Name: RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶRNAメチルトランスフェラーゼ活性分析の抗体フリーアッセイ。トリチウム標識S-アデノシルメチオニンを用いて、in vitroでRNAメチル化を定量的・定性的に評価する方法です。抗体アーティファクトを回避し、酵素活性や変異体の影響を正確に測定できます。

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著者たちは、ChemDrawに対する彼の助けに対して、トゥルジャ・カンティ・デブナート博士に感謝したいと思います。Xhemalçeラボでの研究は、国防総省によってサポートされています - 議会指向医学研究プログラム - 乳癌ブレークスルー賞(W81XWH-16-1-0352)、NIHグラントR01 GM127802および細胞研究所からのスタートアップ資金と米国オースティンのテキサス大学の分子生物学と自然科学のカレッジ。

1. 標的RNAのインビトロ転写およびゲル精製
<ol><li>確立された分子クローニング技術12またはキットを使用してT7および/またはSP6プロモーターを含むプラスミドに目的の配列をクローンする。</li>
	<li>インビトロ転写のためのDNAテンプレートの線形化
	<ol>
<li>プラスミドのPCRによる関心の配列を、インサートを介してT7プロモーター領域を含むように設計されたプライマーで増幅し、前述の13と同様に上流+20〜30bpアップストリームと下流である。</li>
		<li>あるいは、制限酵素(RE)切断部位を用いてプラスミドのダイジェスト5μgを、REのサプライヤーの指示に従って下流にインサートで利用可能とする。 注: 選択した RE によって挿入がカットされていないことを再確認してください。このステップで使用されるREの選択は、転写物の収率に劇的に影響を与える可能性があります。優先的には、反対側のDNA鎖14上のT7 RNAポリメラーゼのテンプレート切り替えを避けるためにREを製造する鈍いまたは5'-オーバーハングエンドで線形化する。初期歩留まりが不十分な場合は、別の RE を試してください。</li>
	</ol></li>
	<li>DNAアガロースゲル抽出とクリーンアップのためのキットを使用して得られたDNAを浄化します。30 μLの水でDNAを溶出します。</li>
	<li>渦、ピペ、1.5 μLでよく混合し、マイクロボリューム分光光度計でDNA濃度を測定します。</li>
	<li>250 ngのDNAを使用して、1%のアガロースゲル電気泳動の精製DNAの品質と大きさを1x TBEバッファーで4V/cmで1時間移行しました。</li>
	<li>インビトロ転写キットの凍結試薬を解凍する。T7 RNA ポリメラーゼミックスを氷の上に置き、他の試薬を室温でヌタターに置きます。完全な解凍の直後に、5sのrNTPチューブを素早く回転させ、チューブの底部に溶液を集め、氷の上に置きます。沈殿を避けるために、室温で10x反応バッファーを保ちます。</li>
	<li>1.5 mLチューブにピペットは、指定された順序で室温で20 μL転写反応の次のコンポーネント:水の6 μL、線形DNAテンプレートの2 μL(0.1 - 1 μg)、75 mM GTP溶液の2 μL、75 mM GTP溶液の2 μL、75 mM CTP 溶液の 2 μL、75 mM UTP 溶液の 2 μL、10 倍の反応バッファーの 2 μL、および T7 RNA ポリメラーゼ ミックスの 2 μL。 注:PCRによって生成されたDNAテンプレートの場合は、100~ 200 ng DNAを使用します。プラスミドの制限酵素ダイジェストによって生成されたDNAテンプレートについては、〜1 μg.活性組換えHis6-タグ付きT7 RNAポリメラーゼを大腸菌15で精製することができる。</li>
	<li>チューブを十分に混ぜます。チューブの底部に反応溶液を集めるために5sのクイックスピンを行い、その後2〜4時間37°Cでインキュベートします。 注:すべてのトランスクリプトは、DNAテンプレート、その長さ、その配列または構造に応じて異なる動作をします。最大6時間までの異なるインキュベーション時間をテストすることにより、インビトロ転写条件を最適化します。DNAテンプレート、T7 RNAポリメラーゼ、またはNTPの異なる濃度;またはT7 RNAポリメラーゼミックス中に存在するものに対する補足MgCl2の添加。</li>
	<li>インキュベーション期間の終わりに、20 μL反応あたりDNase Iの1 μLを加え、37°Cで15分間インキュベートする。 注:転写反応は、ポリアクリルアミドゲルの準備ができるまで、一時的に氷の上に保つことができます。</li>
	<li>ポリアクリルアミドゲルによる精製を進めます。 注:RNAはpHおよびRNase汚染に敏感であるため、RNA専用機器とRNaseフリー試薬を使用してください。</li>
