Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка
Chapters
Summary October 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Представлен подробный протокол для генерации самособранных человеческих белковых микроаррей для скрининга ингибиторов киназы.
Transcript
NAPPA является мощной белковой микроаррейской платформой, которая может быть использована для изучения белковой активности и функции в объективно высокой пропускной способности. Белки, отображаемые на NAPPA производятся в человеческой системе выражения с использованием человеческих рибосом и сопровождающихся для того, чтобы улучшить вероятность естественного складывания и активности. Использование массивов NAPPA для скрининга ингибиторов киназы обеспечивает новую платформу для тестирования новых препаратов и клинически значимых мутаций киназы.
Белковые микроаррейы, генерируемые методологией NAPPA, могут использоваться для многих различных применений, включая открытие биомаркеров, взаимодействие белкового белка, идентификацию субстрата и скрининг лекарств. Выполните шаги по контролю качества на этом пути. Проверьте качество подготовки ДНК, микросхемы ДНК и белковый микроаррей.
Если в какой-либо шаг качество не хорошо, просто начните все сначала. Демонстрацией процедуры будет Лиза Миллер, техник в моей лаборатории. Для подготовки бактериального роста в доме высокой пропускной способности мини-подготовки, сначала привить бактерии в овсяной пластины в формате 96 хорошо, и пусть он растет в течение 16 часов.
На следующий день заполните каждый колодец глубокой пластины хорошо с 1,5 миллилитров потрясающий бульон среды, дополненный антителом ампициллина. Антитела зависят от маркера отбора на плазмиду. Затем стерилизовать 96-контактное устройство с 80%этанолом и пламенем.
Используйте стерильное 96-контактное устройство, чтобы выбрать колонии из ночной инкубированной агарной пластины и погрузиться в колодцы глубокой пластины колодца, чтобы привить культуру. Накройте блок газовым уплотнением и инкубировать на шейкере в течение 22-24 часов при 37 градусах Цельсия и от 300 до 800 об/мин. После этого, гранулы культур и resuspend культур в соответствии с рукописью.
Lyse бактерий, добавив 200 микролитров раствора два в каждой хорошо, печать пластины с алюминиевым уплотнением, и инвертировать пять раз. Инкубировать клетки ровно пять минут. Чтобы нейтрализовать раствор, добавьте 200 микролитров раствора три, запечатайте пластину алюминиевым уплотнением и инвертировать пять раз.
Затем, спина пластины на 3800 G, четыре градуса по Цельсию, в течение 30 минут, чтобы очистить лизировать супернатант. Для приготовления анионные пластины смолы обмена, во-первых, смешать анион обмена суспензии, и залить шлам в стеклянное корыто. Стек фильтр пластины на вершине глубокой пластины хорошо выступать в качестве сосуда сбора отходов.
Затем, используя широкую доску P1000 советы, смешать суспензию, и передачи 450 микролитров суспензии в каждый колодец фильтра пластин. Центрифуга и отбросить поток через. Теперь перенесите лизаторные супернатанты в стопку смоляной пластины и глубоко хорошо блок.
Спин сложенные пластины в течение пяти минут в 30 раз G с медленным наращивать скорость и отказаться от потока через. Чтобы вымыть столбец, добавьте 400 микролитров буфера для мытья раствора N3 к каждой колодец. Перенесите пластину смолы в вакуумный многообразный, чтобы удалить буфер стирки.
Повторите шаг стирки три раза, а затем удалить все оставшиеся шайбы буфера с кратким пять минут спина в 30 раз G.To elute ДНК, поместите пластины смолы на чистую пластину сбора 800 микролитров. Добавьте 300 микролитров раствора N5 к каждому хорошо и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение десяти минут. Затем, спина сложены пластины в течение пяти минут в 20 раз G с медленным наращивать скорость до 233 раз G в течение одной минуты.
Храните пластины при отрицательном 20 градусов по Цельсию перед использованием. Во-первых, поместите горки на стойку и погрузите горки в стеклянный резервуар, содержащий раствор покрытия 2%аминосилановый реагент в ацетоне. Рок слайды в течение 15 минут.
Затем, промыть слайды в ацетоне следуют окончательное полоскания в воде. Затем высушите горки под давлением воздуха. Дует на них со всех сторон в течение примерно трех минут, пока все капли воды были удалены.
Храните покрытые слайды при комнатной температуре на металлической стойке внутри плотно запечатанной коробки. Теперь приступить к осадок ДНК, как описано в рукописи. Затем повторно посовестите гранулы ДНК в 20 микролитров ультрачистой воды и встряхните при 1000 об/мин в течение двух часов.
Чтобы подготовить образец массива, добавьте 10 микролитров свежеприготовленной печатной смеси, которая содержит антитела, кросслинкер и полилин к каждому образцу ДНК. Уплотнение пластин с алюминиевой фольгой и встряхнуть при комнатной температуре в течение 90 минут при 1000 об/мин. Храните тарелки на ночь при четырех градусах по Цельсию.
В день печати, кратко вихрь и спина пластин. Перенесите 28 микролитров каждого образца на пластину из 384 колодец. Поместите аминосилан покрытием слайды и 384 хорошо пластины, на палубе массивера, и начать программу микроаррей печати.
Когда печать будет сделана, этикетка microarrays. Микроаррей можно хранить в течение нескольких месяцев до дальнейшего использования. Чтобы измерить уровни ДНК, поместите слайды в коробку пипетки и заблокируете их 50 миллилитров блокирующего буфера.
Инкубировать горки на качалке при комнатной температуре в течение одного часа. Затем отбросьте раствор и добавьте 20 миллилитров блокирующего буфера и 33 микролитров флуоресцентного ДНК, интеркалирующего красителя. Инкубировать в течение 15 минут с волнением.
