Name: Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore da cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo permette studi ad alto rendimento sui meccanismi delle cardiopatie congenite.

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E. T. è stato supportato da The Magic That Matters e AHA. C. K. è stato supportato da sovvenzioni da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.

NOT:</</c0> Nella generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache del campo cardiaco specifiche del campo cardiaco (Figura 1).
1. Manutenzione degli ESC del mouse
<ol><li>Coltivare mESC (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 su 0,1% (w/v) gelatina rivestita t25 flaconi in 2i media (870 mL di glascow minimo mezzo essenziale (GMEM), 100 mL di siero bovino fetale (FBS), 10 mL di GlutaMAX, 10 mL di acidi essenziali non essenziali, 10 ml di piravae, 3 - L di beta-mercaptoetanolo, 20-L di Lif (200 U/mL), 0,3 CHIR99021 e 0,1 -M PD0325901).</li>
	<li>Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, sciacquare le cellule una volta con soluzione tampone fosfato (PBS) e quindi dissociare in singole cellule aggiungendo 1 mL di Trypsin e incubando a 37 gradi centigradi per 3 min.</li>
	<li>Neutralizza Trypsin aggiungendo 4 mL di 10% FBS nel DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco. Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato.</li>
	<li>Centrifuga 3 x 105 cellule per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirati il supernatore, sospendere le cellule in 5 mL di mezzo 2i e riplaccare su 0.1% (w/v) gelatina rivestita flaconi T25 per la manutenzione.</li>
</ol>2. Generazione di cellule progenitrici cardiache utilizzando sferoidi cardiaci
<ol><li>Centrifuga 2,5 x 106 cellule dal passo 1,3 per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 25 mL di mezzo SFD (105 celle / mL). A seconda della portata dell'esperimento, il numero mESC può essere regolato di conseguenza. NOT:</</c3> Il supporto SFD contiene 715 mL di Medium (IMDM) di Iscove, 250 mL di F12 di Ham, 5 mL di N2-supplemento, 10 mL di B27 meno vitamina A, 5 mL di 10% (w/v) BSA (in PBS), 7,5 mL di GlutaMAX e 7,5 mL di Penicillina-Streptomimia. Aggiungere l'acido ascorbico (50 mg/mL) e 3,9 x 10-3% (v/v) di monothioglicerolo prima dell'uso.</li>
	<li>Infilare la sospensione cellulare in una piastra sterile da 150 mm x 25 mm e incubare a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 48 h. Gli sferoidi cardiaci devono essere formati entro 24 ore.</li>
	<li>Raccogliere tutti gli sferoidi cardiaci formati e centrifugare per 3 min a 145 x g e temperatura ambiente per isolare selettivamente gli sferoidi ed evitare singole cellule.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere gli sferoidi in 25 mL di mezzo SFD con 1 ng/mL di Activin A e 1.5 ng/mL di BMP4 per l'induzione differenziazione. Placcare gli sferoidi nella stessa piastra sterile da 150 mm x 25 mm e incubarli a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 40 h. NOT:</</c8> Diverse concentrazioni di Activin A (0-3 ng/mL) e BMP4 (0,5-2 ng/mL) possono essere utilizzate per l'ottimizzazione della differenziazione a seconda della linea mESC.</li>
	<li>Raccogliere tutti gli sferoidi cardiaci e centrifugare per 3 min a 145 x g e temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere gli sferoidi in 25 mL di SFD medio. Trasferire gli EB risospesi in un accessorio ultra-basso 75 cm2 fiaschetta e incubarli a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 48 h.</li>
</ol>3. Isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco mediante reporter fluorescenti
<ol><li>Centrifuga sferoidi cardiaci a 145 x g e temperatura ambiente per 3 min e aspirare il supernatante. Aggiungere 1 mL di Trypsin e incubare a 37 gradi centigradi per 3 min.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di 10% FBS in DMEM per inattivare Trypsin e mescolare bene con il pipettaggio. Per rimuovere gli EB non dissociati, filtrare il mix utilizzando un colino da 70 mm e centrifugare le cellule filtrate per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.</li>