	<li>目的のトランスクリプトのサイズに応じてゲルのポリアクリルアミドの割合を決定する: 100-2000 nt (XC: 460 nt;BB: 100 nt) 5% 80-500 nt (XC: 260 nt;BB: 65 nt) 60-400 nt (XC: 160 nt;BB: 45 nt), 12% 40-200 nt (XC: 70 nt ;BB: 20 nt), 15- 150 nt (XC: 60 nt;BB: 15 nt) および 20% 6-100 nt (XC: 45 nt;BB:12 nt)。</li>
	<li>50 mL円錐管に以下の試薬を組み合わせて尿素脱電性ポリアクリルアミドゲルを調製する:分子グレード尿素の9.6g、10x TBEの2mL、40%アクリルアミドのx mL:ビスアクリルアミドミックス(29:1)とチューブ上の20mLマークまでの水、x=20 mL/(40%/ゲルパーセンテージ%)。 注意:ポリアクリルアミドゲルは、多くの場合、環境に導入されたときに危険を引き起こす可能性のある有毒物質である非重合化アクリルアミドが含まれています。施設の化学廃棄物プログラムを通じてポリアクリルアミドゲルを処分する。</li>
	<li>30%の電力で15sのための電子レンジ。室温で10分間、または尿素が完全に溶解するまで、ヌタターの上に置きます。</li>
	<li>ゲル混合物が回転している間、ゲルカセット(18ウェル、厚さ1mm、13.3 x 8.7 cm(W x L))を取り出し、櫛を取り出し、ゲル鋳造用のカセットを配置します。</li>
	<li>50 mLチューブを50mLのチューブで素早く回転し、チューブの底部にゲル溶液を回収します。10%のペルサル酸アンモニウム溶液(APS)の125 μLを追加します。ナタターの上に約1分間、5sのクイックスピンをもう一度置きます。</li>
	<li>テトラメチレチレンジアミン(TEMED)の25 μLを追加し、気泡を避ける25 mLピペットで5回上下にピペッティングして慎重に混合します。</li>
	<li>パイペットをゲルキャストに入れ、気泡を避けてゲル櫛を慎重に挿入します。</li>
	<li>カセットの上に大きなバインダークリップを追加してシールを締めます。</li>
	<li>ゲルを1時間重合させる。</li>
	<li>ゲルが固まったら、バインダークリップを取り外します。カセットを電気泳動ボックスに挿入します。上部と下部のリザーバに 1x TBE バッファを追加します。</li>
	<li>転写反応を取得します。最大100 μLの水を加え、2倍ゲルローディングバッファの100 μLを追加します。推奨量を水と混合して、2倍ゲルローディングバッファの10 μLと10 μLを別の1.5 mLチューブに混ぜてラダーを準備します。</li>
	<li>サーモミキサー内のはしごとインビトロ転写反応の両方を70°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルが70°Cで脱育している間、慎重に櫛を取り除き、P1000ピペットで各井戸を上下にピペットでウェルをきれいにし、すぐに100Vで10分間事前に実行します。</li>
	<li>サンプルが70°Cで15分の脱退を完了したら、サーモミキサーからチューブを取り出し、すぐに氷の上に置きます。</li>
	<li>P1000ピペットでゲルの各井戸をもう一度きれいにします。最初のウェルに20 μLのラダーを左に、10個の別々のウェルにRNAサンプルの20 μL、未利用ウェルに1xゲルローディングバッファの20 μLをロードします。</li>
	<li>ゲルの%ポリアクリルアミドに応じて、60-240分間100Vでゲルを実行します。 注:ゲルローディングバッファ内の染料は、ゲルを横断する際に2つのバンドに分け、ブロモフェノールブルー(BB)ブルーバンドをゆっくりと移動し、シレンシアノール(XC)シアンバンドを高速に移動します。異なる%ポリアクリルアミドゲルにおけるこれらのバンドの近似移動はよく知られており(ステップ1.11参照)、ゲル中のRNAの移行を推定するために使用することができる。</li>
	<li>ゲルが止まったら、カセットから慎重に取り出します。</li>
	<li>50 μLの核酸ゲル染色を有する1x TBEバッファーの溶液を含むクリーンボックスにゲルを入れ、ロッカーに5分間インキュベートしてRNAを染色します。</li>
	<li>ゲルイメージングシステム上のゲルのバンド切除前後の画像を撮り、好ましくはUVトランスイルミネーションの代わりに青色光を用いる。</li>
	<li>ヌクレアーゼフリーの使い捨てジェル切断チップを使用して、関心のある各バンドを物品抜き。各ウェルの後、ゲルスライスを含む先端を1.5 mLチューブに移し、簡単に回転してゲルスライスを収集します。すべてのバンドが同じ1.5 mLチューブに集まるまで繰り返します。</li>
