 놓고 70% 에탄올로 모피에 스프레이합니다. 큰 조직 가위를 사용하여 수직 중간선을 절개하고 손상되지 않은 각막에 노출하십시오.</li>
	<li>미세 해부 가위를 사용하여, 각막을 엽니 다. 집게를 사용하여 작은 창자를 한쪽으로 이동하고 내림차순 결장에 노출시면 됩니다. 결장의 직장 부분을 최대한 노출하기 위해 내림차순 결장에서 약간 위로 당깁니다. 골반 깊은 원위 직장을 잘라 해부하고 말단 직장에서 cecal 캡에 하나의 단위로 전체 결장제거.</li>
	<li>50 mL 폴리프로필렌 튜브에 20 mL 냉각 결장 완충제에 결장 옮기십시오.</li>
</ol>3. 결장 청소
<ol><li>축축한 종이 타월에 결장과 가위 또는 집게의 무딘 끝으로 창자 벽에 가벼운 압력을 가하여 단단한 대변을 추출하십시오.</li>
	<li>페트리 접시에 결장과 18G 무딘 채우기 바늘10 mL 주사기를 사용하여 차가운 결장 완충액 10 mL로 용기를 씻어.</li>
	<li>결장콜을 축축한 종이 타월로 옮기고 가위의 날카로운 끝으로 장간막과 지방을 제거합니다.</li>
	<li>5-10 mL 냉장 콜론 버퍼 교반으로 채워진 페트리 접시에 결장을 놓고 남은 결장 내용물세척합니다. 2-3회 반복합니다.</li>
	<li>신선한 차가운 결장 버퍼로 채워진 페트리 접시에 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장 (단일 직사각형 오픈 콜론 조각을 생성)에 세로로 잘라. 기존 용지를 버리고 깨끗한 차가운 콜론 버퍼로 리필하십시오.</li>
	<li>페트리 접시에 격렬하게 소용돌이치며 5-10 mL의 차가운 결장 완충제를 각 세척 후 교체하여 소장을 3회 세척합니다.</li>
	<li>직사각형 결장 조직을 콜론 버퍼로 적신 종이 타월에 놓고 수평으로 자른 다음 작은 조각 (3mm x 3mm 섹션)으로 자릅니다.</li>
	<li>50 mL 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 20 mL 냉장 콜론 버퍼에 미세 한 포셉을 사용 하 여 신중 하 게 콜 론 조각을 수집합니다.
</li>
	<li>결장 단편을 3회 세척하고, 각각 20 mL 결장 완충제에서 세척하고, 튜브를 30s. 각 교반 사이에 격렬하게 소용돌이치면서, 조직 단편이 튜브의 바닥에 정착하도록 한다. 다이너티트 또는 진공은 상월제를 흡인하면서 각 세척 사이의 흡인 과정에서 조직 단편 손실을 방지한다. 참고: 각 세척 후 튜브를 변경할 필요가 없습니다.</li>
</ol>4. 콜라게나아제 소화 1
<ol><li>콜라게나아제 소화 완충제 20 mL를 50 mL 폴리프로필렌 원엽 튜브의 세척된 결장 단편에 첨가합니다.</li>
	<li>폐쇄 된 50 mL 튜브를 37 °C에 인큐베이션 궤도 셰이커에 놓고 60 분 동안 2 x g로 설정된 회전 속도를 유지합니다. 필요한 경우 회전 속도를 점진적으로 증가시키면 조직 조각이 튜브 바닥에 정착하지 않도록 합니다.</li>
</ol>5. 실리카 기반 분리 매체 그라데이션 준비
<ol><li>20°C(실온) 및 결장 완충액에서 100% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 사용하여 66% 및 44% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 준비합니다.</li>
	<li>실리카 기반 밀도 분리 매체 를 66% 5mL를 3개의 분리된 15mL 폴리프로필렌 튜브각각에 붓습니다. 결장 당 3 개의 튜브를 준비하십시오. 이는 그라데이션 절연 절차의 더 높은 밀도 기반을 형성하며, 그 위에 는 더 낮은 밀도 분리 매체가 겹쳐져 분리 그라데이션을 작성합니다.</li>
	<li>사용할 때까지 20°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>6. 소화 1에서 상급의 컬렉션
<ol><li>25 mL 의 혈청학적 피펫을 사용하여 상량체만 을 수집하고 40 μm 기공 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 상급체를 걸러내고 깨끗한 50 mL 폴리프로필렌 원유관에 넣은 후 콜라게나아제 소화 1이 완료된다. 기존 조직 조각을 흡인하지 않도록주의하십시오. 참고: 튜브에 남아있는 눈에 보이는 조직 조각을 유지합니다. 이들은 두 번째 콜라게나아제 소화를 겪게 됩니다 (단계 8).</li>
</ol>7. 담금질 콜라게나아제 소화 완충제
<ol><li>차가운 결장 완충제으로 50 mL 폴리 프로필렌 튜브를 완전히 채웁니다. 참고: 콜라게나제는 37°C에서 활성; 따라서 차가운 버퍼는이 효소를 비활성화합니다.</li>
	<li>튜브를 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.<ol>
<li>진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오. 신선한 결장 완충액 25 mL로 세포를 씻고 원심 분리기를 800 x g에서 5 분 동안 씻으하십시오.</li>
		<li>신선한 차가운 콜론 버퍼의 1 mL 미만에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>50 mL 폴리 프로필렌 원점 튜브를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 콜라게나아제 소화 2
<ol><li>4단계(소화 1)를 반복하고 나머지 조직 단편을 6.1단계에서 유지하였다.</li>
</ol>9. 소화 후 조직 분리 2
<ol><li>18 G 무딘 끝 바늘을 통해 관과 10 mL 주사기 사이 조직 단편을 격렬하게 앞뒤로 플러시합니다.</li>
	<li>총 조직 파편이나 파편이 보이지 않는 때까지 계속, 최소 7-8 완전한 통로에 대한이 플러시를 반복합니다.</li>
</ol>10. 필터 셀
<ol><li>조직 분리 현탁액을 40 μm-기공 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 깨끗한 50 mL 폴리프로필렌 튜브로 전달한다.</li>
	<li>여과 직물 세포 스트레이너를 10 mL 냉각 된 콜론 버퍼로 씻어 필터에 감아진 모든 세포를 복구하십시오.</li>
</ol>11. 담금질 콜라게나아제 소화
<ol><li>50 mL 폴리 프로필렌 원추형 튜브를 차가운 결장 완충제으로 림에 채웁니다. 참고: 콜론 버퍼의 온도는 콜라게나제 활성의 담금질을 보장하는 데 중요합니다.</li>
	<li>4 °C에서 800 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.</li>
	<li>진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>신선한 차가운 결장완충액 25 mL로 다시 일시 중단한 다음 4 °C에서 원심분리, 800 x g를 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>콜라게나아제 소화 1(단계 7)에서 11.4단계에서 해당 튜브로 재부유된 펠릿을 풀링합니다.</li>
	<li>11.4 단계 (세척 및 원심 분리)를 반복합니다.</li>
</ol>12. 실리카 기반 밀도 분리 매체 그라데이션 분리
참고: 콜라게나제 활성의 신속한 담금질을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 12-18단계를 수행하십시오.
<ol><li>11.7단계에 이어, 콜론당 44% 실리카 계 밀도 분리 매의 총 24 mL에서 각 펠릿을 재중단시켰다.</li>
