Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا
Chapters
Summary October 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا لفحص مثبطات كيناز.
Transcript
NAPPA هو منصة قوية البروتين microarray التي يمكن استخدامها لدراسة نشاط البروتين وظيفة بطريقة غير متحيزة عالية الإنتاجية. يتم إنتاج البروتينات المعروضة على NAPPA في نظام تعبير يستند إلى الإنسان باستخدام الريبوسومات المشتقة من الإنسان و المرافقين من أجل تحسين احتمال الطي الطبيعي والنشاط. إن استخدام صفائف NAPPA لفحص مثبطات كيناز يوفر منصة جديدة لاختبار الأدوية الجديدة وطفرات كيناز ذات الصلة سريرياً.
يمكن استخدام ميكرورايز البروتين المتولد عن منهجية NAPPA للعديد من التطبيقات المتميزة ، بما في ذلك اكتشاف العلامات الحيوية ، والتفاعلات البروتينية والبروتينية ، وتحديد الركيزة ، وفحص الأدوية. تنفيذ خطوات مراقبة الجودة على طول الطريق. اختبر جودة إعداد الحمض النووي الخاص بك، وmicroarray الحمض النووي، وميكرة البروتين.
إذا في أي خطوة الجودة ليست جيدة، مجرد البدء من جديد. إثبات الإجراء سيكون ليزا ميلر، فني في مختبري. لإعداد النمو البكتيري في المنزل عالية الإنتاجية الإعدادية المصغرة، أولا تلقيح البكتيريا في لوحة أوجر في شكل 96 جيدا، والسماح لها تنمو لمدة 16 ساعة.
في اليوم التالي، تعبئة كل بئر من لوحة بئر عميق مع 1.5 ملليلتر من مرق متوسطة رائع، تستكمل مع أمبيسيلين مضاد. يعتمد الجسم المضاد على علامة التحديد على البلازميد. ثم تعقيم جهاز 96 دبوس مع 80٪ الإيثانول واللهب.
استخدام جهاز 96 دبوس العقيمة لاختيار المستعمرات من لوحة أجار المحتضنة بين عشية وضحاها وغمرها في آبار لوحة البئر العميق لتطعيم الثقافة. غطي الكتلة بختم قابل للنفاذ للغاز وحضن على شاكر لمدة 22 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، ومن 300 إلى 800 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، بيليه الثقافات وإعادة تعليق الثقافات وفقا للمخطوطة.
البكتيريا الLyse عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من محلول اثنين في كل بئر، وختم لوحة مع ختم الألومنيوم، وعكس خمس مرات. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق بالضبط. لتحييد الحل، إضافة 200 ميكرولترات من الحل ثلاثة، وختم لوحة مع ختم الألومنيوم، وعكس خمس مرات.
ثم، تدور لوحة في 3800 G، أربع درجات مئوية، لمدة 30 دقيقة لمسح lysate supernatant. لإعداد لوحات راتنج تبادل أنيون، أولا، مزيج الطين تبادل anion، وصب الطين في حوض زجاجي. كومة مرشح لوحات على رأس لوحة بئر عميقة لتكون بمثابة وعاء جمع النفايات.
ثم، وذلك باستخدام لوحة واسعة نصائح P1000، مزيج الطين، ونقل 450 ميكرولترات من الطين في كل بئر من لوحات التصفية. الطرد المركزي والتخلص من تدفق من خلال. الآن، نقل suate supernatants إلى كومة من لوحة الراتنج وكتلة بئر عميق.
تدور لوحات مكدسة لمدة خمس دقائق في 30 مرة G مع أبطأ زيادة سرعة وإهمال تدفق من خلال. لغسل العمود، إضافة 400 ميكرولترات من محلول N3 غسل العازلة إلى كل بئر. نقل لوحة الراتنج إلى فراغ متعددة لإزالة العازلة غسل.
كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات ثم قم بإزالة أي عازل غسالة متبقية مع دوران لمدة خمس دقائق قصيرة في 30 مرة G.To الزفير من الحمض النووي ، ضع لوحة الراتنج على لوحة جمع 800 ميكرولتر نظيفة. إضافة 300 ميكرولترات من الحل N5 لكل بئر والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. ثم، تدور لوحات مكدسة لمدة خمس دقائق في 20 مرات G مع زيادة بطيئة تصل السرعة إلى 233 مرة G لمدة دقيقة واحدة.