	<li>Ordinare i CPC che trasportano reporter fluorescenti (CPC derivati da mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspira il superataento e aggiunge la 500 unità di smistamento FACS (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES e 10 mM di EDTA in PBS) per la sospensione.</li>
	<li>Per rimuovere tutti i cluster di cellule prima dello smistamento, filtrare nuovamente le cellule utilizzando un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL con un colino da 40 m. Tenere le cellule sul ghiaccio fino allo smistamento.</li>
	<li>Ordinare le celle per isolare Tbx1-Cre; Rosa-RFP e HCN4-GFP CPC positivi utilizzando un sorter cellulare attivato fluorescente (FACS). Raccogliere le celle ordinate in 1 mL di FBS. Mantenere il campione di celle e le celle ordinate a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco utilizzando Cxcr4 come indicatore di proteine della superficie cellulare
<ol><li>Per isolare i CPC di primo campo contro il secondo campo cardiaco in base all'espressione del recettore della proteina superficiale Cxcr4, utilizzare la linea mESCIsl1-RFP. Aspirare il supernatante dal passo 3.3 e risospendere i singoli CPC in 300 : L di 10% FBS in PBS contenente 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 5min e lavare aggiungendo 1-2 mL di PBS freddo. Centrifugare i singoli CPC per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente e lavare altre due volte seguite dalla centrifugazione.</li>
	<li>Aspirati il supernatante e aggiungete 500 l di soluzione di selezione FACS per risospendere i singoli CPC e filtrare come nel passaggio 3.4.</li>
	<li>Isolare le celle Cxcr4 e Cxcr4 utilizzando FACS. Raccogliere le celle ordinate in 1 mL di FBS. Mantenere il campione di celle e le celle ordinate a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>5. Analisi delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco isolato
<ol><li>CPC ordinati Centrifuga per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente. Le cellule ordinate possono essere utilizzate per analisi dell'espressione genica e proteica oppure possono essere ricoltivate per le analisi in momenti successivi.</li>
	<li>Per ricolturare cPC isolati, aspirare il supernatore, risospendere le cellule in mezzo SFD e riaffiorare 3 x 104 celle per un piatto di 384 pozzetti rivestito con 0,1% (w/ v) gelatina.  Se si nota un aumento della morte cellulare dopo l'ordinazione, aggiungere al campione 10 M di Y-27632 (inibitore ROCK). Due giorni dopo la ricoltura, si deve notare il pestaggio spontaneo.</li>
	<li>Per analizzare la capacità dei CPC placcati di differenziarsi ai cardiomiociti, raccogliere le cellule al giorno 12 della differenziazione. Utilizzare la Trypsin come descritto nei passaggi 1.2-1.5 per isolare le singole PMI. Resospendio le cellule in paraformaldeide (PFA) del 4% (w/v) e incubaperdi per 30 min a temperatura ambiente per fissare le cellule.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 3 min a 895 x g, e temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in PBS per lavare il PFA. Ripetere di nuovo questo passaggio.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10% FBS in PBS. Incubametà metà del campione cellulare con anticorpo topo anti-Troponina T (1:500) e utilizzare il resto del campione come controllo negativo. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle due volte come descritto nel passaggio 5.4 utilizzando PBS. Aspirati il superatante e risospendere entrambi i campioni di cellule in 10% FBS in PBS con 1:500 asino anti-topo IgG (H-L) anticorpo, Alexa Fluor 647 coniugato. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare due volte con PBS come nel passaggio 5.6. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 200 gradi l di PBS. Utilizzare un citometro di flusso per analizzare le cellule.</li>
</ol>