	<li>10 mL의 혈청학적 파이펫을 사용하여 5.2단계(66% 실리카 계 밀도 분리 매체 포함)에서 제조된 3개의 튜브 각각에 12.1단계로부터 의 8 mL의 매체를 천천히 층화한다. 인터페이스의 중단을 방지하기 위해 그라데이션을 계층화하는 동안 44% 밀도 분리 매체의 일정하고 느린 흐름을 유지합니다.</li>
	<li>계량 스케일 또는 저울을 사용하여 원심 분리기 버킷 내의 모든 튜브의 균형을 신중하게 조정합니다.</li>
	<li>20 °C에서 브레이크없이 원심 분리기에서 859 x g에서 튜브를 20 분 회전시면됩니다. 로터가 튜브를 제거하기 전에 휴식을 취하도록 허용하고 그라데이션 인터페이스에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.</li>
</ol>13. 그라데이션 인터페이스에서 단핵 셀 수집
<ol><li>그라데이션 인터페이스(5mL 마크 근처)를 시각화하여 일반적으로 1-2mm 두께의 흰색 밴드(MNC 포함)가 있는 경우. 참고: 백색 밴드가 보일 수도 있습니다. 그러나 MNC는 이 인터페이스에 있으며 그라데이션 인터페이스의 선명도를 흐리게 해야 합니다.</li>
	<li>진공 흡입 및 인터페이스에 대한 더 쉬운 파이펫 액세스를 허용하기 위해 상단 그라데이션의 상위 7 mL을 폐기합니다.</li>
	<li>연속 수동 흡입과 꾸준한 회전 손목 동작을 사용하여 셀의 인터페이스 층을 깨끗한 50mL 폴리 프로필렌 원점 튜브로 수집합니다. 2 그라데이션 사이의 인터페이스가 명확하고 refractile (셀의 지우기) 때까지 수집합니다.</li>
	<li>차가운 FACS 버퍼 50 mL로 수집 튜브를 채웁니다. 4 °C, 800 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.</li>
	<li>진공 흡인을 통해 상구체를 흡인하고 FACS 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>적절한 죽은 세포 배제 방법을 사용하여 1:2 희석에서 혈세포계의 세포를 계산합니다.</li>
	<li>FACS 염색 또는 갓 분리된 결장 MNC로 다른 분석으로 진행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+physiology+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li>
<li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+inflammation%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li>
<li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+intestinal+tract%3A+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li>
<li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReibig%2C+S+%22T-Helper+Cells%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology%3A+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li>
<li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li>
<li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li>
<li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+Bowel+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li>
<li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+Disease+of+the+Colon%2C+Rectum%2C+and+Anus%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li>
<li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li>
<li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li>
<li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+cloning%3A+advances+and+applications%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li>
<li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Coloproctology%22%5BJournal%5D)">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li>
<li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Radio+Graphics%22%5BJournal%5D)">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li>
<li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li>
<li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease%3A+Mechanisms+and+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+%CE%B2-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li>
<li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li>
<li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li>
<li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li>
<li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+Structures%2C+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>van der Heijden, P. j, Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 시각적 프로토콜은 라미나 프로피아 림프구(LPL)를 포함하는 결장 단핵 세포의 분리를 위한 잘 용납되는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 염증성 사이토카인과 조직 손상이 회복 된 MNC의 가난한 생존력에 자신을 빌려 심각한 이식 후 마우스 대장염 모델을 평가에 최적화 된 것을 감안할 때, 우리는 이러한 방법이 다른 것으로 번역 될 수 있음을 예상 결장 MNC의 현상학적 분석을 요구하는 응용 프로그램. 이들은, 선동적인 장 질병의 마우스 모형에 있는 결장 염증, 대장염 표적으로 한 처리의 면역 반응의 연구 결과, 및 전염성 병원체에 의해 생성된 대장염을 포함하지만, 이에 국한되지 않습니다. 추가적으로, 건강한 (syngeneic BMT) 마우스에 있는 격리를 사용하여 우리의 데이터는 격리 절차가 MNC 격리에 있는 면역 세포 검출을 허용하기 위하여 중요한 선동적인 침투를 요구하지 않는다는 것을 표시합니다. 실제로, 유사한 데이터는 치료되지 않은 건강한 (비 BMT) 마우스를 사용하여 수득되었습니다 (데이터는 도시되지 않음).</...