После окончания инкубации быстро промойте горки ультрачистой водой и высушите под давлением воздуха. Микроаррейцы готовы к сканированию. Чтобы выразить microarrays, блокировать слайды, как показано ранее, а затем промыть их ультра чистой водой, и сухой с фильтрованным сжатым воздухом.
Прикрепите герметивную прокладку к каждому слайду. Добавьте 130 миллилитров транскрипции in vitro и перевод смеси на слайды, и осторожно массируйте герметильные прокладки так, чтобы смесь транскрипции и перевода in vitro раскладывания и охватывает всю площадь массива без пузырьков. Нанесите небольшие круглые портовые пломбы на оба порта.
Инкубировать в течение 90 минут при 30 градусах Цельсия для экспрессии белка, а затем 30 минут при 15 градусах по Цельсию для иммобилизации белка запроса. Затем снимите прокладку, промыть горки три раза в течение пяти минут каждый в 15 миллилитров TBST с молоком, и блок в том же растворе в течение одного часа. Для обнаружения белков на массиве удалите TBST с молоком, поместите слайды на сетчатую пластину и нанесите 600 микролитров первичных антител, мышь анти-флаг, разбавленные от одной до двухсот, и 1x TBST дополнены 5%молока.
Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Вымойте горки с 50 миллилитров 1x TBST и 5%молока на качалке три раза в течение пяти минут каждый. Повторите процедуру вторичного антитела.
После того, как один час инкубации закончилась, мыть слайды с 1x TBST на качалке три раза в течение пяти минут каждый. Затем быстро промыть горки с ультра чистой водой, и сухой с помощью воздуха под давлением. Слайды готовы к сканированию.
Для лечения фосфатазы и DNase, мыть и блокировать выраженные слайды с TBST дополнены 3%BSA, как описано в рукописи. Затем поместите слайды на сетчатую пластину и нанесите 200 микролитров раствора фосфатазы DNase. Поместите крышку microarray скольжения на вершине, чтобы избежать испарения.
Инкубировать при температуре 30 градусов по Цельсию в течение одного часа и 30 минут в духовке. Затем вымойте горки с 1x TBST и 0,2 молярного хлорида натрия на качалке три раза в течение пяти минут каждый. Для лечения препарата и киназы реакции, поместите слайды на сетке пластины и применить 200 микролитров раствора киназы препарата.
Поместите крышку скольжения на вершине, чтобы избежать испарения. Инкубировать в течение одного часа при температуре 30 градусов по Цельсию в духовке. Ключом к воспроизводимым данным является согласованное время инкубации на слайдах.
Это особенно важно во время реакции киназы. Необходимо учитывать время, необходимое для обработки каждого слайда. После этого, мыть слайды с 1x TBST и 0,2 молярного хлорида натрия на качалке три раза в течение пяти минут каждый.
Повторите обнаружение белка, используя в качестве основного антитела фосфотирозин антитела разбавленной от одного до 100 в TBST, дополненный 3%бычьего альбумин сыворотки. Используйте 1x TBST и 3%бычий альбумин сыворотки для мытья после инкубации с первичными антителами, и TBST для мытья после инкубации со вторичными антителами. Вымойте и высушите, как и раньше.
Для получения изображения загрузите микроаррей в журнал держателей слайдов. Загрузите журнал в микроаррей сканер. Сканирование всех микроаррей с оптимизированными настройками и не забудьте выключить автоматическое увеличение при сравнении изображений между экспериментами.
Перенесите изображения в программное обеспечение количественной оценки, выровнять сетку с пятнами и количественно оценить интенсивность сигнала каждой функции на микроармей. Продолжить статистический анализ. В этом исследовании, microarray показал большинство пятен, содержащих комплементарную ДНК успешно отображается обнаруживаемых уровней белка.
МИКРОаррейы NAPPA kinase показали хорошую воспроизводимость среди слайдов, при этом корреляция уровней белкового дисплея среди различных печатных партий выше 0,88. Репрезентативные результаты активности киназы в массивах киназы NAPPA показали высокий уровень фосфорилирования белка после экспрессии. Сравнение микроаррей, в которых уровни фосфорилирования измерялись сразу после лечения фосфатазы, и после 60 минут реакции аутофосфорилирования, свидетельствует о наличии активных белковых киназы на массиве.
На массивах NAPPA киназы, imatinib показал значительное снижение активности ABL1 и BCR-ABL1, в то время как другие киназы остались в основном без изменений. Активность киназы нормализовалась против дефофорилированного массива и представлена в процентах от микроаррей положительного контроля, что показало селективное ингибирование иматиниба в направлении ABL1 и BCR-ABL1. Типичные результаты, полученные для скрининга ибрутиниба, показали, что киназная активность не соответствующей киназы ABL1 не влияет.
Каноническая цель БТК и потенциальная новая цель ERBB4 показали снижение активности в присутствии ибрутиниба. Данные показывают, ERBB4 может быть ингибируется ибрутиниб в дозе конкретных моды. Успех белковых микроаррейных скринингов сильно зависит от качества самого микроаррея.
Для надлежащего анализа данных следует использовать несколько положительных и отрицательных функций контроля. Анализ NAPPA kinase является скрининговой платформой, и поэтому полученные данные должны быть проверены в последующих анализах, которые могут включать анализы in vitro kinase или анализы на основе клеток. Так как наш протокол начинается с cDNA, любая мутация киназы или вариации могут быть легко включены в микроаррей и изучены в высокой пропускной способности.
Во время подготовки анионные смолы суспензии и пластин рекомендуется использовать маски для предотвращения возможного вдыхания частиц смолы.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