<ol><li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li>
<li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413(2012).</li>
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<li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp%2FWnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla per le divulgazioni.

Nel nostro protocollo, descriviamo una metodologia per generare sferoidi cardiaci e CPC isolati specifici sul campo del cuore. Questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi di specifica CPC e le loro proprietà, così come per la modellazione della malattia della camera cardiaca specifica. Un lavoro pubblicato in precedenza ha utilizzato una linea mESC con due reporter fluorescenti (Mef2c/Nkx2.5) per studiare cardiogenesi in vitro, tuttavia, entrambi questi marcatori sono espressi al giorno embrionale 9,5-10 q...

L'uso di cellule staminali pluripotenti (PSC) ha rivoluzionato il campo della rigenerazione cardiaca e della medicina personalizzata con miociti specifici per il paziente per la modellazione della malattia e le terapie farmacologiche1,2,3, 4.Più recentemente, sono stati sviluppati i protocolli in vitro per la generazione di cardiomiociti atriale vs ventricolare e di un pacemaker derivato da PSC5,6. Tuttavia, se la cardiogenesi può essere ricreata in vitro per studiare lo sviluppo cardiaco e successivamente generare cellule cardiache ventricolare specifiche della camera non è ancora chiaro.
Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule mesodermiche sotto l'influenza di morfogeni secreti come BMP4, Wnts e Activin A formano la striscia primitiva7. Le cellule mesodermiche cardiache segnate dall'espressione di Mesp1 migrano anteriormente e ultimamente per formare la mezzaluna cardiaca e poi il tubo cardiaco primitivo7,8. Questo gruppo migratorio di cellule comprende due distinte popolazioni di cellule progenitrici cardiache (CPC), vale a dire il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF)9,10. Le cellule del SHF sono altamente proliferanti e migratorie e sono principalmente responsabili dell'allungamento e del looping del tubo cardiaco. Inoltre, le cellule SHF si differenziano per cardiomiociti, fibroblasti, muscoli lisci e cellule endoteliali mentre entrano nel tubo cardiaco performare il ventricolo destro, il tratto di deflusso ventricolare destro e gran parte di entrambi atri atri,10. Al contrario, le cellule FHF sono meno proliferanti e migratorie e si differenziano principalmente per i cardiomiociti in quanto danno origine al ventricolo sinistro e una parte più piccola degli atri11. Inoltre, i progenitori SHF sono contrassegnati dall'espressione di Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 mentre le cellule FHF esprimono Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
I PSC possono differenziarsi a tutti e tre glistrati germinali e successivamente a qualsiasi tipo di cellula nel corpo 4,16. Pertanto, offrono un enorme potenziale per comprendere lo sviluppo del cuore e per modellare difetti specifici dello sviluppo con conseguente malattia cardiaca congenita, la causa più frequente di difetti alla nascita17. Un grande sottogruppo di malattie cardiache congenite include anomalie cardiache specifiche della camera18,19. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi provengano dallo sviluppo anomalo del campo cardiaco. Inoltre, data l'incapacità dei cardiomiociti di proliferare dopo la nascita, ci sono stati ampi sforzi per creare tessuto cardiaco per la rigenerazione cardiaca1,7,20. Considerando le differenze fisiologiche e morfologiche tra le camere cardiache, la generazione di tessuto cardiaco specifico della camera utilizzando i PSC è di notevole importanza. Mentre i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo hanno portato a una solida generazione di cellule cardiache da PSC, non è ancora chiaro se i due campi cardiaci possano essere indotti nei sistemi PSC.
Per ricapitolare cardiogenesi in vitro e studiare le specifiche e le proprietà dei CPC, in precedenza abbiamo usato un sistema basato sulla differenziazione degli sferoidi cardiaci derivati da PSC21,22,23,24. Recentemente, abbiamo generato cellule staminali embrionali di topo (mESC) con gFP e reporter RFP sotto il controllo del gene FHF Hcn4 e del gene SHF Tbx1, rispettivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Gli mESC differenziati in vitro formavano sferoidi cardiaci in cui le cellule GFP e RFP sono apparse da due aree distinte di cellule mesodermiche e modellate in modo complementare. Le cellule di GFP e RFP e RFP risultanti hanno mostrato caratteristiche FHF e SHF, determinate rispettivamente dalle analisi di sequenziamento dell'RNA e clonali. È importante sottolineare che, utilizzando mESC che trasportano il reporter Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), abbiamo scoperto che le cellule SHF sono state contrassegnate fedelmente dalla proteina della superficie cellulare CXCR4, e questo può consentire l'isolamento delle cellule specifiche del campo cardiaco senza transgeni. Il presente protocollo descriverà la generazione e l'isolamento di CPC specifici sul campo cardiaco da mESC, che possono fungere da valido strumento per studiare le malattie cardiache specifiche della camera.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>0,1% (p/v) Gelatina</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS senza calcio e magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>20% Paraformaldeide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-493</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL Tubo in polistirene a fondo tondo con 40&mu; filtro cellulare m</td><td>BD Falcon</td><td>35223</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R & D Systems</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 meno vitamina A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R & D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td>Sony o qualsiasi altro selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Legend XT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004508</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck chemicals</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td></td></tr><tr><td>Corning Ultra Low Attachment T75 Pallone</td><td>Corning</td><td>07-200-875</td><td></td></tr><tr><td>Innumerevoli contatori cellulari automatizzati II FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anticorpo secondario IgG di topo, Alexa Fluor 647 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571, Lotto #1757130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>Microscopio Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino</td><td>Invitrogen</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow' s MEM (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12</td><td>Gibco</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerero (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-troponina T di topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MS-295-P1</td><td></td></tr><tr><td>N2-SUPPLEMENT</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Non essenziale soluzione di aminoacidi (NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-efluor 710 anticorpo coniugato anti-Cxcr4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura in sospensione 150 mm x 25 mm</td><td>Fiasche Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (tripsina)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inibitore ROCK)</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Le cellule staminali pluripotenti offrono un grande potenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia del cuore e per la medicina rigenerativa. Sebbene i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo abbiano portato a generare cellule cardiache da cellule staminali pluripotenti, non è chiaro se i due campi cardiaci - il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF) - siano indotti nei sistemi di cellule staminali pluripotenti. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un protocollo per la specifica in vitro e l'isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. Abbiamo usato linee di cellule staminali embrionali che trasportano Hcn4-GFP e Tbx1-Cre; I giornalisti Rosa-RFP del FHF e dello SHF, rispettivamente, e l'immunostaining delle cellule vive della proteina della membrana cellulare Cxcr4, un marcatore SHF. Con questo approccio, abbiamo generato cellule progenitrici che ricapitolano le proprietà funzionali e il trascrittoma delle loro controparti in vivo. Il nostro protocollo può essere utilizzato per studiare le specifiche iniziali e la segregazione dei due campi cardiaci e per generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache. Poiché si tratta di un sistema organoide in vitro, potrebbe non fornire informazioni anatomiche precise. Tuttavia, questo sistema supera la scarsa accessibilità degli embrioni dello stadio di gasastrulation e può essere scalato per schermi ad alta velocità.

