Login processing...

Journal / Biochemistry /

JoVE Journal
Biochemistry

This content is Open Access.

JoVE Journal Biochemistry

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Journal (Biochemistry)

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Journal (Biochemistry)

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Click here for the English version

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

Article DOI: 10.3791/59886-v • 13:22 min

October 23rd, 2019 •

Fernanda Festa^1,2, Joshua Labaer¹

¹Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, ²Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 23rd, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Der fremlægges en detaljeret protokol for generering af selv monterede humane protein-mikrosystemer til screening af kinasehæmmere.

Transcript

NAPPA er en kraftfuld protein microarray platform, der kan bruges til undersøgelse af protein aktivitet og funktion i en upartisk høj gennemløb måde. De proteiner, der vises på NAPPA, fremstilles i et menneskeligt baseret ekspressionssystem ved hjælp af humane ribosomer og chaperoner for at forbedre sandsynligheden for naturlig foldning og aktivitet. Brugen af NAPPA-systemer til screening af kinasehæmmere udgør en ny platform for test af nye lægemidler og klinisk relevante kinasemutationer.

Protein microarrays genereret af NAPPA metode kan bruges til mange forskellige anvendelser, herunder biomarkør opdagelse, protein-protein interaktioner, substrat identifikation, og narkotika screening. Udfør kvalitetskontroltrin undervejs. Test kvaliteten af dit DNA-præparat, DNA-mikroarray og proteinmikroarray.

Hvis kvaliteten ikke er god, så begynd forfra. At demonstrere proceduren vil være Lisa Miller, en tekniker i mit laboratorium. For at forberede bakterievækst til i huset høj gennemløb mini-prep, først vaccinere bakterierne i sneglen plade i en 96 godt format, og lad det vokse i 16 timer.

Den næste dag, fylde hver brønd af den dybe godt plade med 1,5 milliliter af fantastisk bouillon medium, suppleret med antistof ampicillin. Antistoffet afhænger af markeringsmarkøren på plasmid. Derefter sterilisere en 96-pin enhed med 80% ethanol og flamme.

Brug den sterile 96-pin enhed til at plukke kolonier fra natten inkuberede agar plade og nedsænkes i brøndene i den dybe godt plade til at vaccinere kulturen. Dæk blokken med en gas-gennemtrængelig forsegling og inkubere på en shaker i 22 til 24 timer ved 37 grader Celsius, og 300 til 800 rpm. Derefter opsuserede pelletkulturer og resuspenderede kulturerne i henhold til manuskriptet.

Lyse bakterier ved at tilføje 200 mikroliter opløsning to i hver brønd, forsegle pladen med en aluminiumstætning, og invertere fem gange. Inkuber cellerne i præcis fem minutter. For at neutralisere opløsningen tilsættes 200 mikroliter opløsning tre, forsegle pladen med en aluminiumstætning og invertere fem gange.

Drej derefter pladen ved 3800 G, fire grader Celsius, i 30 minutter for at rydde lysatet supernatant. For at forberede anionbytter harpiks plader, først, bland anionbytter gylle, og hæld gyllen i et glas trug. Stak filterplader oven på en dyb brøndplade til at fungere som en affaldsindsamlingsbeholder.

Derefter, ved hjælp af brede bord P1000 tips, bland gyllen, og overføre 450 mikroliter af gyllen i hver brønd af filterpladerne. centrifuge og kassere flow-through. Nu overføre lysate supernatants til stakken af harpiks plade og dyb brønd blok.

Drej de stablede plader i fem minutter ved 30 gange G med langsomste rampe op hastighed og kassér flow-through. For at vaske kolonnen skal der tilsættes 400 mikroliter opløsning N3-vaskebuffer til hver brønd. Overfør harpikspladen til vakuummanifold for at fjerne vaskebufferen.

Gentag vasketrinnet tre gange, og fjern derefter eventuel resterende skivebuffer med et kort fem minutters spin ved 30 gange G.To eluterer DNA'et, placer harpikspladen på en ren 800 mikroliteropsamlingsplade. Tilsæt 300 mikroliter af opløsning N5 til hver brønd og lad den sidde ved stuetemperatur i ti minutter. Drej derefter de stablede plader i fem minutter ved 20 gange G med langsom rampe ophastighed til 233 gange G i et minut.