	<li>すべてのゲルスライスが収集されたら、1.5 mLチューブに100 μLのヌクレアーゼフリー水またはTEバッファーを追加します。4°C~48時間保存します。これにより、RNAはゲルスライスを溶液中に出します。</li>
	<li>48時間後、水またはTEバッファを新鮮な1.5 mLチューブにピプテします。残りのゲルスライスを廃棄します。クリーンアップキットを介してRNAを以下のように精製します。<ol>
<li>少なくとも30分間、室温でスピンカラムを平衡化します。</li>
		<li>ステップ1.32から新しい1.5 mLチューブ内のRNA溶液の100 μLに、RLTバッファーの350 μLを追加し、ヌタター上で2分間よく混ぜます。チューブの底部に溶液を収集するために200 x gで1sのためにスピンします。</li>
		<li>100%EtOHの675 μLを追加し、ナタター上で2分間よく混ぜます。200 x gで 1 s スピンし、すぐに次の手順に進みます。</li>
		<li>混合物の565 μLをスピンカラムに移し、15,000 x gで1分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。</li>
		<li>サンプルの後半で前の手順を繰り返します。</li>
		<li>500 μL の RPE バッファーをカラムに追加し、15,000 x gで 1 分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。</li>
		<li>カラムに80%エタノールの750 μLを加え、15,000 x gで1分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。</li>
		<li>新しい2 mLコレクションチューブにカラムを入れ、蓋を開けて15,000 x gで5分間回転させます。</li>
		<li>カラムを新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>カラムの中心に17 μLの水を加え、1分間15,000 x gで回転させます。別の17 μLの水を使用して再び溶出します。回収量の合計は 32 μL である必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>渦、ピペ、1.5 μLでよく混合し、マイクロボリューム分光光度計を使用してRNAの濃度を測定します。</li>
	<li>手順1.11-1.29のように尿素脱電ポリアクリルアミドゲルによるRNA精製の品質を確認してください。</li>
</ol>2. インビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイ
<ol><li>氷上の1.5 mLチューブに100 μL RNAメチルトランスフェラーゼアッセイをセットアップします: 23 μL の水, 10x TBS の 10 μL (500 mM トリス-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 2 μL の 0.05 M EDTA, 5 μL の 10M MT,50%グリセロールの40μL、58μM 3H-SAMの4μL、20倍プロテアーゼ阻害剤カクテルの5μL、RNaseOUTの1μL(オプション)、5μLのRNAおよび5 μLのメチルトランスフェラーゼ。 注意:放射性トリチド材料は危険であり、手袋、ラボコート、その他必要なPPEを着用している間のみ取り扱う必要があります。放射性物質と接触するすべてのピペットの先端および管は固体放射性廃棄物と見なされる。ラボの承認された放射性廃棄物プロトコルに従って、すべての固体および液体放射性廃棄物を処分する。 注:メチルトランスフェラーゼなしで、RNAなしでコントロールサンプルを含めます。試薬濃度は、MgCl2、またはラベルなしのSAMなどの二価陽イオン塩の最適化および/または包含を必要とする場合があります。最終的なRNA濃度の最適な範囲は50nMから1 μMであり、メチルトランスフェラーゼ濃度は25nMから300nMです。</li>
	<li>チューブをそっと渦にして十分に混ぜます。200 x gで5sをスピンし、チューブの底部に溶液を集えます。チューブを37°Cで2時間インキュベートします。</li>
	<li>ステップ 1.32 のようにカラム精製を使用して反応をクリーンアップします。 注意:特にカラム洗い(回収管から廃棄物を吸引する代わりにピペット)の間に、放射性物質を適切に処分するように非常に注意してください。</li>
	<li>液体シンチレーションカウントの実行<ol>
<li>サンプルごとに1つのバイアル、バックグラウンド測定用のバイアル、スワイプテスト用のバイアルを備えたシンチレーションカウントラックを設定します。シンチレーション計数溶液の5 mLでバイアルを充填します。</li>