Dopo circa 132 h di differenziazione, i CPC Tbx1-RFP e Hcn4-GFP possono essere rilevati utilizzando un microscopio fluorescente (Figura 2). Generalmente, le celle GFP e RFP appaiono approssimativamente intorno allo stesso tempo. Le due popolazioni di CPC continuano ad espandersi nelle immediate vicinanze e comunemente in un modello complementare. L'adeguamento delle concentrazioni di Activin A e BMP4 modificherà le percentuali di FHF vs CPC SHF (Figura 3). La sp...

Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Il nostro metodo mira a generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco dalle cellule staminali embrionali del topo. Questa linea di cellule staminali reporter del campo cardiaco consente lo studio ad alta produttività dei meccanismi alla base delle malattie cardiache congenite, fornendo un sistema suscettibile di manipolazione genetica e farmacologica. Ci sono diverse malattie cardiache congenite specifiche della camera.Ricapitolando la cardiogenesi in vitro, questo protocollo consente lo studio del meccanismo della malattia e lo sviluppo di future terapie rigenerative. Questo protocollo può fornire informazioni su come vengono specificate cellule progenitrici cardiache di diverse camere durante lo sviluppo cardiaco. Inizia coltivando cellule staminali embrionali di topo transgeniche in matracci T25 rivestiti di gelatina dello 0,1% in mezzo 2i.Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, sciacquare le colture con PBS e aggiungere un millilitro di tripina per pallone per dissociare la coltura in singole cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la reazione con quattro millilitri 10 FBS in DMEM e cont

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Questo protocollo descrive come produrre funzionale del seno tessuto nodale da cellule murine staminali pluripotenti (PSC). T-box3 (TBX3) sovraespressione più cardiaca miosina pesante catena (MYH6) selezione antibiotica promoter porta a aggregati altamente puri di cellule pacemaker. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") contengono più di 80% di cellule pacemaker, mostrano fortemente aumentato i tassi di battere e sono in grado di camminare miocardio ex vivo.

Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente

Qui, descriviamo un protocollo per creare organoidi cardiaci umani rilevanti per lo sviluppo (hHO) in modo efficiente utilizzando cellule staminali pluripotenti umane mediante auto-organizzazione. Il protocollo si basa sull'attivazione sequenziale dei segnali di sviluppo e produce tessuti cardiaci umani altamente complessi e funzionalmente rilevanti.

Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti

Scopri come generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore da cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo permette studi ad alto rendimento sui meccanismi delle cardiopatie congenite.

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

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