Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser
Chapters
Summary October 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Ett detaljerat protokoll för generering av självmonterade humana proteinmikromatriser för screening av kinashämmare presenteras.
Transcript
NAPPA är en kraftfull proteinmikrobarrayplattform som kan användas för studier av proteinaktivitet och funktion på ett opartiskt högt genomströmningssätt. De proteiner som visas på NAPPA produceras i ett människobaserat uttryckssystem med hjälp av mänskliga härledda ribosomer och förkläde för att förbättra sannolikheten för naturlig vikning och aktivitet. Användningen av NAPPA arrayer för screening av kinashämmare ger en ny plattform för test av nya läkemedel och kliniskt relevanta kinasmutationer.
Proteinmikarrayer som genereras av NAPPA-metodik kan användas för många olika tillämpningar, inklusive biomarkörupptäckt, proteinproteininteraktioner, substratidentifiering och läkemedelsscreening. Utför kvalitetsstyrningssteg längs vägen. Testa kvaliteten på din DNA-beredning, DNA-microarray, och proteinet microarray.
Om i något steg kvaliteten inte är bra, bara börja om. Demonstrerar proceduren blir Lisa Miller, en tekniker i mitt laboratorium. För att förbereda bakterietillväxt för i huset hög genomströmning mini-prep, först inokulera bakterierna i skruvskivan i en 96 väl format, och låt den växa i 16 timmar.
Nästa dag, fyll varje brunn av den djupa brunnen plattan med 1,5 milliliter av fantastisk buljong medium, kompletterad med antikropp ampicillin. Antikroppen beror på markeringsmarkören på plasmiden. Sedan, sterilisera en 96-pin enhet med 80%etanol och flamma.
Använd den sterila 96-stiftsenheten för att plocka kolonier från natten inkuberade agarplattan och dränka i brunnarna på den djupa brunnsplattan för att inokulera kulturen. Täck blocket med en gaspermeabel tätning och inkubera på en skakmaskin i 22 till 24 timmar vid 37 grader Celsius, och 300 till 800 rpm. Därefter, pelletskulturer och återanvänder kulturerna enligt manuskriptet.
Lyse bakterier genom att lägga till 200 mikroliter lösning två i varje brunn, försegla plattan med en aluminium tätning, och invertera fem gånger. Inkubera cellerna i exakt fem minuter. För att neutralisera lösningen, tillsätt 200 mikroliter av lösning tre, försegla plattan med en aluminiumtätning, och invertera fem gånger.
Sedan snurra plattan på 3800 G, fyra grader Celsius, i 30 minuter för att rensa lysate supernatant. För att förbereda anjonutbyte harts plattor, först, blanda anjon utbytesslam, och häll uppslamning i ett glas tråg. Stapla filterplattor ovanpå en djup brunnsplatta för att fungera som ett avfallskärl för insamling av avfall.
Sedan, med hjälp av bred styrelse P1000 tips, blanda uppslamning, och överföra 450 mikroliter av uppslamning i varje brunn av filterplattorna. Centrifugera och kassera genomflödet. Nu, överföra lysate supernatanter till stapeln av harts plattan och djupa väl block.
Snurra de staplade plattorna i fem minuter vid 30 gånger G med långsammaste ramp upp hastighet och kasta genomflödet. För att tvätta kolonnen, tillsätt 400 mikroliter av lösning N3 tvätt buffert till varje brunn. Överför hartsplattan till vakuumgrenrör för att avlägsna tvättbufferten.
Upprepa tvättsteget tre gånger och ta sedan bort eventuell återstående brickbuffert med en kort fem minuters spinn på 30 gånger G.To elute DNA, placera hartsplattan på en ren 800 microliter uppsamlingsplatta. Tillsätt 300 mikroliter lösning N5 till varje brunn och låt den sitta i rumstemperatur i tio minuter. Snurra sedan de staplade plattorna i fem minuter vid 20 gånger G med långsam ramp upp hastighet till 233 gånger G i en minut.