		<li>1バイアルに各eleの放射性RNAサンプルの10 μLを追加し、蓋を締め、穏やかに混ぜます。</li>
		<li>スワイプ テスト バイアルを準備します。プロトコル中に使用されるすべての表面および装置に綿棒を徹底的にこする。5 mLのシンチレーション溶液で満たされたバイアルに綿棒を追加し、蓋を締めます。</li>
		<li>シンチレーション カウンタでサンプルを次のように実行します。カウンタフードを開き、ラックをマシンに挿入し、フードを閉じます。 [単一ラックをカウント] を選択します。[ユーザー プログラムの選択] を選択します。60 s. ヒットカウントラックのトリチウム (3 H) を測定するプログラムを選択または作成します。シンチレーションカウントを3回繰り返します。 注:装置は各サンプルのシンチレーション数を測定し、画面とプリントアウトの両方に出力します。必要に応じて、プロトコルはここで一時停止できます。ステップ2.3からの残りのRNAサンプルは、後で使用するために-80 °Cで凍結する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>オートラジオグラムに進む<ol>
<li>ステップ1.11-1.20のように、ポリアクリルアミドゲルを脱帰する尿素を準備し、前に実行します。</li>
		<li>2xゲルローディングバッファの20 μLを含む新しい1.5 mLチューブに放射性RNA材料のピペット20 μL。よく混ぜる。手順 1.21 のようにはしごを準備します。70°Cで15分間サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>サンプルロードの直前にもう一度ゲルの井戸を洗います。準備されたはしごの20 μL、サンプルの20 μL、残りのレーンに1xゲルローディングバッファの20 μLをロードします。ポリアクリルアミドのパーセンテージに応じて、60〜180分間100Vでゲルを実行します。</li>
		<li>ゲルが走り終わったら、カセットからゲルを取り出し、5μLの超高感度核酸ゲル染色で50mLの1x TBEバッファーを含む箱に入れます。</li>
		<li>ロッカーで5分間インキュベートしてRNAを染色します。</li>
		<li>慎重に箱からゲルを取り出し、ウェルを上にして左側のはしごでゲルイメージングシステムのUVトランシルミニエーターに置きます。</li>
		<li>カメラをゲルに集中させ、紫外線を点灯させ、信号強度に応じて50ミリ秒から1秒に露出してゲルの画像を撮ります。</li>
		<li>紫外線露光をオフにし、画像を Tiff ファイルとして保存します。</li>
		<li>ゲルを箱に戻します。TBE を削除します。50 mLの固定液(50%メタノール、10%酢酸、40%超純水)でゲルをロッカーの室温で30分間固定します。</li>
		<li>自己無線撮影強化溶液の25 mLを含む新鮮なブラックボックスに再びゲルを静かに移動します。ブラックボックスがない場合は、ボックスをアルミホイルで覆い、溶液を光から保護します。</li>
		<li>ロッカーの室温で30分間インキュベートします。</li>
		<li>ゲルをそっと持ち上げ、井戸を上にして右側のはしごを持ったプラスチックラップのシートの上に顔を下に置きます。ゲルの背面にクロマトグラフィー用紙を2枚置きます。スタック全体をゆっくりと反転します。</li>
		<li>ゲル乾燥機を80°Cに予熱します。ゲル乾燥機のプラスチックカバーを戻します。プラスチックカバーの下にラップ、ゲル、クロマトグラフィーの紙スタックを挿入し、プラスチックカバーを下に戻してシールを作成します。</li>
		<li>ゲル乾燥機で80°Cで1時間乾燥させます。</li>
		<li>ゲル乾燥機の電源を切り、スタックを静かに取り外します。ラップと2枚目のクロマトグラフィー用紙を取り外します。オートラジオグラムカセット中の乾燥ゲルを用いたテープ残留クロマトグラフィー紙。</li>
		<li>暗い部屋に自動無線フィルムの1枚を追加します。</li>
		<li>カセットを-80 °Cに置き、以前に測定されたシンチレーションカウントに基づいて判断できる信号強度に応じて1時間から4週間後にフィルムを開発する:250-1,000 cpmの場合は1~4週間、1,000~10,000cpmの場合は24~1週間、>1000000000h.000hは1時間から24時間M。</li>
		<li>フィルムが開発されたら、カセットの上にフィルムを置き、慎重にラボマーカーでゲルの4つのエッジ、各ウェル、およびXCとBB染料の位置をマークします。</li>
		<li>フィルムを 1 インチあたり 300 ピクセルまたは 600 ピクセルの解像度でスキャンし、画像を Tiff ファイルとして保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