Opbevar pladerne ved negative 20 grader Celsius før brug. Først skal du placere dias på en rack og nedsænkes i dias i glas reservoir indeholder belægningen opløsning af 2% aminosmilane reagens i acetone. Rock diasene i 15 minutter.

Skyl derefter rutsjebanerne i acetone efterfulgt af en sidste skylning i vand. Tør derefter rutsjebanerne ved hjælp af trykluft. Blæser på dem fra alle vinkler i ca. tre minutter, indtil alle vanddråber er blevet fjernet.

Opbevar de coatede objektglas ved stuetemperatur på en metalstativ i en tætlukket kasse. Fortsæt nu med at udfælde DNA'et som beskrevet i manuskriptet. Derefter resuspendere DNA-pellet i 20 mikroliter ultrapure vand og ryst ved 1000 rpm i to timer.

For at forberede array prøve, tilføje 10 mikroliter af frisklavet trykblanding, som indeholder antistof, crosslinker, og polylysin til hver DNA-prøve. Tætningsplader med aluminiumsfolie og ryst ved stuetemperatur i 90 minutter ved 1000 omdrejninger i minuttet. Opbevar pladerne natten over ved fire grader Celsius.

På trykningsdagen, kort vortex og drej pladerne. Overfør 28 mikroliter af hver prøve til en 384 brøndplade. Placer aminosilane belagt dias og 384 godt plade, på arrayer dæk, og start microarray udskrivning program.

Når udskrivningen er færdig, skal du mærke mikroarrays. Mikroarrays kan opbevares i flere måneder indtil videre brug. For at måle dna-niveauerne skal du placere objektglassene i en pipetteboks og blokere dem med 50 milliliter blokere buffer.

Inkuber rutsjebanerne på en gyngeryser ved stuetemperatur i en time. Derefter kasseres opløsningen og tilsæt 20 milliliter blokerende buffer og 33 mikroliter fluorescerende DNA intercalating farvestof. Inkuber i 15 minutter med omrøring.

Når inkubationen er overstået, skyl hurtigt rutsjebanerne med ultra rent vand og tør med trykluft. Mikroarrays er klar til at blive scannet. For at udtrykke mikroarrays, blokere dias som tidligere vist og derefter skylle dem med ultra rent vand, og tør med filtreret trykluft.

Fastgør en tætningspakning til hvert dias. Tilføj 130 milliliter in vitro transskription og oversættelse mix på dias, og forsigtigt massere forsegling pakninger, således at in vitro transskription og oversættelse mix spredes ud og dækker hele området af array uden bobler. Påfør de små runde porttætninger på begge porte.

Inkuberes i 90 minutter ved 30 grader Celsius for proteinudtryk, efterfulgt af 30 minutter ved 15 grader Celsius for immobilisering af forespørgselsproteinet. Fjern derefter pakningen, vask rutsjebanerne tre gange i fem minutter hver i 15 milliliter TBST med mælk, og bloker den samme opløsning i en time. Til påvisning af proteinerne på arrayet fjernes TBST med mælk, glider på en gitterplade og anvender 600 mikroliter af primært antistof, mus anti-flag, fortyndet en til to hundrede og 1x TBST suppleret med 5 % mælk.

Inkuber i en time ved stuetemperatur. Vask objektglassene med 50 milliliter 1x TBST og 5% mælk på den gyngende shaker tre gange i fem minutter hver. Gentag proceduren for det sekundære antistof.

Efter den ene time inkubation er overstået, vaskes rutsjebanerne med 1x TBST på den gyngende shaker tre gange i fem minutter hver. Skyl derefter hurtigt rutsjebanerne med ultra rent vand, og tør dem med presset luft. Diasene er klar til at blive scannet.