위장 (GI) 관은 주로 음식에서 영양소의 처리 및 재흡수에 전념하지만, 위관은 또한 혈관, 림프, 신경계 및 수많은 다른 장기의 무결성에 중심 적인 역할을 유지합니다. 그것의 점막 및 점막 면역 계통1. GI 면역 계통은 음식, 공생 박테리아, 또는 침입 병원체에서 외국 항원에 그것의 일정한 노출 때문에 위장 및 전신 건강 둘 다에 있는 영향력 있는 역할을 합니다1,2. 따라서, GI 면역 계통은 병원성 항원1,2에적절히 반응하면서 비병원성 항원을 용인하는 섬세한 균형을 유지해야 한다. 관용과 방어의 균형이 중단되면, 국소화 또는 전신 면역 dysregulation 및 염증은 질병의 무수한 의 결과로 발생할 수 있습니다1,2,3.
창자 항구 적어도 70% 본문에 있는 모든 림프 세포의4. 대부분의 1 차적인 면역학 상호 작용은 창자에 있는 3개의 면역 국중 적어도 1개를 관련시킵니다: 1) Peyer의 패치, 2) 상피 내 림프구 (IEL) 및 3) 라미나 프로피아 림프구 (LPL). 이들의 각각은 창자5에있는 일반적인 면역 도전에 급속하게 반응하는 면역 세포의 복잡한 상호 연결된 네트워크로 이루어져 있습니다. 근육 점막 위의 기질로 제한되는 느슨하게 구조화 된 라미나 프로프리아는 창자 점막의 결합 조직이며 융모, 혈관 구조, 림프 배수 및 점막 신경계뿐만 아니라 많은 선천성 신경 조직에 대한 비계를 포함합니다. 및 적응 면역 하위 집합6,7,8,9. LPL은CD4+ 및CD8+ T 세포로 구성되며, 약 2:1의 비율로, 혈장 세포 및 골수성 혈통 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및 대식세포6을포함한다.
다양한 질병 상태에 관련되어 있는 면역 dysregulation 및 창자의 염증을 이해에 있는 증가하는 관심사가 있습니다. 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 조건은 모두 대장염증10,11,12의다양한 수준을 나타낸다. 추가적으로, 동종 골수 이식 (allo-BMT)를 겪는 골수 또는 면역 계통의 악성 또는 비 악성 무질서를 가진 환자는 1) 조건정 식이요법에서 직접 독성을 포함하여 대장염의 각종 양식을 개발할 수 있습니다 BMT 전, 2) BMT 및 3) 이식편 대 숙주 질환(GVHD)에 의해 유발된 감염은 BMT13,14,15이후 조직에서 공여자 알로항원에 반응하는 기증자 형 T 세포에 의해 구동된다. 이 모든 포스트 BMT 합병증은 장의 면역 군대에 있는 중요한 변경 귀착됩니다16,17,18. 제안된 방법은 마우스 결장에서 면역 세포 축적의 신뢰할 수 있는 평가를 허용하고, BMT 후 뮤린 수용자에 적용될 때, 이식 내성 19에 관여하는 기증자 및 수용자 면역 세포 둘 다의 효율적인 분석법을 용이하게한다. ,20. 창 자 염증의 추가 원인은 악성 포함, 음식 알레르기, 또는 창 자 미생물의 중단. 이 프로토콜은 결장에서 창자 단핵 세포의 접근을 허용하고, 수정으로, 이 전임상 뮤린 모형의 소장의 백혈구에.
"내장 및 면역 세포 및 격리"라는 검색어를 사용한 PubMed 검색은 면역 세포를 추출하기 위해 소장 소화 방법을 설명하는 200 개 이상의 간행물을 보여줍니다. 그러나, 결장에 대 한 유사한 문학 검색 콜론에서 면역 세포의 격리를 지정 하는 잘 설명 된 프로토콜을 산출. 이것은 결장이 더 많은 근육과 간질 층을 가지고 있기 때문일 수 있습니다, 그것을 더 어렵게 소장 보다는 소화하기 위하여 렌더링합니다. 기존 프로토콜과 달리, 이 프로토콜은 다른 세균성 콜라게나제(콜라게나제 D/콜라게나아제 I)없이 클로스트리디움 의 콜라주나아제 E를 사용합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여, 결장 조직의 소화가 나트륨 versenate (EDTA), Dispase II및 와 같은 반대로 응집 시약의 추가 없이 고립된 창자 단핵 면역 세포 (MNC)의 질을 보존하면서 달성될 수 있다는 것을 보여줍니다 deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. 이 프로토콜은 추가 지시 된 연구를 위해 뮤린 결장에서 생존 가능한 MNC의 재현 가능한 강력한 추출을 허용하도록 최적화되어 있으며 결장의 면역학 또는 소장 (수정)의 연구에 자신을 빌려주어야합니다24, 25.