ここで、特定の転写物に向けたRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー(図1)でトリチレートできるという事実を利用して、メチル化RNAを抗体を使用せずに正確に検出することができます。しかし、このアッセイは、どの残基または化学基が酵素によってメチル化されるかを示すことができないことに注意することが重要です。特定の残基がメチル化されていることを特定または検証するために、変異解析、逆転転写ブロックまたはRNA基質の質量分析分析などの他の方法を、RNAメチルトランスフェラーゼアッセイと組み合わせて使用することができる。
RNAの選択とその合成モードは、RNAのサイズによって異なります。18と120 ntの間のサイズの特定のRNAは、多くの評判の高い核酸プロバイダーから便利にカスタム合成することができます。しかし、最も一般的には、様々なサイズの特定のRNAはインビトロ転写される。インビトロ転写のためのDNAテンプレートは、様々...

DNA、RNAおよびタンパク質は、遺伝子発現1を厳密に調節する修飾の対象となる。これらの修飾の中で、メチル化は3つの生体高分子すべてに起こる。DNAとタンパク質のメチル化は、過去30年間に非常によく研究されています。対照的に、RNAメチル化への関心は、RNAメチル化を書き込み、消去、または結合するタンパク質が発達および疾患2において果たす重要な役割に照らして、最近再燃したばかりである。豊富なリボソームおよび転写RNAにおけるよりよく知られた機能に加えて、RNAメチル化経路は、特異的メッセンジャーRNA安定性3、4、スプライシング5および翻訳6、7を調節する。miRNA処理8、9および転写休止および放出10、11.
ここで、分子生物学研究室の設定におけるRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている(図1に要約)。多くの研究は、目的のRNA修飾に対する抗体を有するドットブロットを介してRNAメチルトランスフェラーゼの活性を評価する。しかしながら、ドットブロットは、RNAメチルトランスフェラーゼとのインキュベーション時にRNAの完全性を検証しない。ヌクレアーゼを用いた組換えタンパク質のわずかな汚染でさえ、部分的なRNA分解と交絡の結果につながる可能性があるため、これは重要です。さらに、非常に特異的なRNA修飾抗体でさえ、特定の配列または構造を持つ未修飾RNAを認識することができます。ここで報告されるインビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー上でトリチレートできるという事実を利用し(図1)、メチル化されたRNAを抗体を使用せずに正確に検出できるようにする.インビトロ転写および目的の酵素による前記転写のメチル化の試験の転写および精製のための指示が提供される。この方法は柔軟で堅牢であり、特定のプロジェクトのニーズに応じて調整できます。例えば、インビトロ転写および精製RNA、化学的に合成されたRNA、ならびに細胞RNAを用いることができる。このアッセイは、シンチレーションカウントの形で定量的な情報を提供するだけでなく、メチル化されたRNAがゲル上で正確に実行される場所を示すことによって定性的情報を提供します。これは、特に細胞RNAを基板として使用する場合に、メチル化の標的となるRNAまたはRNAのサイズを直接観察する方法を提供するため、RNAメチルトランスフェラーゼの機能に関するユニークな洞察を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 bp DNA ラダーキット。</td></tr><tr><td>10%過硫酸アンモニウム(APS)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>尿素変性ポリアクリルアミドゲルの場合(10 mLの場合、1 gを8 mLのmilliQ水に溶解し、容量を10 mLに調整し、0.45 &micro;m フィルター)。</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>尿素変性ポリアクリルアミドゲル用(1Lの場合、108 gのトリスベース、55 gのホウ酸を攪拌子付きのシリンダーに加え、800 mLの蒸留水を加えて溶解させ、40mLの0.5 M Na2EDTA(pH 8.0)を加え、milliQ水で容量を1Lに調整し、0.22&microを使用して溶液をろ過します。m フィルター)。</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1Lの場合、攪拌子付きのシリンダーに60.5 gのTris Base、87.6 gのNaClを加えます。800 mLの蒸留水を加えて溶解させます。濃縮HClでpHを7.5に調整します。milliQ水で容量を1Lに調整します。0.22 & microを使用して溶液をろ過します。mフィルター。&nbsp;</td></tr><tr><td>アクリルアミド:ビスアクリルアミド29:1(40%溶液/電気泳動)、フィッシャーバイオ試薬</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1408-1</td><td>尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。</td></tr><tr><td>アデノシル-L-メチオニン、S-[メチル-3H];(サム[3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>RNAのin vitroメチル化用。濃度 = 1.0 mCi/mL;比活性= 17.1 Ci / mmol;モル濃度= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &micro;M.&nbsp;&nbsp;凍結した3H-SAMチューブを受け取ったら、4°Cで解凍します。C、20 &micro を作ります。アリコートをLし、-30°Cで凍結します。部分的に使用したアリコートを再凍結して再利用しないでください。</td></tr><tr><td>アマシャム ハイパーカセット オートラジオグラフィー カセット</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN11649</td><td>オートラジオグラム ゲル曝露用。</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>オートラジオグラムゲル曝露用。