For at udføre fosfatase- og DNase-behandlingen vaskes og blokeres de udtrykte dias med TBST suppleret med 3% BSA som beskrevet i manuskriptet. Derefter placeres diasene på en gitterplade og anvende 200 mikroliter fosfatase DNase opløsning. Placer en microarray dække slip på toppen for at undgå fordampning.

Inkubere ved 30 grader Celsius i en time og 30 minutter i ovnen. Vask derefter slides med 1x TBST og 0,2 molar natriumchlorid på gyngeshasteren tre gange i fem minutter hver. For at udføre narkotikabehandling og kinase reaktion, placere dias på gitterpladen og anvende 200 mikroliter af narkotika kinase løsning.

Placer et dæksel på toppen for at undgå fordampning. Inkubere i en time ved 30 grader Celsius i ovnen. Nøglen til reproducerbare data er ensartet inkubationstid på tværs af slides.

Dette er især vigtigt under kinase reaktion. Der skal tages højde for den tid, der kræves til at behandle hvert dias. Derefter vaskes objektglas med 1x TBST og 0,2 molarnatriumchlorid på gyngeshasteren tre gange i fem minutter hver.

Gentage proteindetektion ved hjælp af primær antistofphosphotyrosinantistof fortyndet 1 til 100 i TBST, suppleret med 3% kvæg serumalbumin. Brug 1x TBST og 3% kvæg serumalbumin til vask efter inkubationen med primært antistof og TBST til vask efter inkubationer med sekundært antistof. Vask og tør som tidligere.

Ved erhvervelse af billeder skal du indlæse mikroarrays i diasholdermagasinet. Læg magasinet i mikroarray-scanneren. Scan alle microarrays med de optimerede indstillinger, og husk at slå automatisk forstærkning fra, når du sammenligner billeder på tværs af eksperimenter.

Overfør billederne til en kvantificeringssoftware, juster gitteret med pletterne, og kvantificer signalintensiteten for hver funktion på mikroarray. Fortsæt med statistisk analyse. I denne undersøgelse viste mikroarray de fleste pletter, der indeholder supplerende DNA med succes vist påviselige niveauer af protein.

NAPPA kinase microarrays viste god reproducerbarhed blandt dias, med korrelationen af proteindisplayet blandt forskellige trykpartier, der var højere end 0,88. Repræsentative resultater af kinase aktivitet i NAPPA kinase arrays viste høje niveauer af protein fosforylering efter udtryk. Sammenligningen mellem mikroarrays, hvor fosforyleringsniveauerne blev målt lige efter fosfatasebehandling, og efter 60 minutters autophosphorylation reaktion, tyder på tilstedeværelsen af aktive protein kinaser på array.

På NAPPA kinase arrays, viste imatinib en betydelig reduktion i ABL1 og BCR-ABL1 aktivitet, mens andre kinaser forblev for det meste upåvirket. Kinaseaktiviteten normaliseredes mod det dephosphorylated array og repræsenterede som en procentdel af den positive kontrol mikroarray viste selektiv hæmning af imatinib mod ABL1 og BCR-ABL1. Typiske resultater opnået for ibrutinib screening viste kinase aktivitet ABL1 ikke-relevante kinase er upåvirket.

BTK kanoniske mål, og ERBB4 potentielle nye mål, Viste reduceret aktivitet i nærvær af ibrutinib. Dataene tyder på, at ERBB4 kan hæmmes af ibrutinib på en dosisspecifik måde. Succesen med protein microarray screeninger er meget afhængig af kvaliteten af microarray selv.

Der bør anvendes flere positive og negative kontrolfunktioner for at muliggøre korrekt dataanalyse. NAPPA kinase assay er en screening platform, og som sådan, de opnåede data bør valideres i opfølgende analyser, som kan omfatte in vitro kinase assays, eller cellebaserede analyser. Da vores protokol starter med cDNA, kan enhver kinase mutation eller variation let indarbejdes i mikroarray og studeres i høj gennemløb.

Under fremstillingen af anionbytteren harpiks gylle og plader, anbefales det at bruge masker for at forhindre eventuel indånding af harpiks partikler.

X

Simple Hit Counter