لوحات تخزين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية قبل الاستخدام. أولاً، ضع الشرائح على رف وتغمر الشرائح في خزان زجاجي يحتوي على محلول طلاء مُكَوّن 2٪ من مُكَوّنَ الأمينوزيلين في الأسيتون. صخرة الشرائح لمدة 15 دقيقة.
ثم شطف الشرائح في الأسيتون تليها شطف النهائي في الماء. بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح باستخدام الهواء المُضغط. تهب عليها من جميع الزوايا لمدة ثلاث دقائق تقريبا حتى يتم إزالة جميع قطرات الماء.
خزّن الشرائح المغلفة في درجة حرارة الغرفة على رف معدني داخل صندوق مغلق بإحكام. الآن، المضي قدما لتسريع الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة. ثم، resuspend بيليه الحمض النووي في 20 ميكرولترات من الماء فائقة الخطورة ويهز في 1000 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
لإعداد عينة الصفيف، إضافة 10 ميكرولترات من مزيج الطباعة الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة، crosslinker، وبوليسليسين لكل عينة الحمض النووي. لوحات ختم مع رقائق الألومنيوم ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. تخزين لوحات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في يوم الطباعة، دوامة لفترة وجيزة وتدور لوحات. نقل 28 ميكرولترات من كل عينة إلى لوحة 384 جيدا. ضع الشرائح المغلفة أمينوسيلين ولوحة 384 جيدا، على سطح السفينة المصفّح، وبدء برنامج الطباعة microarray.
عند الانتهاء من الطباعة، تسمية microarrays. يمكن تخزين microarrays لعدة أشهر حتى استخدام مزيد من. لقياس مستويات الحمض النووي، ضع الشرائح في صندوق ماصة وحجبها بـ 50 ملليلتر من عازلة الحجب.
احتضان الشرائح على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم، والتخلص من الحل وإضافة 20 ملليلتر من العازلة منع و 33 ميكرولترات من الحمض النووي الفلورية صبغة intercalating. احتضان لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات.
بعد الحضانة هو أكثر، شطف الشرائح بسرعة مع المياه النقية جدا وجافة مع الضغط على الهواء. الـ(ميكروراي) جاهزون للمسح الضوئي للتعبير عن microarrays، ومنع الشرائح كما هو مبين سابقا ومن ثم شطف لهم بالماء النقي جدا، وجافة مع الهواء المضغوط المصفاة.
إرفاق طوقا ختم إلى كل شريحة. إضافة 130 ملليلتر من النسخ في المختبر ومزيج الترجمة على الشرائح، وتدليك بلطف الأختام الختم بحيث النسخ في المختبر ومزيج الترجمة ينتشر بها ويغطي المنطقة بأكملها من مجموعة دون أي فقاعات. تطبيق الأختام منفذ دائرية صغيرة على كلا المنفذين.
احتضان لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية للتعبير البروتين، تليها 30 دقيقة في 15 درجة مئوية لشل البروتين الاستعلام. ثم، وإزالة طوقا، وغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل في 15 ملليلتر TBST مع الحليب، وكتلة في نفس الحل لمدة ساعة واحدة. للكشف عن البروتينات على مجموعة، وإزالة TBST مع الحليب، ووضع الشرائح على لوحة الشبكة، وتطبيق 600 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية، الماوس المضادة العلم، المخفف من واحد إلى مائتين، و 1X TBST تكملها 5٪ الحليب.
احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. غسل الشرائح مع 50 ملليلتر من 1X تفت و 5٪ الحليب على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. كرر الإجراء الخاص بالجسم المضاد الثانوي.
بعد الحضانة ساعة واحدة هو أكثر، وغسل الشرائح مع 1X TBST على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. ثم شطف الشرائح بسرعة مع الماء النقي جدا، وجافة باستخدام الهواء الضغط. الشرائح جاهزة للمسح الضوئي.
لإجراء معالجة الفوشطات و DNase، قم بغسل ومنع الشرائح المعبّر عنها مع TBST المُكمّلة بنسبة 3٪ BSA كما هو موضح في المخطوطة. ثم، ضع الشرائح على لوحة الشبكة وتطبيق 200 ميكرولترات من محلول phosphatase DNase. ضع غطاء microarray على القمة لتجنب التبخر.