<table><tbody><tr><td>60mm Petri Dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>BW17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>10mL 일회용 혈청학 피펫</td><td>Corning</td><td>4100</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15mL 비멸균 원추형 튜브</td><td>TruLine</td><td>TR2002</td><td></td></tr><tr><td>18 G 무딘 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 일회용 혈청 피펫</td><td>Corning</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 기공 크기 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A4503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>고정 완충액</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 </ > Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 효소 E</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 m 멸균 솔루션</td><td>Amresco</td><td>E177-500ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td><td>SV30014.03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GE Healthcare-HyClone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare-Life Sciences</td><td>1708901</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>VWR 생명 과학 Amresco</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>론자 바이오휘태커</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

콜라게나아제 e를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

창 자 본문에 면역 세포의 가장 큰 수에 가정. 작고 큰 장 내 면역 계통은 외인성 항원에 노출하고 강력한 미생물 유래 면역 자극에 대한 반응을 조절합니다. 이러한 이유로, 장은 크론병및 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주질환(GVHD)과 같은 염증성 장질환을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 질병에서 면역 조절 및 염증의 주요 표적 부위이다. 골수 이식 (BMT), 그리고 많은 알레르기 및 전염성 조건. 위장 염증과 대장염의 뮤린 모델은 GI 합병증을 연구하고 예방 및 치료를 위한 전략을 전임상적으로 최적화하는 데 많이 사용됩니다. 장에서 면역 세포의 격리 및 phenotypic 분석을 통해 이러한 모델에서 수집 된 데이터는 위장 및 전신 염증 성 질환을 개량 할 수있는 추가 면역 이해에 중요하다. 이 보고서는 혼합 실리카 기반 밀도 구배 계면을 사용하여 결장으로부터 단핵 세포(MNC)를 분리하기 위한 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 오염 된 파편을 최소화하면서 생존 가능한 백혈구의 상당수를 재현하여 유세포 분석 또는 다른 방법에 의해 후속 면역 자형법을 허용합니다.

뮤린 결장 질환 모델로 작업할 때, 염증 과정에 관여하는 결장의 MNC, 다중 면역 세포 서브세트를 정량화하고 질적으로 평가할 수 있는 것이 도움이 된다. 이 프로토콜의 적용을 통해 얻은 MNC의 단세포 현탁액은 강력하고 재현 가능한 방식으로 이러한 현상형 특성화를 용이하게 한다. 다양한 실험 설정하에서 이러한 격리 방법의 적용에 대한 원리의 증거로서, 우리는 이 방법을 사용하여 콜로닉 MNC를 회수하고 마우스로부터 분리된 세포에 대한 다중 파라미터 유동 세포측정을 수행하였다(도1 및 그림 2 , 동종 BMT) (도2A,syngeneic BMT)BMT 에 따른 상당한 면역 매개 대장 손상.
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이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