Förvara plattor vid negativ 20 grader Celsius före användning. Placera först objektglasen på ett rack och dränka objektglasen i glasbehållare som innehåller beläggningslösningen på 2%aminosilanereagens i aceton. Rocka diabilderna i 15 minuter.
Skölj sedan diabilderna i aceton följt av en sista sköljning i vatten. Torka därefter glidglasen med hjälp av pressad luft. Blåser på dem från alla vinklar i cirka tre minuter tills alla vattendroppar har tagits bort.
Förvara de belagda rutschkanorna i rumstemperatur på ett metallställ inuti en tätt förseglad låda. Nu, fortsätt att fälla ut DNA som beskrivs i manuskriptet. Sedan, resuspend DNA pelleten i 20 mikroliter av ultrarent vatten och skaka på 1000 rpm i två timmar.
För att förbereda matrisprov, tillsätt 10 mikroliter av nyberedda utskrift mix som innehåller antikroppen, crosslinker och polylysin till varje DNA-prov. Tätningsplattor med aluminiumfolie och skaka i rumstemperatur i 90 minuter vid 1000 rpm. Förvara plattorna över natten vid fyra grader Celsius.
På tryckdagen, kort virvel och snurra plattorna. Överför 28 mikroliter av varje prov till en 384 brunnsplatta. Placera aminosilanbelagda diabilder och 384 väl plattan, på matriser däck, och starta microarray utskriftsprogrammet.
När utskriften är klar, märka mikroarrayerna. Mikroarrayerna kan förvaras i månader tills vidare används. För att mäta dna-nivåerna, placera bilderna i en pipettlåda och blockera dem med 50 milliliter blockeringsbuffert.
Inkubera rutschkanorna på en gungande skakmaskin i rumstemperatur i en timme. Sedan, kasta lösningen och tillsätt 20 milliliter blockering buffert och 33 mikroliter av fluorescerande DNA intercalating färgämne. Inkubera i 15 minuter med agitation.
Efter inkubationen är över, skölj snabbt diabilderna med ultra rent vatten och torka med pressad luft. Mikroarrayerna är redo att skannas. För att uttrycka mikroarrayerna, blockera rutschbanorna som tidigare visats och skölj dem sedan med ultra rent vatten, och torka med filtrerad tryckluft.
Fäst en tätningspackning på varje objektglas. Tillsätt 130 milliliter in vitro-transkription och översättningsmix på rutschkanorna, och massera försiktigt in tätningspackningarna så att in vitro-transkriptionen och översättningsmixen breder ut sig och täcker hela området av matrisen utan några bubblor. Applicera de små runda porttätningar på båda portarna.
Inkubera i 90 minuter vid 30 grader Celsius för proteinuttryck, följt av 30 minuter vid 15 grader Celsius för immobilisering av frågeproteinet. Ta sedan bort packningen, tvätta diabilderna tre gånger i fem minuter vardera i 15 milliliter TBST med mjölk och blockera i samma lösning i en timme. För detektion av proteinerna på matrisen, ta bort TBST med mjölk, placera bilderna på en gallerplatta och applicera 600 mikroliter av primär antikropp, musanti-Flag, utspädd en till tvåhundra och 1x TBST kompletterad med 5%mjölk.
Inkubera i en timme i rumstemperatur. Tvätta diabilderna med 50 milliliter 1x TBST och 5 %mjölk på gungshakaren tre gånger i fem minuter vardera. Upprepa proceduren för den sekundära antikroppen.
Efter att inkubationen på en timme är över, tvätta objektglasen med 1x TBST på den gungande skakren tre gånger i fem minuter vardera. Sedan, skölj snabbt diabilderna med ultra rent vatten, och torka med hjälp av pressad luft. Bilderna är redo att skannas.
För att utföra fosfatas- och DNase-behandlingen, tvätta och blockera de uttryckta objektglasen med TBST kompletterat med 3%BSA enligt beskrivningen i manuskriptet. Sedan, placera bilderna på en gallerplatta och applicera 200 mikroliter av fosfatas DNase lösning. Placera en microarray täcka slip på toppen för att undvika avdunstning.