</td></tr><tr><td>ベックマンシンチレーションカウンター</td><td>ベックマン</td><td>LS6500</td><td>液体シンチレーションカウント用。</td></tr><tr><td>Biorad Mini 水平電気泳動システム</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini 水平電気泳動システム。</td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>20倍溶液の場合、1錠を0.525mLのヌクレアーゼフリー水に溶解します。</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>ポリアクリルアミドゲル用のRNaseフリー空カセット。</td></tr><tr><td>Criterion empty Cassettes</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>縦型ミディフォーマット電気泳動セル。</td></tr><tr><td>DeNovix DS-11 マイクロボリューム分光光度計</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>DNAおよびRNA濃度を測定するためのマイクロボリューム分光光度計。</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>液体シンチレーションカウント用。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 7mL HDPE シンチレーションバイアル</td><td>フィッシャー</td><td>03-337-1</td><td>液体シンチレーションカウント用。</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>オートラジオグラムゲルの前処理用。</td></tr><tr><td>ゲルドライヤー</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>ゲルの乾燥用。</td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファーII</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>変性ポリアクリルアミド尿素ゲル(組成:95%ホルムアミド、18mM EDTA、0.025%SDS、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー)にRNAをローディングします。</td></tr><tr><td>GeneCatcher使い捨てゲル切除のヒント</td><td>ゲル会社</td><td>NC9431993</td><td>アガロースおよびポリアクリルアミドゲルからバンドを除去するため。</td></tr><tr><td>Megascript Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写用&nbsp;</td></tr><tr><td>パーフェクトウェスタン エクストララージコンテナ</td><td>ゲンハンターコーポレーション</td><td>NC9226382(クリア)/NC9965364(ブラック)</td><td>ジェル染色ボックスです。</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>均質末端を持つin vitro転写産物を産生するためのプラスミド</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNAクリーンアップには、プロトコルで提供されている修正されたプロトコルを使用してください。</td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>in vitro転写に使用されるdsDNA断片のゲル抽出とクリーンアップのためのキットです。</td></tr><tr><td>サランプレミアムプラスチックラップ</td><td>サランラップ</td><td>アマゾン</td><td>乾燥ジェル用。</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>超高感度核酸ゲル染色剤。</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>核酸ゲル染色剤。</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl、1 mM 二ナトリウム EDTA、pH 8.0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。</td></tr><tr><td>SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES付きサーモミキサー</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>1.5mLチューブの温度制御インキュベーション用。</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Tackポリメラーゼの高速クローニング用キット。PCR産物を増幅して、in vitro RNA転写用のT7および/またはSP6プロモーターを含むベクターにします。</td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U&frasl;&マイクロ;L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>in vitro転写反応からのDNA除去用。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ</td><td>51456-500G</td><td>尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。</td></tr><tr><td>Whatman 3MMペーパー</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>ゲル乾燥用クロマトグラフィーペーパー。</td></tr></tbody></table>

rnaメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

RNAには100以上の化学的に異なる修飾があり、そのうちの3分の2はメチル化からなる。RNA修飾、特にメチル化への関心は、疾患や癌に関連する生物学的プロセスでそれらを書き、消去する酵素が果たしている重要な役割のために再浮上しました。ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のRNAメチル化ライタ活性の正確な分析のためのインビトロアッセイに敏感なアッセイが提供される。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンのトリチレートされた形態を使用し、トリチウムを用いてメチル化RNAを直接標識する。トリチウム放射線の低エネルギーは、この方法を安全にし、トリチウム信号増幅の既存の方法により、一般的に人工物になりやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化および可視化することを可能にします。この方法はRNAメチル化のために書かれていますが、14CアセチルコエンザイムA.を用いたRNAアセチル化など、放射性標識が可能な他のRNA修飾の研究に適用可能な調整はほとんどありません。メチル化条件、低分子阻害剤による阻害、またはRNAまたは酵素変異体の効果、および細胞で得られた結果を検証し、拡大するための強力なツールを提供する。

インビトロ転写反応 図 2Aは、比較的短い(331 nt)および高度に構造化されたRNAである7SK snRNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的な実行を表す。その生の画像に示すように、7SKより短く、長い両方の複数の望ましくないバンドがあり、おそらくランダム転写開始または終了イベントから生じる。このため、インビトロ転写反応に続くゲル精製は、図2Bに示すようにクリーンなRNA試料を得ることが重要である。この時点で、目的のRNAは、はしごに対するその位置によって識別され、ゲル精製によって精製することができる。
前述したように、ゲル精製工程の前に転写反応の長さを最適化する必要がある場合がある。あまりにも長く実行される転写反応は、非常に大量のRNA産生をもたらし、正しい転写物の下流の同定を困難にする。また、特定のプライマーを使用して、逆転...