이 프로토콜을 사용하여 장에서 면역 세포의 phenotypic 분석에서 격리는 GI및 전신 염증 장애의 이해에 적용 할 수 입증했다. 이 방법은 플뢰르의 아토미트리 또는 기타 방법에 의해 후속 면역 현상기를 허용하는 오염 된 파편을 최소화하여 실행 가능한 단일 핵 세포의 상당수를 격리합니다. 장이 많은 질병에 있는 염증의 주요 표적 사이트이기 때문에, 이 프로토콜은 암, 알레르기, 이식 및 자기 면역의 마우스 모형에 있는 장 면역 집단의 연구 결과에 유용할 지도 모릅니다.이 프로토콜의 수율과 효율성을 최적화하려면 주요 솔루션과 재료를 미리 준비하는 것이 좋습니다. 마우스를 안락사시키고 수직 중간선 절개를 한 후 미세 해부 가위를 사용하여 회랑을 엽니다. 집게를 사용하여 작은 창자를 한쪽으로 이동하고 내림차순 결장이 노출됩니다.내림차순 결장위로 약간 위로 당겨 결장의 직장 부분을 최대적으로 노출시합니다. 그런 다음, 골반 깊숙이 해회 직장을 잘라 세칼 캡에 실외 창자에서 하나의 단위로 전체 결장해. 첫째, 축축한 종이 타월에 결장들을 놓고 가위 나 집게 한 쌍의 무딘 끝을 사용하여 창자 벽에 가벼운 압력을 가하고 고체 대변을 추출하십시오.다음으로, 결장들을 페트리 접시에 놓고 18게이지 무딘 채워진 바늘로 10 밀리리터 주사기를 사용하여 차가운 결장 버퍼 10밀리리터로 용기를 플러시합니다. 콜론을 5-10 밀리리터의 차가운 결장 버퍼로 가득 찬 페트리 접시에 놓고 나머지 식민지 내용을 씻기 위해 수동으로 교반하십시오. 이 워시를 2-3회 반복하여 각 세척에 신선한 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시를 사용하십시오.그 후, 콜론을 신선한 냉장 결장 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시로 옮춥니다. 결장은 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장까지 세로로 잘라서 단일 직사각형 열린 결장 조각을 생성합니다. 접시의 중앙값을 버리고 깨끗한 차가운 결장 버퍼로 대체하십시오.직사각형 결장 조직을 결장 버퍼로 축화한 종이 타월에 놓고 수평으로 잘라서 작은 조각으로 자릅니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 콜론 조각을 수집 50 밀리 리터 폴리 프로필렌 원추형 튜브 포함 20 차가운 결 장 버퍼의 밀리 리터. 그런 다음 튜브를 30초 동안 적극적으로 소용돌이시켜 조각을 씻습니다.세척 후, 조직 조각이 차혈을 탈피하거나 진공 청소기 전에 튜브의 바닥에 정착하자, 조직 조각을 잃지 않도록확인, 각 세척에 대한 신선한 결장 버퍼를 사용하여이 전체 세척 과정을 3 번 반복. 시작하려면 세척된 결장 조각을 포함하는 튜브에 콜라게나아제 소화 버퍼 20 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 밀봉하고 60 분 동안 2 회 G의 회전 속도로 섭씨 37도에서 궤도 셰이커에 놓습니다.조직 파편이 교반 중에 일정한 움직임에 있는지 확인하십시오. 먼저, 66%의 실리카 기반 밀도 분리 매체를 각각 3개의 분리된 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 붓습니다. 다음으로, 콜라게나제 소화 1에서 상퍼만 수집하기 위해 25 밀리리터 세로지오티 파이펫을 사용합니다.깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 원간 튜브에 배치 40 마이크로 리터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 상체를 필터링합니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 완전히 채우면 콜라게나아제 소화 버퍼를 담금질하십시오. 그런 다음 세포를 회전시키고, 슈퍼나티를 흡인하고, 펠릿을 얼음 위에 두십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜라게나아제 소화 2를 계속 수행합니다. 콜라게나아제 소화 2가 완료된 후, 18게이지 무딘 엔드 바늘을 통해 튜브와 10 밀리리터 주사기 사이에 조직 조각을 적극적으로 앞뒤로 플러시합니다. 적어도 7-8 개의 구절에 대한이 플러시를 반복, 총 조직 파편이나 debri가 볼 때까지 계속.