Neuroscience
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Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées
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Summary August 2nd, 2019
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Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.
Transcript
Les réponses cellulaires aux stimuli externes reposent fortement sur l’ensemble des protéines qui sont exprimées à la surface de la cellule à un moment donné. Par conséquent, le nombre, la localisation sous-cellulaire et la composition sous-unique de ces protéines sont contrôlés dynamiquement. Ici, nous utiliserons une approche d’alimentation anticorps pour quantifier le niveau de récepteurs exprimés en surface dans les cultures cellulaires, tant que l’internalisation et le recyclage reprendront.
Il s’agit d’un protocole très polyvalent, qui fournit des informations mécanistes de la régulation des protéines exprimées en surface. Dans notre exemple, nous étudierons les récepteurs de glutamine dans les neurones hippocampaux primaires. Ce protocole peut être adapté à toute protéine possédant un épitope extracellulaire angénique, si les anticorps ne sont pas disponibles, la transvection des constructions marquées peut être utile à la fois pour l’étiquetage et l’étude de mutations spécifiques.
Dans nos exemples, nous utilisons des anticorps contre glua1 endogène, et marqué Glu12 B.To commencer cette procédure, transférer le côté de la cellule de glissements de couverture jusqu’à un plateau couvert de film de paraffine, pour sauver les reagents, et faciliter la manipulation. Économisez et maintenez les supports conditionnés à 37 degrés Celsius pour les étapes d’incubation et de lavage. Incuber les cellules avec des anticorps primaires dilués dans des supports conditionnés, à température ambiante, pendant 15 minutes.
Après cela, utilisez une pipette sous vide pour aspirer soigneusement l’anticorps contenant des supports, et laver les cellules trois fois avec des supports conditionnés. Si l’étude de l’expression des récepteurs de surface par rapport aux récepteurs intracellulaires fixe les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme décrit dans le protocole de texte. Maintenir les cellules dans des supports conditionnés sans anticorps, et les retourner à l’incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre l’internalisation.
Si vous étudiez le processus d’internalisation, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme indiqué dans le protocole de texte. Pour bloquer les épitopes de l’anticorps primaire attaché à la surface des récepteurs exprimés qui n’ont pas été intériorisés, incubez des cellules avec des fragments d’anticorps Fab anti-IgG non poursuivis dilués dans des supports conditionnés, pendant 20 minutes à température ambiante. Après cela, laver les cellules trois fois avec des supports conditionnés.
Incuber les puits lavés avec des supports conditionnés contenant 80 micromolaires Dynasore, à 37 degrés Celsius, pour permettre le recyclage des récepteurs intériorisés. Après avoir terminé les modifications sur les cellules vivantes, laver les cellules une fois avec PBS plus. Ajoutez une solution de 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose en PBS aux cellules, et incubez dans un capot de fumée à température ambiante pendant sept à huit minutes, pour fixer les cellules.
Lavez ensuite les cellules trois fois avec du PBS régulier. Ajoutez une solution de sérum de chèvre normal de 10% dans PBS aux cellules, et incubez à température ambiante pendant 30 minutes, pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3%NGS dans PBS à température ambiante pendant une heure, pour étiqueter les récepteurs primaires d’étiquette d’anticorps.
Après cela, laver les cellules trois fois avec PBS. Pour commencer à étiqueter les récepteurs intracellulaires, ajoutez une solution de 0,25% TritonX dans PBS, et incubez à température ambiante pendant cinq à 10 minutes, pour perméabiliser les cellules. Ensuite, bloquer avec 10%NGS à température ambiante pendant 30 minutes.
Si vous étudiez la surface par rapport au total, incubez les cellules avec le même anticorps primaire utilisé précédemment, dilué avec 3% de NGS dans PBS, à température ambiante pendant une heure, pour étiqueter les récepteurs intracellulaires. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS. Étiquette avec deuxième anticorps secondaire marqué fluorescent, dilué en 3% NGS en PBS, à température ambiante pendant une heure.
Après cela laver les cellules trois fois avec PBS. Placez d’abord doucement les glissements de couverture, côté cellule vers le bas, sur 12 à 15 microlitres du support de montage approprié pour monter les cellules. Puis imagez les cellules sur le microscope confocal approprié, et analysez les cellules telles que décrites dans le protocole de texte.
Ce protocole d’étude du trafic des récepteurs du glutamate est basé sur l’étiquetage différentiel des récepteurs, exprimés à la surface des cellules, et ceux exprimés dans les membranes internes. Après l’acquisition d’images confoccales, le signal fluorescent peut être facilement quantifié pour montrer une augmentation de l’expression de surface, par rapport à la population intracellulaire, suivant le LTP chimique. Aucun signal pour PSD-95 ne peut être obtenu dans les cellules non permeabilized, démontrant l’intégrité de la membrane de plasma.
Cela indique que le signal obtenu pour la surface GluA1 correspond en effet aux récepteurs exprimés en surface. Fait important, un signal minimal pour le GluA1 intériorisé peut être observé dans des conditions de non-perméabilisation, montrant que tous les épitopes de surface sont occupés par la ronde initiale de l’étiquetage des anticorps. Les récepteurs intériorisés sont ensuite identifiés.
Cet exemple souligne que la phosphorylation GluN2B à S1480 favorise l’internalisation des récepteurs. Comme le mutant phosphomimétique S1480E affichait un ratio d’internalisation beaucoup plus élevé par rapport aux récepteurs de type sauvage. Comme prévu, aucun signal n’est obtenu pour les récepteurs intériorisés dans le contrôle.
Ensuite, des récepteurs recyclés et des récepteurs intériorisés sont identifiés. Le rapport de recyclage généré montre que GluN2B S1480E n’a aucun effet sur le recyclage NMDAR. Dans le contrôle, un signal fort peut être observé pour la surface exprimée GluN2B en l’absence de blocage Fab.
Ce signal disparaît dans les cultures traitées par Fab, ce qui démontre que le protocole de blocage est suffisant pour bloquer complètement les épitopes exprimés en surface, et que les signaux de surface observés après recyclage correspondent en effet à des récepteurs trafiqués vers la membrane plasmatique. Le protocole actuel n’est qu’une des méthodes disponibles pour étudier la régulation des protéines exprimées en surface. D’autres approches peuvent être adoptées pour élargir ou vérifier les données obtenues ici.
Il s’agit notamment de méthodes biochimiques, comme la biotinylation, les techniques d’imagerie de la vie, ou des approches fonctionnelles, comme l’électrophysiologie ou l’imagerie calcique. Nous utilisons pfa pour geler la localisation des récepteurs, mais PFA est un carcinogène connu, il est donc crucial d’effectuer des étapes en utilisant PFA sous un capot de fumée, tout en portant PPE approprié.
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