Inkubera vid 30 grader Celsius i en timme och 30 minuter i ugnen. Tvätta sedan diabilder med 1x TBST och 0,2 molar natriumklorid på gungande shaker tre gånger i fem minuter vardera. För att utföra läkemedelsbehandling och kinasreaktion, placera bilderna på gallerplattan och applicera 200 mikroliter av läkemedelskinnslösning.
Placera en täckslir på toppen för att undvika avdunstning. Inkubera i en timme vid 30 grader Celsius i ugnen. Nyckeln till reproducerbara data är konsekvent inkubationstid över diabilder.
Detta särskilt viktigt under kinasreaktionen. Den tid som krävs för att bearbeta varje bild ska redovisas. Därefter tvättar du diabilder med 1x TBST och 0,2 molarnatriumklorid på gungshakaren tre gånger i fem minuter vardera.
Upprepa protein detektion med användning som primär antikropp fosfotyrosin antikropp utspädd en till 100 i TBST, kompletterad med 3%bovint serum albumin. Använd 1x TBST och 3%bovint serumalbumin för tvättning efter inkubationen med primär antikropp, och TBST för tvättar efter inkubationer med sekundär antikropp. Tvätta och torka som tidigare.
För bildanskaffning, ladda mikroarrayerna i bildhållarens magasin. Ladda in magasinet i mikroarrayskannern. Skanna alla mikroarrayer med de optimerade inställningarna och kom ihåg att stänga av auto gain vid jämförelse av bilder över experiment.
Överför bilderna till en kvantifieringsprogramvara, anpassa rutnätet efter fläckarna och kvantifiera signalintensiteten för varje funktion på mikroarrayen. Fortsätt med statistisk analys. I denna studie visade microarray majoriteten av fläckar som innehåller kompletterande DNA framgångsrikt visat påvisbara nivåer av protein.
NAPPA kinase microarrays visade god reproducerbarhet bland diabilder, med sambandet mellan nivåerna av protein display bland distinkta utskrift partier högre än 0,88. Representativa resultat av Kinas verksamhet i NAPPA kinase arrayer visade höga nivåer av protein fosforylering efter uttryck. Jämförelsen mellan mikroarrayer där fosforyleringsnivåerna mättes direkt efter fosfatasbehandling, och efter 60 minuters autofosforyleringsreaktion, tyder på närvaron av aktiva proteinkinaser på matrisen.
På NAPPA kinase arrayer visade imatinib en betydande minskning av ABL1 och BCR-ABL1 verksamhet, medan andra kinases förblev mestadels opåverkade. Kinasen verksamhet normaliseras mot dephosphorylated array och representerade som en procentandel av den positiva kontroll microarray visade selektiv hämning av imatinib mot ABL1 och BCR-ABL1. Typiska resultat som erhållits för ibrutinib screening visade kinas aktivitet ABL1 icke-relevanta kinas är opåverkad.
BTK kanoniskt mål, och ERBB4 potentiella nya mål, Visade minskad aktivitet i närvaro av ibrutinib. Uppgifterna tyder erbb4 kan hämmas av ibrutinib i en dos-specifikt sätt. Framgången för proteinmikroarray screenings är mycket beroende av kvaliteten på microarray själv.
Flera positiva och negativa kontrollfunktioner bör användas för att tillåta korrekt dataanalys. NAPPA-kinasetavsägning är en screeningplattform, och som sådan ska de data som erhålls valideras i followup-analyser, som kan omfatta in vitro-kinasanalyser, eller cellbaserade analyser. Eftersom vårt protokoll börjar med cDNA, kan någon Kinasmutation eller variation enkelt införlivas i mikroarrayen och studeras i hög genomströmning.
Under framställningen av anjonbytarns kådaslam och plattor rekommenderas användning av masker för att förhindra eventuell inandning av hartspartiklarna.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