احتضان في 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة و 30 دقيقة في الفرن. ثم، غسل الشرائح مع 1X تST و 0.2 كلوريد الصوديوم الضرس على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. لأداء العلاج من المخدرات والتفاعل كيناز، وضع الشرائح على لوحة الشبكة وتطبيق 200 ميكرولتررس من محلول كيناز المخدرات.
ضع زلة غطاء على القمة لتجنب التبخر. احتضان لمدة ساعة واحدة في 30 درجة مئوية في الفرن. المفتاح إلى بيانات قابلة لإعادة إنتاج هو وقت الحضانة متسقة عبر الشرائح.
هذا مهم بشكل خاص خلال رد فعل كيناز. يجب حساب الوقت المطلوب لمعالجة كل شريحة. بعد ذلك، غسل الشرائح مع 1X ت السلست و 0.2 كلوريد الصوديوم الضرس على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من.
تكرار الكشف عن البروتين باستخدام الأجسام المضادة الأولية فوسفيتيروسين الأجسام المضادة المخففة واحد إلى 100 في TBST، تستكمل مع 3٪ الألبومين المصل البقري. استخدام 1x TBST و 3٪ البوم مصل الأبقار لغسل بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وTBST لغسل بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية. غسل وتجفيف كما كان سابقا.
للحصول على الصورة، قم بتحميل microarrays في مجلة حامل الشريحة. قم بتحميل المجلة في الماسح الضوئي الصغير. مسح جميع microarrays مع الإعدادات الأمثل وتذكر لتحويل مكاسب السيارات قبالة عند مقارنة الصور عبر التجارب.
نقل الصور إلى برنامج القياس الكمي، ومحاذاة الشبكة مع البقع، وقياس كثافة الإشارة لكل ميزة على microarray. المضي قدما في التحليل الإحصائي. في هذه الدراسة، أظهرت microarray غالبية البقع التي تحتوي على الحمض النووي التكميلي عرض بنجاح مستويات يمكن الكشف عنها من البروتين.
وأظهرت ناوبا كيناسي microarrays استنساخ جيدة بين الشرائح، مع ارتباط مستويات عرض البروتين بين دفعات الطباعة متميزة أعلى من 0.88. وأظهرت النتائج التمثيلية لنشاط كيناز في صفائف كيناز NAPPA مستويات عالية من فوسفوريل البروتين بعد التعبير. المقارنة بين microarrays التي تم قياس مستويات الفوسفوريل مباشرة بعد العلاج الفسحاتية، وبعد 60 دقيقة من رد فعل الفوسفور، يشير إلى وجود كينازات البروتين النشطة على مجموعة.
على صفائف كيناز NAPPA، أظهرت imatinib انخفاضا كبيرا في النشاط ABL1 وBCR-ABL1، في حين أن كينازات أخرى ظلت في معظمها لم تتأثر. نشاط كيناز تطبيع ضد مجموعة dephosphorylated ويمثل كنسبة مئوية من microarray التحكم الإيجابي أظهرت تثبيط انتقائي من imatinib نحو ABL1 وBCR-ABL1. أظهرت النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها لفحص ibrutinib أن نشاط كيناز من Kinase ABL1 غير ذي الصلة لا يتأثر.
BTK الكنسي الهدف، وERBB4 الهدف الجديد المحتمل، وأظهرت انخفاض النشاط في وجود ibrutinib. وتشير البيانات إلى أن ERBB4 يمكن أن تمنعه ibrutinib بطريقة خاصة بالجرعة. يعتمد نجاح فحوصات البروتين الجزئي إلى حد كبير على جودة microarray نفسها.
يجب استخدام العديد من ميزات التحكم الإيجابية والسلبية للسماح بتحليل البيانات بشكل صحيح. اختبار NAPPA kinase هو منصة فحص ، وعلى هذا النحو ، يجب التحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها في عمليات الفحص المتابعة ، والتي قد تشمل في المختبر كيناز المقايس ، أو مقايسات الخلايا القائمة. منذ بروتوكول لدينا يبدأ مع cDNA، أي طفرة كيناز أو الاختلاف يمكن دمجها بسهولة في microarray ودرس في الإنتاجية العالية.
خلال إعداد الطين وألواح الراتنج تبادل أنيون، فمن المستحسن استخدام الأقنعة لمنع استنشاق ممكن من جزيئات الراتنج.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