다음으로, 40 마이크로미터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 조직 분리 현탁액을 깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 넣습니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 림에 채우고 소화와 원심분리기를 섭씨 4도에서 섭씨 4도에서 5분간 담금질합니다. 진공 포부를 통해 상체를 버리고 콜라게나제 소화 1에서 해당 튜브로 재 부유 한 펠릿을 당깁니다.그 후, 콜론당 44%실리카 기반 밀도 분리 매체의 24밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단한다. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 포함하는 3개의 튜브에 이 매체의 8 밀리리터를 천천히 층으로 부릅니다. 계량 스케일 또는 균형을 사용하여 원심분리기 버킷 내의 튜브의 균형을 신중하게 조정합니다.원심분리기는 섭씨 20도에서 859회 G로 20분간 쉬지 않고 휴식을 취합니다. 로더가 튜브를 제거하기 전에 휴식을 취하도록 허용하고 그라데이션 인터페이스에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 첫째, 일반적으로 1-2 밀리리터 두께의 흰색 밴드가 존재하는 5 밀리리터 마크 근처의 그라데이션 인터페이스를 시각화합니다.진공 흡인및 인터페이스에 쉽게 파이펫 액세스를 허용하기 위해 그라데이션의 상위 7 밀리리터를 폐기합니다. 연속 수동 흡입 및 꾸준한 회전 손목 모션을 사용하여 셀의 인터페이스 레이어를 수집합니다. 두 그라데이션 사이의 인터페이스가 명확하고 재구성될 때까지 수집하고 인터페이스를 새로운 50 밀리리터 폴리프로필렌 원내 튜브로 전송합니다.다음으로 총 서스펜션이 50밀리리터에 도달할 때까지 FACS 버퍼를 이 욕조에 추가합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 800배 G로 5분간. 그런 다음, 진공 포부를 통해 상류체를 흡인하고 FACS 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.이 비디오에 설명된 절차는 결장에서 단핵 세포를 분리하거나, 수정과 함께, 소장으로부터 분리하는 데 사용할 수 있다. 또한 세포측정및 데이터 분석은 분리를 위해 콜라게나아제 E 또는 D를 사용할 때 세포 및 괴사/죽은 림프구의 분획을 DNAse 1 치료 없이 당사와 비교하기 위해 수행됩니다. 별관 에 이어 5 각 절연 다음 단일 세포 현탁액에 고정 된 살아있는 죽은 푸른 염료 염색, DNAse없이 콜라게나아제 E는 DNAse없이 콜라게나아제 D에 비해 격리 후 라이브 셀의 상당히 높은 비율을 보였다.DNAse와 콜라게나아제에 비해 경우에도 마찬가지입니다. 또한 콜라게나아제 D군의 90.0%에 비해 콜라게나아제 E군에서 괴사 세포를 41.0%의 중간 비율로 확인하였다. 콜라게나세 E DNAse 그룹에서 75.9%, 콜라게나아제 DNAse 그룹에서 80.3%를 차지했다.다중 계측흐름 세포측정은 BMT 또는 동종 또는 합성 BMT 모델을 받은 후 7일째 CD45.2 밸브-C 수신자 마우스로부터 분리된 MNC에 적용된다. BMT 수령인의 결장에서 추출된 기증자 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포의 평균 절대 숫자는 계산되고 비교된다. 따라서 이러한 마우스 모델에서 희귀 면역 세포 집단을 식별 및/또는 수량화하는 것이 중요할 수 있습니다.기증자 유래 FOX-P3 양성 T 조절 세포를 포함하는 희귀 한 하위 세트는 합성 및 동종 BMT 모델 모두에서 평가됩니다. 이 방법을 사용하여, 심지어 희귀 한 하위 집합, 기증자 파생 된 대장 T 조절 수신자 마우스 결장에 침투, BMT 후, 분석 될 수있다. 콜라게나아제 E는 섭씨 37도에서 활동한다는 점에 유의해야 합니다.따라서 모든 콜라게나아제 솔루션은 적절한 콜라게나아제 활동을 위해 미리 데워지고 활동을 종료하도록 철저히 담금질해야 합니다. 이 프로토콜은 플뢰르 세포측정, 분자 생물학 기술, 현미경 검사법, 배양 및 그 외의 사이트에 의해 후속 특성화에 사용될 수 있는 많은 수의 단일 핵 세포를 허용합니다. 이 프로토콜은 골수 이식 모형에 있는 실험 대 통제마우스의 결장에 있는 염증의 믿을 수 있는 평가를 제공했습니다.따라서 이식 내성의 새로운 규제 면역 메커니즘의 발견을 촉진. 클로스트리디움 이스토리티쿰의 콜라게나제는 실험실 안전 기술로 처리해야 하는 시약입니다. 흡입시 건강에 해를 끼치고 피부와 눈 자극을 유발할 수 있습니다.

