Justering nedbrydning for at opnå specifik og effektiv protein udtømning

En almindelig teknik til at finde ud af et protein funktion er at slette det og se hvad der sker. Men du kan ikke gøre det med et vigtigt protein. Det er vigtigt, at cellen dør.

Så du har brug for en måde at fjerne det protein og få et glimt af, hvad der sker lige før celledød. Protein udtynding bør være hurtig, så du får ingen sekundære virkninger. Det bør være specifikke, således at kun, at protein fjernes og kun forarmet, når du ønsker det skal være.

Og det bør ikke påvirke cellen på anden måde end at fjerne dette protein. Efter forberedelse af stammen, bruge en overnight kultur til at bestemme, hvad fortynding er nødvendig. Brug disse oplysninger til at oprette en tilstrækkelig ny kultur med en OD600 mellem 0,1 og 0,2, og dyrk den ved 30 grader Celsius.

I en røghætte tilsættes en methanol svarende til 30 til 50% af det tilsigtede prøvevolumen til et 15-milliliterrør. Luk rørene stramt, mærke dem, og læg dem på tøris til chill. Dernæst mærkes 1,5 milliliterrør til langtidsopbevaring af prøverne og anbringes på isen for at køle af.

Mindst en milliliter vand afkøles pr. prøve på is. Når målet optisk tæthed for starten af præ-inkubationen er nået, overføres en prøve til det præfabrikationige rør indeholdende kold methanol. Inverter røret kortvarigt og læg det tilbage på tøris.

Dette er den ikke-inducerede kontrolprøve. Umiddelbart tilsættes beta-estradiol sådan, at den endelige koncentration er 10-mikromolar. Swirl kraftigt at blande.

Fortsæt med at dyrke kulturen som før, inkubering med beta-estradiol for den optimale tid som skitseret i tekstprotokollen. Beta-estradiol inkubationstiden er det vigtigste skridt, og skal optimeres til hvert protein. For kort og udtyndingen er ufuldstændig og langsom.

For længe og proteinniveauet vil falde, selv før du har tilføjet auxin. Pipette op 0,5 mikroliter af IAS pr milliliter af kultur til at tilføje senere. Der indsamles en prøve fra den ikke-beskrevne kultur som tidligere beskrevet.

Straks tilføje IAA til en endelig koncentration på 750-mikromolar og hvirvle kraftigt til at blande. Start en timer så hurtigt som muligt efter blanding. Indsamle prøver i henhold til det eksperimentelle design.

Læg derefter prøverne på is. Sørg for, at ingen af prøverne er frosset. Hvis nogen har, forsigtigt varme dem i hånden, mens konstant invertere.

Når alle prøverne er indsamlet og ikke frosset, centrifuge dem ved 3, 500 gange G og fire grader Celsius i to minutter. Hæld methanol og medium mix og læg prøverne tilbage på is. Derefter resuspenderet celle pellet i en-milliliter vand og overføre denne suspension til en mærket rør på is.

Centrifuge kort med en hastighed over 15,000 gange G for at gense cellerne. Derefter skal rørene anbringes tilbage på isen og aspirere væsken. I denne undersøgelse er nedbrydning indstillet til at opnå specifik og effektiv proteinudtynding uden på anden måde at påvirke gærcellens metabolisme.

De lav-overflod spliceosomal Prp2 og Prp22 proteiner er begge forarmet til mindre end 20% efter 20 minutters præ-inkubation med beta-estradiol, efterfulgt af 15 minutter med auxin. Længere præ-inkubation gange føre til hurtigere udtynding, men også vise uønsket protein udtynding før auxin tilsætning. Til sammenligning er den mere rigelige Dcp1 kun forarmet til ca. 30% med samme behandling.

Men, 60 minutter af præ-inkubationstid resulterer i udtynding til 13% med den samme auxin behandling på bekostning af udtømning før auxin tilsættes. Optimer førinkubationstiden, og tab ikke tidsovervejelse mellem dine tidspunkter. Hvad du skal gøre næste afhænger af dit spørgsmål.

Vi har konstateret, at 10-mils prøve af kultur er nok til protein, DNA, eller RNA analyse. Prøveudtagningsproceduren er også let at tilpasse til ChIP. Nu er der en hurtig og specifik måde at nedbryder proteiner.

Så funktionen selv af væsentlige proteiner kan findes. Protokollen er ret sikker. Methanol er det eneste farlige kemikalie.

Vær forsigtig, mens du dispenserer den. Gør det i en røghætte, og bære to par handsker, som methanol kan komme igennem de fleste nitril handsker.