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

RNAには100以上の明確な改変があり、その3分の2はメチル化です。このプロトコルはRNAメチル化ライター活性の敏感で正確な分析のための方法を提供する。この使いやすい技術により、一般的に人工物を起こしやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化し、視覚化することができます。手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるサマンサ・シェルトンです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、氷上の1.5ミリリットルチューブに100マイクロリットルRNAメチルトランスビ転移酵素アッセイを設定します。チューブを完全に混合し、遠心分離機を200回gで5秒間ボルテックスし、チューブ下部の溶液を回収する。2時間摂氏37度でチューブをインキュベートします。次に、テキストプロトコルで概説されているように、カラム精製を用いて反応を浄化する。液体シンチレーションカウントを実行するには、サンプルごとに1つのバイアル、バックグラウンド測定用のバイアル、スワイプテスト用のバイアル1個でシンチレーションカウントラックを設定します。5ミリリットルのシンチレーションカウント溶液でバイアルを充填します。溶出した放射性RNAサンプル10マイクロリットルを1つのバイアルに加えます。蓋を締め、やさしく混ぜます。スワイプテストバイアルを準備するには、手順中に使用されるすべての表面と機器に綿棒を徹底的にこすります。これらの綿棒をシンチレーション溶液で満たしたバイアルに加え、蓋を締めます。シンチレーションカウンターでサンプルを実行するには、カウンターフードを開き、ラックを機械に挿入し、フードを閉じます。[単一ラックをカウント] を選択します。[ユーザー プログラムの選択] を選択します。60 秒間トリチウムを測定するプログラムを選択または作成し、カウント ラックをヒットします。シンチレーションカウントを3回繰り返します。この後、テキストプロトコルで概説されているように、尿素変性ポリアクリルアミドゲルを調製し、再実行する。20マイクロリットルの20マイクロリットルの2Xゲルローディングバッファーを含む新しい1.5ミリリットルチューブに放射性RNA材料の20マイクロリットルを移します。ラダーを準備した後、15分間摂氏70度でサンプルをインキュベートします。ゲルタンクからゲルのウェルにバッファーをピペット処理して、サンプルローディングの直前にゲルのウェルをもう一度洗います。次いで、調製されたラダーの20マイクロリットル、サンプルの20マイクロリットル、および20マイクロリットルの1Xゲルローディングバッファーをゲルのレーンにロードする。ポリアクリルアミドの割合に応じて、ゲルを100ボルトで60〜180分間実行します。ゲルの実行が完了したら、カセットからゲルを取り出し、5マ

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し...

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

N 6 -methyladenosine（メートル6 A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。...

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これらのプロトコルは、細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスファーゼ(PRMT)ファミリーの個々のメンバーの酵素活性を評価するために使用される方法論を提供する。内因性および外因性バイオマーカー、メチルアルギニン認識抗体、および阻害剤ツール化合物を用いたPRMT活性評価に関する詳細なガイドラインが記載されている。...

タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

ウイルス感染におけるRNA修飾の役割は、検討され始めたばかりで、新しいウイルス宿主相互作用メカニズムを強調する可能性がある。本研究では、ウイルス感染の文脈におけるm6Aおよびm5C...

ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。...

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

学ぶRNAメチルトランスフェラーゼ活性分析の抗体フリーアッセイ。トリチウム標識S-アデノシルメチオニンを用いて、in vitroでRNAメチル化を定量的・定性的に評価する方法です。抗体アーティファクトを回避し、酵素活性や変異体の影響を正確に測定できます。

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

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