isolation-lamina-propria-mononuclear-cells-from-murine-colon-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

이 비디오에서는 콜라겐 분해 효소 E 및 실리카 기반 밀도 분리 매체 구배 분리를 사용한 효소 분해를 통해 쥐 결장 조직에서 lamina propria 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵 셀은 후속 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

Lamina Propria 단핵 세포 분리: 쥐 결장에서 단핵 세포를 얻기 위한 실리카 기반 밀도 구배 원심분리 기술

근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

여기에서는 기저에 있는 크립트 베이스 세포에서 공간적으로 구별되는 쥐 결장 상피 표면 세포를 분리하는 간단한 방법을 설명합니다.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

이 연구에서는, 우리는 Crohn의 섬유증에 비교병생리학을 전시하는 TNBS 중재장 섬유증의 상세한 절차를 기술합니다. 우리는 또한 라파마이신이 장 섬유증에 대한 억제 효과를 촉진에 비추어이 접근법을 논의합니다.

TNBS 중재장 섬유증의 발달에 기계론적 통찰력 과 라파마이신의 억제 효과 평가

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

여기에서 우리는 텔로세포를 포함한 쥐의 장 중간엽을 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이들은 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양과 같은 여러 응용 분야에 사용하여 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

배우세요 콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장 라미나 프로프리아에서 단핵 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 장면역 세포 면역표현형 분석 및 염증성 장질환 연구에 활용됩니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

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